가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

이 절차의 전반적인 목표는 표적 약물 전달을 위해 약물이 로드된 이황화 가교 미셀을 합성하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 방법은 나노 의학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 안정적인 나노 제형을 효과적으로 생산하는 방법.

이 기술의 가장 큰 장점은 이황화 가교 미셀을 대규모로 쉽게 합성할 수 있다는 것이며, 이는 환자를 대상으로 한 임상 연구에 매우 바람직합니다. 이 절차를 시작하려면 둥근 바닥 플라스크에 2g의 모노메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜 모노아민을 추가합니다. 무수 DMF 10ml를 첨가하여 용해시킵니다.

얼음에 식히십시오. 둥근 바닥 플라스크에 당량의 하이드록시 벤조트리아졸 3개, DIC 당량의 3개, di-eth-moc 보호 라이신 3당량을 추가합니다. 다음으로, 10ml의 무수 DMF를 추가합니다.

마그네틱 교반 플레이트에서 혼합물을 20분 동안 저어줍니다. 그런 다음 혼합물을 모노 메틸 말단 폴리에틸렌 글리콜을 함유 한 둥근 바닥 플라스크에 첨가합니다. 얼음 수조에서 둥근 바닥 플라스크를 제거한 다음 실온에서 밤새 저어줍니다.

교반이 완료되면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 반응이 완료되었는지 확인합니다. 반응 플라스크에 200ml의 얼음처럼 차가운 에테르를 추가합니다. 6, 000 x g에 분리기 4 섭씨 온도에 6 분 동안 침전된 중합체를 분리하기 위하여.

침전 및 원심분리 과정을 두 번 반복하고 매번 침전 전에 10ml의 DMF에 생성물을 재용해합니다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 에테르로 폴리머를 세 번 씻습니다. 튜브를 고진공 소스에 연결하여 잔류 에테르를 제거합니다.

그 후 DMF에 20 밀리리터의 20 % 4- 메틸 피페리딘을 폴리머에 첨가하십시오. 용해가 완료될 때까지 저어줍니다. 3시간 동안 재미에 대한 반응을 허용하십시오.

반응의 완료를 확인한 후, 고분자 생성물을 건조시킨다. 이제 진공 상태에서 2번 고분자 중간체를 만든 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 고분자 합성 단계를 수행합니다. 고분자 중간 번호 10이 생성되면 이를 반응 플라스크로 옮깁니다.

30ml의 무수 DMF를 추가합니다. 새 플라스크에 24 상당의 활성 콜산을 20 밀리리터의 DMF에 용해시킵니다. 그런 다음 N, N-Diisopropylethylamine의 48 당량을 추가합니다.

10분 동안 저어줍니다. 교반이 완료된 후, 혼합물을 중합체 중간수 10을 함유하는 반응 플라스크로 옮깁니다. 반응이 밤새 실행되도록 합니다.

다음날 반응의 완료를 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고분자 중간 번호 11을 침전시킵니다. 그런 다음 탈이온수에서 폴리머 중간체를 다이얼화합니다. 샘플을 동결 건조하여 백색 분말을 생성합니다.

미셀을 준비한 후 텔로덴드리머 20mg과 PTX 5mg을 클로로포름 1ml에 녹입니다. 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거하여 균일한 건조 폴리머 필름을 얻습니다. 볼텍싱(vortexing)을 통해 1밀리리터의 PBS로 필름을 재구성합니다.

그런 다음 40 킬로 헤르츠에서 30 분 동안 초음파 처리합니다. 텔로덴드리머에 티올 그룹을 산화시키기 위해 3%과산화수소를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추가 준비 및 확인 단계를 수행합니다.

미셀 준비가 완료된 후 동적 광 산란 장비로 미셀의 크기와 크기 분포를 측정합니다. 실온에서 측정을 수행하고 미셀 농도를 밀리리터당 1밀리그램으로 유지합니다. 다음으로 PBS에서 도데실황산나트륨의 밀리리터당 7.5밀리그램 원액을 준비합니다.

그런 다음 PBS에서 이황화 가교 결합 미셀의 밀리리터당 1.5mg 스톡 용액을 준비합니다. 이러한 원액을 사용하여 최종 SDS 농도가 밀리리터당 2.5mg인 혼합물을 만듭니다. 그리고 미셀 농도는 밀리리터당 1.0밀리그램입니다.

샘플을 로드하고 2분 간격으로 미셀 용액의 크기와 크기 분포를 측정합니다. 벌거벗은 쥐에게서 신선한 citrated 혈액을 모으기 후에 1개, 적혈구를 모으기 위하여 10 분 동안 000 x g에 1개의 밀리리터 혈액 표본을 원심 분리하십시오. PBS로 세 번 세척한 다음 PBS로 세포 펠릿을 최종 농도 2%로 재현탁합니다.200마이크로리터의 적혈구 현탁액을 1.0밀리리터당 밀리그램의 PTX NCM 용액과 혼합합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 적혈구 현탁액을 1.0밀리리터당 밀리그램의 PTX DCM 용액과 혼합합니다.이러한 혼합물을 인큐베이터 셰이커에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 혼합물을 3, 000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

각 샘플의 상등액 100마이크로리터를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 540나노미터에서 유리 헤모글로빈의 흡광도를 측정합니다. Ellman's Test로 측정한 바와 같이, 자유 티올 그룹에서 이황화 결합으로의 전환율은 산소 매개 산화 48시간 후 85%에 도달했습니다.

여기서, 과산화수소 매개 산화 방법이 대안적인 방법으로 채택된다. 전환율은 30분 만에 88%에 도달합니다. 이는 산소 매개 접근 방식보다 96배 빠릅니다.

이보다 효율적인 접근 방식을 사용하여 좁은 크기 분포로 27나노미터의 측정된 입자 크기로 50g 이상의 나노 입자가 생성되었습니다. PTX 로딩 디수피드 가교 미셀의 안정성은 심각한 미셀 파괴 조건에서도 조사됩니다. 미셀의 입자 크기는 시간이 지남에 따라 일정하게 유지되었으며, 이는 그대로 유지되었음을 나타냅니다.

세포 내 농도에서 GSH를 도입 한 후, 약물이 적재 된 이황화 가교 미셀의 크기는 30 분 동안 그대로 유지되다가 갑자기 1 나노 미터로 감소합니다. 이것은 이황화 결합의 임계 수가 감소한다는 것을 의미하며, 이는 미셀의 빠른 분리의 전제 조건입니다. PTX 로드된 미셀의 용혈 활성의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.

PTX NCM은 용량 의존적 적혈구 용해 수를 가지고 있습니다. 그러나 이황화 가교가 있는 PTX DCM은 관찰 가능한 용혈 활성을 나타내지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 다른 기술에서 수행 할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 이황화물 형성을 위해 동일한 양의 3% 과산화수소를 추가해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이황화 가교 미셀의 혈액 호환성을 평가하기 위해 용혈 분석을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 약물이 적재된 이황화 가교 미셀을 효과적으로 합성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이러한 화학 물질 중 일부는 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.