개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 간단한 형광 분석
2016년 11월 21일
호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.
이 실험의 전반적인 목표는 정지 호중구를 분리하고 작용제에 대한 반응으로 DNA 방출을 측정하는 것입니다. 이 방법은 호중구 세포외 트랩 유도 또는 세포 사멸의 다양한 작용제에 대한 호중구 반응은 무엇입니까? 이 기술의 가장 큰 장점은 호중구 세포 외 트랩 형성의 다양한 작용제 및 억제제를 신속하게 스크리닝할 수 있다는 것입니다.
건강한 개 기증자의 두부 정맥에 21게이지 나비 바늘을 삽입하는 것으로 시작한 다음 3ml 주사기를 부착하고 3ml 혈액 샘플 3개를 채취한 다음 즉시 샘플을 뚜껑이 없는 EDTA 함유 혈액 튜브로 옮깁니다. 정맥 천자가 외상성이 없고 혈류가 양호한지 주의해야 하며, 채혈이 불량하면 호중구 수율이 저하됩니다. 각 튜브를 채운 후 튜브를 뒤집어 혈액과 항응고제가 적절하게 혼합되도록 합니다.
50ml 원뿔형 튜브에 혈액을 모읍니다. 샘플을 부드러운 반전으로 동일한 부피의 멸균 실온 3%Dextran 500과 혼합하고 실온에서 18-20분 동안 튜브를 똑바로 세웁니다. 그런 다음 빨대 색의 상층을 아래쪽 빨간색 층에 의해 오염되지 않고 더 이상 수집되지 않을 때까지 새 튜브로 옮깁니다.
상층을 원심분리하십시오. 상등액을 버리고 펠릿을 10ml의 멸균 실온 PBS에 수동으로 재현탁합니다. 다음으로, 10ml의 실온 디아트리조산 나트륨 세포 분리 용액에 있는 폴리수크로오스를 50ml 원추형 튜브에 추가합니다.
분리 용액 위에 세포를 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 원심분리로 세포를 분리합니다. 상부 3개의 혈장과 혈소판 단핵 세포 및 밀도 구배층을 버립니다.
남은 적혈구를 실온의 물 10ml로 용해합니다. 30초 후 10ml의 멸균 실온 1.8% 염화나트륨을 첨가하여 강장제를 복원합니다. 부드러운 반전으로 세포를 혼합합니다.
이제 원심분리로 세포를 수집합니다. 흰색 펠릿을 10ml의 멸균 PBS에 부드럽게 재현탁합니다. 계수 후, 세포를 다시 원심분리하고 멸균 실온 PBS에서 10 - 밀리리터당 6번째 세포 농도의 5배로 펠릿을 재현탁합니다.
적절한 경우, 유리 슬라이드에서 소량의 세포를 자연 건조한 다음 제조업체의 지침에 따라 신속한 고정 및 염색 키트로 염색합니다. 호중구 분리가 성공적이었다면, 핵이 형성된 세포의 최소 95%는 광학 현미경 검사에서 관찰된 바와 같이 적혈구 오염이 최소화된 과립구여야 합니다. 호중구 분리 직후 멸균 70미크론 멸균 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시키고 배양 배지가 포함된 96웰 플레이트의 테스트 웰에 4번째 세포에 5배 10을 추가하여 섭씨 39도 및 4% 이산화탄소에서 30분 동안 배양합니다.
세포가 부착되면 페놀 레드가 없는 RPMI에 대한 관심 작용제의 최종 부피 100-200 마이크로리터에 추가하고 열 비활성화 FCS를 테스트 웰에 보충하고 PBS만 포함하는 두 개의 빈 웰에 추가합니다. 그런 다음 적절한 세포 불투과성 핵산 염료를 세포에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다. 적절한 배양 기간이 끝나면 마이크로플레이트 리더에서 형광을 측정합니다.
혈소판 활성화 인자로 개 호중구를 1시간 동안 자극하면 대조군의 비자극 세포에 비해 형광이 평균 4배 증가합니다. 그러나 PMA는 활성화 2시간 전에 호중구 형광이 증가하지 않는 느린 작용제이지만 궁극적으로 시간이 지남에 따라 유사한 폴드 증가를 생성합니다. 핵산 염료 형광은 호중구 세포 외 트랩 형성에 특이적이지 않으며, 다른 메커니즘에 의한 세포 사멸이 있거나 시약이 DNA에 오염된 경우에도 발생하기 때문입니다.
예를 들어, 이 대표적인 실험에서 상업용 LPS 제제는 호중구가 없는 상태에서 매우 높은 형광을 생성했는데, 이는 아마도 박테리아 DNA의 오염으로 인한 것으로 추정됩니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 호중구를 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
세포를 와류로 돌리지 말고, 상층액을 붓지 말고 피펫으로 제거하십시오. 이 절차에 따라 면역형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 방출된 DNA가 NETosis와 관련이 있는지 확인할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 혈액학 분야의 연구자들이 응고에 방출된 DNA의 상호 작용과 환자 혈장을 포함한 새로운 NET 작용제의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 개 호중구를 분리하고 작용제에 대한 반응을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 프로토콜에서는 견혈에서 정지기 호중구를 분리하고 이들의 세포 외 트랩 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다. 호중구 세포 외 트랩(NETs)은 선천 면역 반응에서 중요한 역할을 하며 다양한 병리 현상과 연관되어 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 수의학
배경
- 호중구는 면역 반응의 핵심 요소입니다.
- NETs는 호중구에서 방출된 DNA, 히스톤 및 단백질로 구성됩니다.
- NETs는 자가면역 질환 및 혈전증과 관련이 있습니다.
- NET 형성을 이해하면 면역 반응에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
연구 목적
- 호중구를 분리하고 다양한 작용제에 반응하여 방출되는 DNA를 측정하기 위함입니다.
- NET 유도제에 대한 호중구의 반응을 조사하기 위함입니다.
- NET 형성에 영향을 미치는 작용제 및 억제제의 신속한 스크리닝을 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 21게이지 버터플라이 바늘을 사용하여 건강한 견 공여체로부터 혈액 샘플을 채취합니다.
- 호중구 분리를 위해 샘플을 EDTA가 포함된 튜브로 옮깁니다.
- 호중구 수득률을 최적화하기 위해 외상 없는 정맥 천자를 수행하도록 주의합니다.
- 튜브를 반전시켜 혈액과 항응고제가 적절히 혼합되도록 합니다.
주요 결과
- 이 방법은 호중구의 효율적인 분리를 가능하게 합니다.
- 마이크로플레이트 형광 분석법을 사용하여 NETs의 정량을 수행할 수 있습니다.
- 본 프로토콜은 다양한 자극에 대한 호중구 반응 연구를 지원합니다.
- 다양한 작용제에 반응하여 형성되는 NET의 신속한 스크리닝이 가능합니다.
결론
- 본 프로토콜은 호중구의 행동을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 이를 통해 얻은 통찰은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서의 면역 반응을 이해하는 데 기여할 수 있습니다.
- 이 기술은 수의학의 연구 및 임상 응용 분야 모두에 유용합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 형광 기반의 NET 정량 분석법을 통해 canine 모델에서 호중구 외세포 트랩 형성에 영향을 미치는 작용제와 억제제를 빠르게 스크리닝할 수 있습니다. 이 방법은 DNA 방출에 대한 정량적이고 재현 가능한 판독값을 제공함으로써 면역학 및 염증성 질환 연구의 타겟 검증을 지원합니다. 또한 자가면역, 혈전증 및 감염성 질환 모델에서 NET 매개 경로를 조사하는 전임상 프로그램의 기전적 위험 제거(de-risking)를 용이하게 합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: PMA 및 PAF와 같은 작용제에 대한 호중구 반응 조사를 가능하게 하여 표적 경로를 규명할 수 있습니다.
- 운용적 가치: 화합물 라이브러리의 신속한 스크리닝을 지원하여 NETosis 조절제를 식별할 수 있습니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 세포 투과성이 없는 핵산 염색약을 사용하여 NET 형성의 지표로서 세포 외 DNA 방출량을 정량화합니다.
- 운용적 가치: 96-웰 마이크로플레이트 리더와 호환되어 고효율의 작용제/억제제 프로파일링이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 혈전증 및 자가면역 질환에서 NET의 관여를 연구하기 위한 질환 관련 시스템을 제공함.
- 운용적 가치: 선도 물질 최적화 단계에서 예측 신뢰도를 높이기 위한 용량-반응 및 시간 경과 분석을 가능하게 함.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체에 부합하며, 전임상 단계 투자 전 면역학적 타겟의 리스크 감소를 지원합니다.
- 발견 생물학: DNA 방출 역학을 측정하여 호중구 활성화 경로와 작용제 특이성을 규명합니다.
- 스크리닝: 작용제 효능과 억제제 효율의 비교가 가능한 정량적 형광 출력값을 제공합니다.
- 분석: 화합물의 활성 순위를 매기고 생물학적 관련성을 평가하기 위해 배수 변화 데이터(예: PAF 사용 시 4배 증가)를 생성합니다.
- 중개 연구: 직교 검증과 결합하여 NET 정량화를 응고 및 염증과 같은 병태생리학적 과정과 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 여러 프로젝트에 걸쳐 면역학 및 염증성 질환 표적 검증을 위한 표준화된 재사용 가능 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 현미경 관찰로 확인 시, 일반적인 세포 독성과 구분하여 NET 특이적 신호를 분리함으로써 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운용적 가치: 저렴하고 접근 가능한 시약과 표준 실험실 장비를 사용하여 확장 가능한 구현이 가능합니다.
- 전략적 가치: 화합물이 NET 유도 병리에 미치는 영향을 조기에 평가할 수 있게 하여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 염증성 및 자가면역 질환 분야에서 리스크 조정 기반의 타겟 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 일차 세포 분리 및 무균 조직 배양 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 형광 검출 기능이 있는 마이크로플레이트 리더의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 실험 회차 간 세포 파종 밀도와 배양 조건의 표준화가 필수적입니다.
- NETosis를 다른 세포 사멸 기전과 구별하기 위해 직교 방법(예: 면역형광법)과 병행해야 합니다.
- 염료 특이성에 의해 제한되며, 괴사로 인한 세포 외 DNA나 시약 오염으로 인해 형광이 발생할 수 있습니다.
