Name: 개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 간단한 형광 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 배우세요 개 호중구에서 세포 외 트랩 형성을 정량화하는 형광 분석법을. 면역학 및 수의학 연구에서 중성구 활성을 신속하게 평가하는 데 활용됩니다.

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저자는 개 호중구 프로토콜 개발에 도움을 준 James Roth, William Nauseef 및 Kayoko Kimura 박사와 Tom Skadow 박사에게 감사를 표합니다. RDG는 Wellcome Trust Fellowship 참조: WT093767MA의 지원을 받습니다.

모든 실험은 아이오와 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 윤리적 허가 하였다. 1. 혈액 컬렉션 <ol><li> 직접 항응고제로 복재, 두부 또는 경정맥에서 혈액의 9 ml의 그리기 (예를 들어, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1.8 mg의 K 2 EDTA / ml의 혈액) vacutainers, 또는 EDTA 함유 혈액 튜브에 즉시 전송 주사기로. 부드럽게 굴러 또는 혈액 항응고제의 적절한 혼합을 보장하기 위해 혈액 튜브를 반전한다. </li></ol> 2. 호중구 격리 <ol><li> 한 50㎖ 원추형 튜브에 멸균 실온 동량 혈액을 3 % 혼합하여 부드러운 반전 덱스-500 (0.9 % 멸균 식염수에 만든). 실온에서 18 ~ 20 분 동안 똑바로 서 둡니다. 그것은 더 이상 낮은 적색 층에 의해 오염없이 수집 할 수 없습니다 때까지 새로운 튜브에 밀짚 색깔의 상위 계층을 전송합니다. 일의 적혈구즉 원래 튜브는 폐기 될 수있다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에 뜨는을 원심 분리기. 오프 그리기 및 상층 액을 버린다. 수동 10 ㎖를 실온 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포 펠렛을 다시 일시. 그 텍싱이 프로토콜의 모든 단계에서 다시 일시 중지 호중구에 사용하지 않아야합니다. 수동으로하지 않고 또한 세포 수율을 극대화하기 위해 프로토콜을 통해 추천 상층 액을 붓는 것보다, 오프 그리기. </li><li> 한 50㎖ 원추형 튜브에 실온 polysucrose 나트륨 diatrizoate 세포 분리 용액 (예, Histopaque 1077) 10 ㎖를 추가한다. 조심스럽게 세포 분리 용액을 통해 셀 - 함유 용액을 층을 포함한다. 셀의 수율을 감소시킬 수 실온으로 평형화되지 않았다고하여 세포 분리 용액을 참고. </li><li> 브레이크 해제와 함께 실온에서 30 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 호중구는 그라데이션의 가장 낮은 층에있는 바와 같이, 오프 그릴과 uppe을 폐기혈장, 혈소판, 단핵 세포의 좁은 대역 흰색 및 밀도 구배 매체를 클리어 층 상층 이루어지는 R 3 층. </li><li> 나머지 적혈구를 용해시키기 위해, 실온에서 물 10ml에 호중구 펠렛을 다시 일시. </li><li> 30 초 후, 멸균 실온 1.8 % 염화 나트륨 10 ㎖를 첨가하여 긴장성 복원하고 온화한 역전에 의해 혼합한다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상층 액을 그려 버린다. </li><li> 펠렛 여전히 적색 인 경우, 용해하는 단계를 반복한다. 펠렛은 백색 (또는 용해 이미 두 번 수행 된 경우), 부드럽게 멸균 PBS 10 ㎖로 세포를 다시 정지합니다. </li><li> 자동 카운터 또는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. 일반적인 금리는 혈액 1 ㎖ 당 적어도 10 6 세포이다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상층 액을 그려 버린다. </li><li> 멸균 PBS 실온에서 원하는 농도로 세포를 다시 일시. FOR DNA를 분리 분석은 ml의 당 5 × 10 6 세포에서, 섹션 2에 resuspend을 설명했다. </li><li> 경우에 따라, 세포의 소량을 직접 전송하거나 유리 슬라이드에 cytocentrifuge을 사용. 세포가 건조 얼룩 (가) &#39;지침을 제조에 따라 빠른 고정 및 염색 키트를 사용 할 수 있습니다. 현미경으로 관찰 할 때 호중구의 분리가 성공한 경우 유핵 세포의 적어도 95 %는 최소한의 오염 적혈구와 과립구 (호중구, 호염기구, 호산구)이어야한다. </li></ol> 3. DNA 자료 분석 <ol><li> 호중구 차단 후 바로 DNA 자료 분석을 설정합니다. </li><li> 세포 응집 광 현미경 원액 시험에 있으면, 즉시 분석을 설정하기 전에 멸균 70 ㎛의 멸균 필터를 이용하여 세포 현탁액을 통과한다. </li><li> 멸균 96 웰 플레이트의 각 실험 웰에 5 × 104 세포 / 웰을 추가; 작용제 및 로스웰 파크 메모페놀 레드와 100-200 μL의 최종 부피로 0.5 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청이없는 리알 연구소-1640 (RPMI) 매체. 호중구 원액 PBS 동량으로 대체되는 작용제 당 적어도 두 블랭크 웰을 포함한다. 각 작용제에 대한 빈 우물을 설정하면 형광 분석과 함께 작용제에 의해 작용제 또는 간섭의 DNA 오염을 배제 중요합니다. </li><li> 탄산 가스 (4 %) 인큐베이터에서 30 분 동안 39 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 원하는 농도와 세포 투과성 핵산 염료에 효능을 추가합니다. 다른 핵산 염료 사이에 다릅니다 세포 투과성 염료의 최적 농도를합니다. 작용제 미디어 동량으로 대체되는 무 자극 제어는 각각의 실험에 포함되어야한다. 주 : 웰 사이의 일관된 상태를 유지하기 위해 배양액의 유사한 양의 효능을 희석하는 것이 바람직하다. (200)의 최종 아니라 볼륨 &amp;# 181; 난 성공적으로 사용되어왔다이이 변경되는 경우, 잘 볼륨은 모든 조건이 동일 유지해야한다. 포볼 -12- 미리 스테이트 -13- 아세테이트 (PMA) (최종 농도 ≥0.1 μM) 혈소판 활성화 인자 (PAF) (최종 농도 ≥31 μM)을 양성 대조군으로 사용할 수있다. 작용제 중복 적어도 측정해야한다. </li><li> 39 ° C에서 품어. 2시간 후, 또는 소정의 간격으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다. 최적의 시간 간격을 사용 작용제에 따라 달라질 수 있습니다. 참고 : 파장이 사용 염료에 따라 달라집니다. </li><li> 평균 형광을 계산하기 전에 빈 형광을 뺍니다. </li><li> 개인간 및 플레이트 사이의 비교를 위해, 비 자극 된 웰의 평균 형광 자극 웰의 평균 형광을 나누어 형광 폴드 변화를 계산한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

제시된 DNA 분리 분석은 세포 DNA에 대한 용이 한 정량 분석한다. 이 방법은 다른 종에서 NET 형성을 평가하기 위해 사용 된 유사한 기술에서 채택되었지만, 원심 속도 작용제 농도와 항온 처리 시간은 개과 호중구 8,17,18 함께 사용하기위한 방법을 최적화하기 위해 변경되었다. 유사한 조정이 다른 종의 방법을 적용하도록 할 수있다. 분석은 유동 세포 계측법 또는 이미지 분석으로 NETosis을 측정하는 다른 방법에 비해 간단하고 저렴하다. 또한,이 방법은 상업적으로 생산 누구를 검증 종 반응 항체가 종종 사용할 수없는 위해 이렇게 개에 사용하기에 이상적입니다 NET 구성 요소에 대한 항체를 필요로하지 않습니다. 이 방법의 중요한 한계는 NET 형성 세포 투과성 핵산 염료의 특이성이 부족하다. 이 염료는 죽고 죽어가는 세포, 바인딩 DNA를 입력하고 형광. 따라서, FLuorescence는 NET 형성을위한 특정하지 않습니다. 시각적으로 작용 물질이 ...

만 70 애완 동물 개 1 혼자 미국에 있습니다. 소중한 가족으로,이 동물은 종종 가장자리 치료를 절단받을 수 있습니다. 그들은 우리의 환경을 공유 마찬가지로 때문에, 개는 인간의 질병 1의 병인과 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 의학적 치료 또는 그 반대에 인간 의약 발견 변환 여부는 완전히 같은 선천성 면역 반응 심지어 고도로 보존 시스템 종 변형을 특성화하는 것이 중요하다. 송곳니와 인간의 선천성 면역 시스템 사이의 차이의 예는 개 호중구 (2) 높은 표현 CD4을 포함한다; 개 3의 세포질 플라 젤린 센서 IPAF의 기능 동족체의 부재와 육식 4에서 카스파 제 1/4 하이브리드의 표현. 호중구 세포 트랩 (그물) 선천성 면역 (5)의 비교적 최근에 발견 된 구성 요소입니다. 그물 네트워크입니다감염성 또는 염증성 자극 (6)의 넓은 범위에 응답하여 해제 DNA, 핵 단백질의 입상. NET 같은 구조 닭 7, 8 물고기, 연체 동물류 (9, 10)을 포함하는 많은 종 acoelomates 통해 입증되었지만 종 차이가있다. 예를 들어, 쥐의 호중구 인간 호중구보다 NETosis 자극에 더 느리게 응답, 덜 확산 그물 (11)을 형성한다. 그물 직접 병원균 12,13 죽이는 데 관여 할 수 이상의 논쟁 미생물 포획, 복수 종 증거하는 큰 몸체있다. 그러나 NET 구성 요소는 또한, 조직 손상을 강화 14, 15을자가 항원으로 혈전증 행동을 촉진. 그물의 유익하고 해로운 영향 사이의 균형은 종과 관심의 조건에 모두 그물을 조사하는 것이 중요하다 제안, 다른 질병과 다른 종 사이에 차이가있을 수 있습니다. 여기에 우리유도와 송곳니 호중구 그물의 방출을 측정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 호중구 (16)을 분리하여 다른 종 NETosis을 유도하기 위해 사용 된 것과 유사하지만, 이러한 효능 제 농도 및 배양 시간 등의 조건은 개과 호중구에 대해 최적화되었다. 유사한 NET 정량화 DNA 분리 분석은 다른 종에서 설명되었지만, 여기에 제시된 방법은 또한 개 8,17,18에 최적화되어있다.

<table><tbody><tr><td>스프레이 코팅된 플라스틱 전혈관 K2EDTA</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-500</td><td>Accurate chemical and scientific corp.</td><td></td><td></td>AN228410</tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>20012043</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 송아지 혈청, 열 비활성화</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10100139</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Media 1640, 페놀 레드 또는 L-글루타민 없음</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>32404-014</td><td>페놀 레드</td></tr><tr><td>96 웰 플랫 바닥 멸균 폴리스티렌 플레이트</td>가 없어야 합니다.<td></td><td></td><td></td>353072</tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 활성화 인자</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4904</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX 녹색 핵산 염색</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 다중 모드 리더</td><td>BioTek</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

호중구 세포외 트랩은 감염 및 염증 자극에 반응하여 방출되는 DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. NET은 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만 자가면역 및 혈전증을 포함한 다양한 질병 과정과 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 마이크로플레이트 형광 분석을 사용하여 개의 호중구 분리 및 NET의 정량화를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 혈액은 기존의 정맥 천자 기술을 사용하여 수집합니다. 호중구는 덱스트란 침전(dextran sedimentation)과 개의 혈액에 최적화된 조건을 사용하여 밀도 구배(density gradient)를 사용하여 분리됩니다. 96웰 플레이트의 웰에 부착할 시간을 허용한 후, 호중구는 phorbol-12-myristate-13-acetate 또는 혈소판 활성화 인자와 같은 NET 유도 작용제로 치료합니다. DNA 방출은 세포 불투과성 핵산 염료의 형광으로 측정됩니다. 이 분석법은 NET 방출을 정량화하는 간단하고 저렴한 방법이지만, 다른 세포 사멸 원인보다는 NET 형성을 대체 방법으로 확인해야 합니다.

이 프로토콜을 이용하여, 양성 대조군, 및 PAF PMA로 호중구를 자극 후의 형광 강한 배의 변화가있을 것이다. 비 자극 세포 (범위 2.0-5.8, N = 5 개) 18에 비해 형광의 평균 4.0 배 증가에서 1 시간 결과 31 μM PAF와 그림 1B, 송곳니 호중구의 자극에 도시 된 바와 같이. 0.1 μM (도 1a)에서 PMA 2 시간까지 형광을 증가시키지 않는 느린 작용제하지만 궁극적 유사한 배 형광 증가 생성 (평균 : 3.3 범위 1.36-5.4, N = 5 마리) 18. PAF가 높은 농도에 비해 비교적 저렴하고 광범위 뮤린 및 인간 연구에 사용되었다 : 그 느린 반응 속도에도 불구하고, PMA 장점은 양성 대조군으로 존재한다. 핵산 염료의 형...

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

이 실험의 전반적인 목표는 정지기 호중구를 분리하고 작용제에 반응하여 방출되는 DNA를 측정하는 것입니다. 이 방법은 호중구 외세포 트랩 유도 또는 세포 사멸의 다양한 작용제에 대한 호중구의 반응은 무엇인가와 같은 면역학 및 수의학의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 호중구 외세포 트랩 형성의 다양한 작용제 및 억제제를 신속하게 스크리닝할 수 있다는 점입니다.건강한 개 공여견의 외정맥에 21게이지 나비바늘을 삽입한 후, 3mL 주사기를 연결하여 3mL 혈액 샘플 3개를 채취하고, 이를 즉시 캡이 없는 EDTA 함유 혈액 수집관으로 옮깁니다. 혈액 채취 상태가 좋지 않으면 호중구 수율이 낮아지므로, 정맥 천자가 외상 없이 이루어지고 혈류가 원활한지 확인하십시오. 각 튜브를 채운 후, 혈액과 항응고제가 충분히 섞이도록 튜브를 반전시킵니다.50-milliliter 원뿔형 튜브에 혈액을 모읍니다. 멸균된 상온의 3% Dextran 500을 샘플과 동일한 부피로 넣고 부드럽게 반전시켜 혼합한 후, 튜브를 세운 상태로 상온에서 18분에서 20분 동안 둡니다. 그 다음, 하단의 붉은 층에 의해 오염되지 않는 범위 내에서 상단의 짚색 층을 새 튜브로 옮깁니다.상층액을 원심 분리합니다. 상층액을 버리고, 펠릿을 10 milliliters의 멸균된 실온 PBS에 수동으로 재현탁합니다. 그 다음, 50-milliliter 원추형 튜브에 실온의 sodium diatrizoate 함유 polysucrose 세포 분리 용액 10 milliliters를 넣습니다.세포를 분리 용액 위에 조심스럽게 층을 이뤄 얹습니다. 원심분리를 통해 세포를 분리합니다. 상단의 혈장, 혈소판 단핵구 세포 및 밀도 구배 층의 세 층을 제거합니다.실온의 멸균수 10 milliliters를 사용하여 남은 적혈구를 용해합니다. 30초 후, 장력(tonicity)을 회복시키기 위해 실온의 멸균 1.8% sodium chloride 10 milliliters를 첨가합니다. 세포를 부드럽게 도립 혼합합니다.이제 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 흰색 펠릿을 10 milliliters의 멸균 PBS에 넣고 부드럽게 재현탁합니다. 세포 수를 센 후, 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 상온의 멸균 PBS에 5 × 10⁶ cells/mL 농도가 되도록 재현탁합니다.적절한 경우, 소량의 세포를 유리 슬라이드 위에 공기 건조시킨 후, 제조사의

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

우리는 활성화된 호중구에서 파생된 호중구 세포외 트랩 잔해의 두 가지 구성 요소인 골로페록시다제 접합 DNA 및 호중구 엘라스타제 접합 DNA 복합체를 정량적으로 측정하기 위한 변형된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석 기술에 대한 프로토콜을 제시합니다.

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

배우세요 개 호중구에서 세포 외 트랩 형성을 정량화하는 형광 분석법을. 면역학 및 수의학 연구에서 중성구 활성을 신속하게 평가하는 데 활용됩니다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

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