개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

이 실험의 전반적인 목표는 정지기 호중구를 분리하고 작용제에 반응하여 방출되는 DNA를 측정하는 것입니다. 이 방법은 호중구 외세포 트랩 유도 또는 세포 사멸의 다양한 작용제에 대한 호중구의 반응은 무엇인가와 같은 면역학 및 수의학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호중구 외세포 트랩 형성의 다양한 작용제 및 억제제를 신속하게 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

건강한 개 공여견의 외정맥에 21게이지 나비바늘을 삽입한 후, 3mL 주사기를 연결하여 3mL 혈액 샘플 3개를 채취하고, 이를 즉시 캡이 없는 EDTA 함유 혈액 수집관으로 옮깁니다. 혈액 채취 상태가 좋지 않으면 호중구 수율이 낮아지므로, 정맥 천자가 외상 없이 이루어지고 혈류가 원활한지 확인하십시오. 각 튜브를 채운 후, 혈액과 항응고제가 충분히 섞이도록 튜브를 반전시킵니다.

50-milliliter 원뿔형 튜브에 혈액을 모읍니다. 멸균된 상온의 3% Dextran 500을 샘플과 동일한 부피로 넣고 부드럽게 반전시켜 혼합한 후, 튜브를 세운 상태로 상온에서 18분에서 20분 동안 둡니다. 그 다음, 하단의 붉은 층에 의해 오염되지 않는 범위 내에서 상단의 짚색 층을 새 튜브로 옮깁니다.

상층액을 원심 분리합니다. 상층액을 버리고, 펠릿을 10 milliliters의 멸균된 실온 PBS에 수동으로 재현탁합니다. 그 다음, 50-milliliter 원추형 튜브에 실온의 sodium diatrizoate 함유 polysucrose 세포 분리 용액 10 milliliters를 넣습니다.

세포를 분리 용액 위에 조심스럽게 층을 이뤄 얹습니다. 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 상단의 혈장, 혈소판 단핵구 세포 및 밀도 구배 층의 세 층을 제거합니다.

실온의 멸균수 10 milliliters를 사용하여 남은 적혈구를 용해합니다. 30초 후, 장력(tonicity)을 회복시키기 위해 실온의 멸균 1.8% sodium chloride 10 milliliters를 첨가합니다. 세포를 부드럽게 도립 혼합합니다.

이제 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 흰색 펠릿을 10 milliliters의 멸균 PBS에 넣고 부드럽게 재현탁합니다. 세포 수를 센 후, 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 상온의 멸균 PBS에 5 × 10⁶ cells/mL 농도가 되도록 재현탁합니다.

적절한 경우, 소량의 세포를 유리 슬라이드 위에 공기 건조시킨 후, 제조사의 지침에 따라 신속 고정 및 염색 키트로 염색합니다. 호중구 분리가 성공적이었다면, 광학 현미경 관찰 시 적혈구 오염이 최소화된 상태에서 유핵 세포의 최소 95%가 과립구여야 합니다. 호중구 분리 직후, 세포 현탁액을 70-micron 멸균 필터에 통과시킨 후, 39 °C 및 4% CO2 환경에서 30분 동안 배양하기 위해 배양이 포함된 96-well 플레이트의 테스트 웰에 5 × 10⁴개의 세포를 첨가합니다.

세포가 부착되면, 페놀 레드(phenol red)가 없는 RPMI에 열불활성화 FCS를 보충하고, 여기에 관심 있는 작용제(agonist)를 최종 부피 100-200 microliters가 되도록 시험 웰과 PBS만 들어 있는 두 개의 공백 웰에 각각 첨가합니다. 그다음 세포에 적절한 세포 투과 불가 핵산 염색약을 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. 적절한 배양 기간이 지난 후, 마이크로플레이트 리더로 형광을 측정합니다.

혈소판 활성 인자로 개 뉴트로필을 1시간 동안 자극하면, 자극하지 않은 대조군 세포에 비해 평균 4배의 형광 증가가 나타납니다. 반면 PMA는 더 느린 작용제로, 활성화 후 2시간 전까지는 뉴트로필 형광 증가가 나타나지 않으나, 결과적으로 시간이 지남에 따라 유사한 배수의 증가를 유도합니다. 핵산 염료 형광은 다른 메커니즘에 의한 세포 사멸이 발생하거나 시약이 DNA에 오염된 경우에도 나타나므로, 뉴트로필 외세포 트랩 형성만을 위한 특이적인 지표는 아닙니다.

예를 들어, 본 대표 실험에서 상용 LPS 제제는 호중구가 없는 상태에서도 매우 높은 형광을 나타냈으며, 이는 박테리아 DNA 오염으로 인한 것으로 추정됩니다. 숙달된 후 적절히 수행한다면, 이 기술은 약 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 시도할 때 호중구를 조심스럽게 다루는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

세포를 볼텍싱하지 말고, 상청액은 쏟아내지 말고 피펫으로 제거하십시오. 이 절차 이후에 면역형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행하여 방출된 DNA가 NETosis와 상관관계가 있음을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 혈액학 분야의 연구자들이 응고에 미치는 방출된 DNA의 상호작용과 환자 혈장을 포함한 새로운 NET 작용제의 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

이 영상을 시청한 후에는 개의 호중구를 분리하고 작용제에 대한 반응을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.