물 사용에 내분비 활동에 대한 선별 시판 체외 전이 활성화 생물학적 정량

이 표준화된 절차의 전반적인 목표는 상업적으로 이용 가능한 수용체 기반 세포 분석을 사용하여 물 샘플에서 내분비 활성 화학 물질을 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 수질 모니터링 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다., 예를 들어 샘플에 내분비 활성 화학 물질이 실제로 존재합니까? 이 기술의 주요 장점은 현재의 화학적 방법보다 훨씬 빠르게 내분비 활성 화합물 그룹을 분석할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 내분비 교란 화학 물질의 존재로 인해 발생하는 수질 문제를 진단하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 물의 오염 물질에 대한 통찰력을 제공하지만 침전물 및 조직과 같은 다른 환경 매트릭스에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기법을 처음 접하는 개인은 파이펫팅 기법을 사용할 때 높은 정밀도가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 분석 특정 배지 및 참조 화학 물질의 원액에서 물 샘플을 준비합니다. 장기 보관을 위해 분석 전용 배지를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 다음으로, 멸균 튜브에 있는 285마이크로리터의 분석 배지에 15마이크로리터의 적절한 참조 화학 물질 원료를 추가합니다.

위아래로 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 분석 배지에 200마이크로리터의 5%DMSO를 8개의 튜브에 추가합니다. 100마이크로리터 분취액을 튜브 1에서 튜브 2로 옮겨 3배 희석 시리즈를 시작합니다.

튜브 2에 희석된 샘플을 피펫으로 완전히 혼합합니다. 그런 다음 100마이크로리터 분취액을 튜브 2에서 튜브 3으로 옮깁니다. 각 튜브에 대해 이 과정을 계속합니다.

그런 다음 190 μl의 분석 매체에 10 μl의 DMSO를 혼합하여 용매 대조 샘플을 준비합니다. 다음으로, 4개의 새 튜브를 수집하고 레이블을 지정합니다. 첫 번째 튜브에 95마이크로리터의 분석 배지를 추가합니다.

그런 다음 물 추출물 5마이크로리터를 넣고 잘 섞습니다. 분석 배지로 50마이크로리터의 5%DMSO를 다른 3개의 튜브에 추가합니다. 그런 다음 한 튜브에서 다음 튜브로 50마이크로리터의 용액을 옮겨 2배 희석을 수행합니다.

ER 또는 GR 분열 정지 세포의 바이알을 극저온 냉동고에서 꺼내는 것으로 시작합니다. 바이알을 섭씨 37도의 수조에 넣고 2분 동안 부드럽게 저어 세포를 빠르게 해동합니다. 그런 다음 바이알에 70% 에탄올의 오염을 제거합니다.

클래스 2 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오. 무균 기술을 사용하여 바이알을 열고 세포를 10ml의 분석 배지로 옮깁니다. g을 200회 5분 동안 원심분리기합니다.

원심분리가 완료되면 멸균 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 6밀리리터의 분석 배지에 다시 현탁시킵니다. 5마이크로리터의 세포 현탁액과 5마이크로리터의 바이탈 염색 용액을 혼합합니다.

그런 다음 계수실에 부분 표본을 추가합니다. 광학 현미경 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 살아있는 세포의 수를 계산합니다. 그런 다음 세포 현탁액에서 살아있는 세포의 밀도를 추정합니다.

550의 최종 밀도를 얻기 위해, 필요한 경우 희석, 분석 배지의 밀리리터당 000 살아있는 세포. 먼저 9점 분석별 보정 곡선, QA/QC 샘플 및 각 물 추출물에 대한 다중 희석액을 포함하는 플레이트 레이아웃을 생성합니다. 90마이크로리터의 분석 배지를 복제 무세포 대조군 웰에 추가합니다.

세포 현탁액을 멸균 피펫팅 저장소에 붓습니다. 그런 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 90마이크로리터의 세포 현탁액을 다른 웰에 추가합니다. 10마이크로리터의 희석된 샘플을 적절한 웰에 추가합니다.

접시를 뚜껑으로 덮으십시오. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도의 5%C02 인큐베이터에 16시간 동안 놓습니다. 배양이 완료되면 플레이트가 실온과 평형을 이루도록 합니다.

그런 다음 직사광선이 없는 곳에서 다음 단계를 수행해야 합니다. 제조업체의 지침에 따라 6x 로딩 용액을 준비합니다. 그런 다음 각 웰에 20마이크로리터의 로딩 용액을 추가합니다.

각 웰에 10마이크로리터의 세포 생존율 시약을 추가하여 희석된 물 추출물의 세포 독성을 평가합니다. 알루미늄 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하십시오. 그런 다음 실온의 어두운 곳에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

배양이 완료되면 하단 판독 기능이 있는 마이크로플레이트 리더에 플레이트를 추가합니다. 형광을 측정하고 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 데이터를 분석합니다. 이 연구에서는 처리된 도시 폐수 폐수의 24시간 복합 샘플 4개, 남부 캘리포니아의 담수 시스템에서 얻은 지표수 샘플 6개, 초순수로 구성된 필드 블랭크를 분석했습니다.

10개의 대표적인 물 샘플 중 7개에서 ER 활동이 감지되었고, 4개의 샘플에서 GR 활동이 감지되었습니다. 에스트로겐 수용체 및 글루코코르티코이드 수용체 분석에 대한 QA/QC 성능 지침은 여기에서 확인할 수 있습니다. 세포 독성 및 시료 정밀도에 대한 연구 결과는 허용 기준 내에 잘 들어맞았으며, 이는 용수 시료 측정을 검증하는 것이었습니다.

가장 높은 생물학적 분석 등가 농도는 2차 폐수에서 발견된 반면, 3차 폐수의 GR 활성은 검출의 생물 분석 한계 미만인 것으로 밝혀졌습니다. 마찬가지로, 대부분의 지표수 샘플은 검출 한계 이상의 GR 활성을 나타내지 않았으며 2차 폐수보다 ER 활성 수준이 훨씬 낮았습니다. 대부분의 폐수 처리장 폐수 샘플은 ER 및 GR 생물 분석 모두에 대해 검출 한계를 초과하는 용량 반응을 보였습니다.

이러한 샘플의 평균 청색/녹색 형광 비율에 대한 대표적인 결과는 상대적 농축 계수에 대해 표시되며 여기에서 볼 수 있습니다. 이 기술은 적절하게 수행되면 24시간 내에 완료할 수 있습니다. 시도하는 동안 모든 QA/QC 지침을 따르는 것이 중요합니다.

이 기술은 관리자가 물 속의 내분비 교란 화학 물질을 모니터링하기 위한 대체 접근 방식을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다. 아지드화나트륨으로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 제대로 작동하는 흄 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.