Name: 실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질(MOG)의 간단한 생산 및 정제 방법을 통해 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 기술을 익히세요. 표준 실험실 장비만으로도 다발성 경화증 연구가 가능합니다.

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이 연구는 캐나다 다발성 경화증 협회(Multiple Sclerosis Society of Canada)의 보조금으로 지원되었습니다. RWJ는 Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award를 수상했습니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기서는 MOG 태그 단백질 및 방법 MOG 태그 단백질 순수한 MOG 1-125을 생성하는 생산을위한 프로토콜을 기술 하였다. 이 프로토콜은 표준 그의 태그 기반의 단백질 정제 방법뿐만 아니라 이전 MOG 단백질 계 (15)의 생성을위한 전술 한 두 프로토콜에 기초한다. 그것은 여기에서 설명되지 않지만, MOG 태그 단백질의 주 사용은 단백질 항원을 면역 EAE를 유도하는 것이다. EAE는 MOG 태그 단백질과 호환되는 마우스, 유도하는 방법을 설명하는 프로토콜은, 참조 3에서 찾을 수 있습니다. 우리는 이전에 MOG 태그에서 파생 된 MOG 태그 또는 MOG 1-125와 예방 접종뿐만 아니라 표준 MOG 35-55 펩타이드에 비해 큰 척수의 염증과 탈수 초화와 CNS자가 면역 질환뿐만 아니라, 그 병원성 IGH...

MS 만성 염증과 미엘린 향하는자가 면역 반응에 의해 구동되는 것으로 생각되는 CNS의 신경 퇴행을 특징으로하는 인간의 질병이다. 시간이 지남에 따라 수초와 축색 돌기의 손실은인지 및 모터 기능을 하나의 점진적 감소가 발생. &quot;실험자가 면역 뇌척수염은&quot;중추 신경계의 수초 지향자가 면역 질환의 동물 모델에 대한 포괄적 인 용어이다. 인간의 MS와 마찬가지로 EAE는 일반적으로 어떤 경우에는 CNS의 면역 세포 침윤을 특징으로하고,이 탈수 초화. 그러나, 임의의 주어진 EAE 모델은 부분적으로 인간의 MS와 유사한 과정에 사용되는 화학 종 또는 균주 및 하부 반 미엘린 면역 반응의 복잡성에 좌우된다. 안티 미엘린 실험적자가 면역은 여러 가지 방법으로 유도하지만, 현재 사용되는 가장 일반적인 방법은 면역 CD4 흉내 아미노산의 짧은 펩타이드 마우스 면역화 될 수있다 <s미엘린 단백질&gt; + T 세포 에피토프입니다. 이 병원성 반응을 유도 할 수있는 최소 요구 사항을 나타냅니다. 아마도 이들 중 가장 일반적인 C57BL / 6 마우스 3 EAE를 유도하기 위해 사용된다 (MOG 35-55) 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질에서 유래하는 21 개의 아미노산 펩타이드이다. 그러나 일부 실험 목적이 큰 단백질 항원 실제로 짧은 펩타이드와 예방 접종을 통해이 몇 가지 장점이와 예방 접종하는 것이 바람직 심지어 필요가있다. 전체 단백질 또는 특정 도메인의 어느 쪽인지를 표현하는 더 큰 단백질 항원이 다른 종에서도 여러 근친 마우스 변종에 프리젠 테이션을 위해 정상적으로 처리하거나 할 수 있지만 먼저, MHC의 제한 때문에, 짧은 펩티드는, 일반적으로 균주의 매우 제한된 범위에서만 유효하다 4. 둘째로, 더 큰 단백질 항원은 항원 인식 림프구 종 이상을 포함하는보다 복잡한 면역 반응을 유도하기보다는 limitin 할CD4 + T 세포에 항원 g 인식. 예를 들어, 그들의 B 세포 수용체 (BCR)을 통해 B 세포는 전체 단백질보다는 처리와 직접 상호 작용한다. 우리와 다른 MOG 단백질 (5)을 인식하지 못하는 MOG 35-55 예방 접종에 의해 활성화하는 B 세포를 보여 주었다. B 세포는 인간 최근 MS 6에서 병원성 역할을하는 것으로 입증 되었기 때문에,자가 면역 병리에서 B 세포를 포함 EAE 모델은 점점 중요하다. EAE를 유도하는 큰 단백질 항원을 사용하는 장점에도 불구하고, 단백질에 대한 몇 시판 소스가 남아있다. MOG 35-55 같은 짧은 펩티드가 매우 빠르고 상대적으로 낮은 비용으로 합성 할 수 있지만 실제로, MOG 단백질 상업 옵션을 구입 제한 및 비용 실질적으로 더 있습니다. 그럼에도 불구하고, MOG 세포 외 도메인을 생성하는 연구 그룹에 사용할 수있는 여러 가지 발현 벡터 (MOG 1-125) 자신이있다. HoweveR, 우리는 문헌에서 확인 하였다 발현 시스템의 모든 사람보다 효율적인 발현 시스템 (7)로 대체 한 이전 기술에 기초한다. 또한, 대부분의 쥐 또는 인간의 MOG 8을 기반으로합니다. 마우스에서자가 면역 반응의 일부 수사 마우스 MOG의자가 항원에 기초하여 항원이 바람직하다. 마지막으로, 상업적 또는 발현 벡터와 같은 하나 우리가 식별 된 모든 MOG 계의 단백질은 상기 MOG 1-125 기재에 추가적인 아미노산을 포함하는 융합 단백질이다. 다음은 우리가 식별 할 수 없습니다 많은 기능이있는뿐만 아니라 정화 및 일반적으로 다른 시퀀스에 대한 태그를 포함한다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 MOG 단백질 5의 공지 불용성 싸우는 오레 독신을 포함하는 태그에 융합 된 마우스 MOG 외 도메인에 기초하여 신규 한 융합 단백질을 생성. 태그 시퀀스는 정화와 TEV 프로테아제 CLE에 대한 6xHis 시퀀스를 포함원하는 경우, 모든 태그 서열의 완전한 제거를 허용 avage 사이트. 이것은 우리가 순수 MOG 1-125 단백질을 생성 할 알고있는 유일한 방법입니다. 단백질의 대량 생산을 용이하게하기 위해, MOG 1-125 서열은 박테리아 발현 코돈 - 최적화하고, MOG 태그 융합 단백질 애완-32 발현 시스템 내로 삽입되었다. 여기서는 가장 면역학 연구실 사용할 비 특수 장비를 사용하여 생산 MOG 태그 단백질 순수 MOG 1-125를 정화 상세히 프로토콜을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot lab</td><td></td><td>이 박테리아는 MOGtag 단백질을 만드는 데 필요합니다. 이러한 박테리아의 글리세롤 재고는 요청 시 제공됩니다.</td></tr><tr><td>LB 육수 밀러</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>바이오 베이직</td><td>AB0028</td><td>100mg/ml에서 분말을 50% 에탄올/50% H2O로 재결합. -20°C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>분말을 1M에서 H2O로 재응축하고 -20°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>닭-달걀 라이소자임</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>H2O에서 50mg/ml로 재구성하고 -80°C에서 보관합니다.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td>수 <td>수명 기술</td><td>20012-027</td><td>상업용 인산염 완충 식염수는 필요하지 않으며 표준 실험실에서 만든 인산염 완충 식염수로 충분합니다.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Bioshop</td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>구아니딘-HCl</td><td>시그마</td><td>G3272</td><td>품질은 순도 98% 이상이어야 합니다.</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>바이오샵</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>니켈 (II) 황산염</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>그의 바인드 수지</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>20 % 에탄올 80 % H2O 4 &deg; C</td></tr><tr><td>무수 에탄올</td><td>상업용 알코올</td><td>P016EAAN</td><td>필요에 따라 물로 희석합니다.</td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨 트리하이드레이트</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 표준</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad 단백질 분석 염료 시약 농축액</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산, 다이소듐 염 디하이드레이트</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW 뱀 피부 투석 튜브</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>이 시약은 흄 후드 밖에서 취급해서는 안 됩니다.</td></tr><tr><td>AcTEV 프로테아제</td><td>lifetechnologies</td><td>12575-015</td><td>참조와 같이 (https://www.addgene.org/8827/) 및 정제하여 자체 TEV 프로테아제를 생산할 수 있습니다. 17</td></tr><tr><td>Polyethyleneglycol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polyethyleneglycol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon 마이크로플레이트 분광계</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>이 장비는 Gen5 데이터 분석 소프트웨어를 사용합니다.</td></tr><tr><td>Gen5 데이터 분석 소프트웨어</td>: <td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데실 황산염</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr>, <tr><td>브로모페놀 블루</td><td>, Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr>, <tr><td>글리세롤</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>단백질 탈염 컬럼</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Bioshop</td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>프리캐스트 12% 폴리아크릴아미드 젤</td><td>바이오-라드</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>빠른 염색 시약</td><td>EMD 밀리포어</td><td>553215</td><td></td></tr><tr><td>젤 독 EZ 이미저</td><td>바이오-라드</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>백색광 샘플 트레이</td><td>바이오-라드</td><td>1708272&nbsp;</td><td>쿠마시 블루 염색을 위해 젤 독 EZ 이미저와 함께 사용</td></tr><tr><td>단백질 ladder</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

다발성 경화증(MS)은 중추신경계(CNS)의 만성 염증성 질환으로, 미엘린을 표적으로 하는 자가면역 반응의 결과로 발생하는 것으로 생각됩니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 중추신경계 자가면역질환의 가장 흔한 동물 모델이며, 일반적으로 미엘린 단백질의 면역우성 CD4+ T 세포 항원결정기를 나타내는 짧은 펩타이드를 사용한 면역을 통해 유발됩니다. 그러나 B세포는 가공되지 않은 단백질을 직접 인식하며, 쇼트 펩타이드를 이용한 면역은 네이티브 단백질을 인식하는 B세포를 활성화하지 않습니다. 다발성경화증에 대한 B세포 고갈 치료제에 대한 최근 임상시험에서 B세포가 인간의 질병을 유발하는 역할을 한다는 사실이 밝혀짐에 따라, 자가항원의 B세포 인식을 통합한 동물모델에 대한 시급한 필요성이 대두되고 있습니다. 이를 위해 마우스 버전의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)의 세포외 도메인과 정제 목적의 His-태그의 N-말단 융합체, 용해성 향상을 위한 티오레독신 단백질(MOG태그)을 포함하는 새로운 융합 단백질을 생성했습니다. 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위를 통합하여 순수한 MOG1-125 세포외 도메인만 남기고 모든 태그 염기서열을 제거할 수 있도록 했습니다. 여기에서는 표준 실험실 장비만 사용하여 대량의 순수 MOG태그 또는 MOG1-125를 생산하는 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 200mg 이상의 MOG태그 단백질을 지속적으로 생성합니다. MOG태그 또는 MOG1-125를 사용한 면역은 네이티브 마우스 MOG를 인식하는 병원성 B 세포를 포함하는 자가면역 반응을 생성합니다.

정화가 완료되면, 샘플 단계 1.4, 2.1, 3.4에서 수집하고, 단계 6.4의 최종 생성물은 단백질 겔 (도 3A)에서 실행되어야한다. MOG 태그 먼저 T O / N 샘플에서 31.86 kDa의 밴드로 나타날 수 있지만 0 T, 최종 순수한 생성물의 유일한 밴드되어야한다. 모그 태그 단백질이 올바르게 접혀 여부를 테스트하기 위해, MOG 태그 단백질 FACS로 MOG 단백질 특정 B 세포를 라벨 할 수있다. 1과 라벨링 마우스 림프구에 의해 다음 그의 태그와 형광 표지 차 방지의 IgG1 항체에 대한 감독 차 항체와 함께 MOG 태그의 1,000 희석, MOG 특정 B 세포 (그림 3B)에서 확인할 수 있습니다. 대안 적으로, 태그 MOG 직접 배경...

우리는 기본 실험실 장비만을 사용하여 마우스 Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein을 포함하는 대량의 융합 단백질을 생성하고 정제하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 단백질은 T 세포와 B 세포 모두에 의해 유발되는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 실험적 자가면역성 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)을 유도하는 데 사용할 수 있는 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocytes glycoprotein, MOG)의 세포 외 도메인 기반 단백질을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜을 통해 모든 연구실에서 EAE 유도를 위한 항원으로 사용할 MOG 단백질을 직접 제조할 수 있습니다. 본 프로토콜의 주요 장점은 특수한 단백질 처리 장비에 의존하지 않고, 거의 모든 면역학 연구실에 구비된 표준 장비를 사용할 수 있다는 점입니다.본 프로토콜은 마우스 버전의 MOG 태그 단백질에 최적화되었으며, 정제를 위해 hexahistidine 태그를 포함하는 다른 MOG 단백질 발현 시스템에도 적용 가능합니다. 멸균된 배지 5 mL에 BL 21 MOG 태그 글리세롤 스톡을 접종하고 37 °C, 200 RPM에서 하룻밤 동안 배양합니다. 멸균된 LB 500 mL가 담긴 500 mL 플라스크 2개에 각각 100 mg/mL ampicillin 500 µL를 첨가합니다. 하룻밤 배양한 배양액 1 mL를 두 개의 LB 배지 플라스크에 각각 옮깁니다.37 °C, 200 RPM에서 5시간 동안 또는 흡광도(optical density)가 0.6에 도달할 때까지 배양합니다. 원하는 세포 밀도에 도달하면, 각 배양 플라스크에 1 M IPTG 0.5 mL를 첨가합니다. 플라스크를 37 °C, 200 RPM에서 4시간 동안 배양한 후, 상온에서 75 RPM으로 하룻밤 동안 배양합니다.배양액을 고속 원심분리에 적합한 250 milliliter 병에 균등하게 나누어 담고, 이후부터는 병을 얼음에 박아 보관하십시오. 4 °C에서 22,000 ×g로 15분간 원심분리하여 박테리아 세포를 펠렛화합니다. 모든 박테리아 펠렛을 총 30 milliliters의 용해 버퍼(lysate buffer)에 재현탁하여 혼합하십시오.이 부피의 용액을 고속 원심분리가 가능한 약 50 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 30 degree Celsius 항온수조에서 30분 동안 배양합니다. 배양 시간 동안 튜브를 두 번 흔들어 세포를 재현탁시킵니다.배양 후, 튜브를 얼음 위로 옮기고 20 kHz, 진폭 70% 조건에서 3초 작동 및 3초 정지 과정을 5회 반복하여 용액을 초음파 처리합니다. 이와 같은 5회 펄스 과정을 총 6회 반복하며, 각 라운드 사이에 용액을 얼음 위에서 냉각시킵니다. 그다음, 4 °C에서 24,000 ×g로 15분 동안 용액을 원심분리한 후, 펠릿을 30 mL의 buffer A에 재현탁하고 4 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, 이전과 동일하게 얼음 위에서 용액을 초음파 처리하고, 용액에 17.2 g의 guanidine HCl을 첨가합니다.MOG 태그 단백질을 가용화하기 위해 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 니켈 레진을 충전하고 평형화하려면, 먼저 레진이 들어 있는 각 튜브에 물 40 milliliters를 추가하여 레진을 세척합니다. 튜브를 로커 위에 수평으로 눕히고 4 °C에서 5분 동안 교반합니다.완료 후, 튜브를 4°C에서 4500 ×g로 8분 동안 원심분리합니다. 펠렛이 섞이지 않도록 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 그런 다음 각 튜브에 40 mL의 전하 완충액(charge buffer)을 첨가합니다.튜브를 로커로 옮겨 4°C에서 15분 동안 교반한 후, 이전과 동일하게 다시 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 튜브에 40 mL의 buffer B를 추가합니다. 튜브를 로커로 옮겨 4°C에서 5분 동안 교반한 후, 레진이 포함된 튜브를 다시 한번 원심분리합니다.MOG 태그 단백질을 정제하려면, 가용화된 단백질 전체 부피를 니켈 수지가 들어 있는 첫 번째 튜브로 옮깁니다. 혼합 후, 튜브를 로커 위에 수평으로 놓고 4°C에서 1시간 동안 둡니다. 4°C에서 4500 ×g로 8분 동안 원심분리한 후, 이 상층액을 두 번째 니켈 수지 튜브로 옮기고 이전과 동일하게 배양합니다.그동안 첫 번째 튜브의 니켈 수지를 40 milliliters 용출 완충액에 재현탁하고, 튜브를 로커 위에 수평으로 놓아 4 °C에서 5분 동안 둔 다음 이전과 같이 원심분리합니다. 용출된 MOG 태그 단백질이 포함된 상층액을 '정제된 MOG 태그 단백질'이라고 표시된 250 milliliter 병에 옮깁니다. 이 병을 4 °C에서 보관하십시오.각 용출 단계에서 얻은 상층액을 이 병에 모읍니다. 첫 번째 튜브에 있는 니켈에 40 milliliters의 스트립 완충액을 첨가하고, 4 degrees Celsius에서 5분 동안 로커 위에 수평으로 놓습니다. 튜브를 원심 분리하여 상층액을 버리고, 이전과 동일하게 니켈 레진을 재충전합니다.완료되면 첫 번째 튜브에서와 동일하게 두 번째 튜브로 진행하십시오. 용해된 단백질을 충전된 니켈 레진에 흡착시키고 용출하는 과정을 총 4회 반복하면 대부분의 단백질을 회수할 수 있습니다. 뱀껍질 투석 튜브를 약 30 cm 길이로 자릅니다.뱀 껍질의 끝부분을 세 번 접은 후 잠금형 지혈집게(hemostat)로 집어 한쪽 끝을 고정합니다. 뱀 껍질에 희석된 MOG tag 단백질을 채웁니다. 그 다음, 열려 있는 끝부분을 통해 공기 방울을 밀어내어 제거합니다.마지막으로, 두 번째 잠금 헤모스탯을 사용하여 튜브의 반대쪽 끝을 밀봉합니다. 다음으로, 대형 버킷에 4 M guanidine이 포함된 1 x 아세테이트 완충액 1 L를 채웁니다. MOG tag 단백질이 들어 있는 투석 튜브 섹션을 최대 2개까지 버킷에 넣습니다.테이프를 사용하여 지혈鉗子(hemostats)를 버킷 측면에 고정하여, 바닥에서 마그네틱 Stir bar가 방해 없이 회전할 수 있는 공간을 확보합니다. 버킷을 4 °C의 실내 마그네틱 교반기에 넣고 낮은 회전 속도로 작동시킵니다. 완충액 내의 guanidine 함량을 점진적으로 줄이기 위해 투석은 최소 3일 동안 진행합니다.튜브가 손상되지 않았는지, 그리고 양끝이 단단히 닫혀 있는지 정기적으로 확인하십시오. 4~5시간 후, 1x 아세테이트 완충액 1 L를 투석 버킷에 추가합니다. 이 과정을 총 3회 반복하여 버킷에 총 4 L의 완충액이 들어가도록 합니다.버킷에 있는 버퍼의 절반을 버린 후, 1 x acetate buffer 1L를 다시 채우고 튜브와 교반 바(stir bar)를 설치합니다. 마지막으로 버킷 내의 4L 전체 부피를 신선한 1 x acetate buffer 4L로 교체하고 4~5시간 동안 교반합니다. 최상의 결과를 얻으려면 단백질 농축을 수행하는 당일에 이 단계를 진행하십시오.MOG 태그 단백질을 농축하기 위해, 펜 내부에 알루미늄 호일을 깐 후 PEG 3350과 PEG 1000을 1:1 비율로 섞어 알루미늄 호일을 덮습니다. PEG 3350은 농축 과정 중 단백질 응집을 방지하는 데 도움을 주며 효과적인 동결 보존제 역할을 합니다. MOG 태그 단백질이 들어있는 스네이크스킨 튜브를 알루미늄 호일 위에 올리고 PEG 8000으로 덮습니다.이를 실온에 두고, 부피가 예상 최종 부피와 같거나 그 이하가 될 때까지 정기적으로 부피를 확인하십시오. 농축 과정 중 펜이 물로 과포화되면, 알루미늄 호일과 PEG를 사용하여 새로운 팬을 준비하십시오. 정제 프로토콜 전반에 걸쳐 단백질 샘플을 채취하거나 SDS page 젤을 실행하여 순도를 확인하십시오.31.86 kilodaltons에서 고순도로 정제된 MOG tag를 보여주는 대표적인 젤 이미지이다. MOG tag 단백질이 올바르게 접혔는지 확인하기 위해, 야생형 C57 black six 마우스 또는 MOG 단백질 특이적 면역글로불린 중쇄를 발현하는 IgH MOG 마우스의 림프절에서 유래한 CD19 양성, CD4 음성 B 세포에 MOG tag 단백질이 결합하는지를 유세포 분석법을 이용하여 평가하였다. 이 프로토콜은 시작부터 끝까지 최소 10일이 소요된다.분리 절차 전반에 걸쳐 단백질의 상태를 추적하고, 보존해야 할 부분과 폐기해야 할 부분을 기억하는 것이 중요합니다. 니켈 레진 충전 시 사용하는 황산니켈 육수화물(nickel sulfate hexahydrate)은 매우 위험하므로, 흡입하거나 피부 또는 눈에 접촉하지 않도록 주의해야 함을 잊지 마십시오. 이 영상을 시청하고 나면, MOG 태그 단백질을 직접 생산하고 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.정제된 MOG 태그 단백질은 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant)로 유화하여 EAE를 유도하는 면역화에 사용할 수 있습니다. MOG 태그로 유도된 EAE는 중추신경계 자가면역에서 CD4 또는 CDAT 세포, B 세포와 같은 다양한 세포 유형의 관여를 연구하는 데 활용될 수 있습니다. MHC 제한성이 있는 짧은 펩타이드와 달리, 단백질 항원은 모든 마우스 계통에서 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하기 위해 항원 보조 에멀젼을 생성하는 효율적인 균질화 기술을 보여줍니다. 에멀젼은 물 상태에 자가항원인 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)을 함유하고 있으며, 불활성화된 병원성 박테리아로 구성된 연속적인 오일 상태로 둘러싸여 있습니다. 에멀젼은 장기적인 면역 반응을 위해 항원의 지속적인 방출을 보장합니다.

자가면역 뇌척수염을 유발하기 위한 항원 보조 에멀젼 제조

이 비디오는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질과 불활성화된 결핵균의 조합을 주입하여 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하는 방법을 보여줍니다. 이 모델을 통해 연구원들은 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 테스트할 수 있습니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염 유도

이 동영상은 뇌로 이동하는 자가반응성 T세포를 활성화하기 위해 미엘린 유래 펩타이드에 보조제를 주입하여 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유발하는 방법을 보여줍니다. 백일해 독소는 혈액 뇌 장벽 투과성을 증가시켜 이러한 T 세포와 다른 면역 세포가 뇌로 들어갈 수 있도록 하기 위해 투여됩니다. 이러한 면역 세포는 탈수초화를 일으켜 신경 전달 장애와 EAE 발병을 유발합니다.

마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 발생

이 비디오에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 사용하여 다발성 경화증의 마우스 모델을 구축합니다. 마우스에 뉴런 펩타이드와 보조제가 포함된 에멀젼을 주입하여 자가반응성 T세포를 활성화하는 면역 반응을 유발합니다. 그 다음에는 백일해 독소(PTX)를 주입하여 혈액뇌장벽 투과성을 높여 자가반응성 T세포가 뇌에 침투할 수 있도록 합니다. 이 침투는 궁극적으로 수초성 손상을 초래하는 신호 폭포를 시작하여 다발성 경화증의 탈수초성 상태를 모방합니다.

출처: Jain, RW, et al. 실험적 자가면역 뇌척수염 연구를 위한 마우스 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질의 간단하고 효율적인 생산 및 정제. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 연구에 사용되는 재조합 수초 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)인 MOGtag의 분리 및 정제를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 정제된 MOGtag를 얻기 위한 박테리아 용해, 초음파 처리, 원심분리 및 니켈 친화성 크로마토그래피가 포함됩니다. 이 단백질은 다발성 경화증 모델에서 B 세포 매개 자가면역 연구를 가능하게 합니다.

재조합 수초 희소돌기아교세포 당단백질의 분리 및 정제

실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)는 다발성 경화증의 설립 동물 모델입니다. C57BL / 6 마우스는 중추 신경계 자기 반응성 면역 세포에 의해 야기 오름차순 이완성 마비를 초래 미엘린 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) 펩티드 35-55 (MOG 35-55)로 면역화된다. 질병 유도 및 모니터링을위한 프로토콜이 논의 될 것이다.

수초 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 쥐에 실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 유도

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

본 프로토콜은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질을 사용하는 마우스 모델에서 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 임상 스코어링 시스템을 사용하여 질환 과정을 모니터링하는 것을 설명한다. 실험적 자가면역 뇌척수염 관련 증상은 마우스 대퇴골 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 분석 및 오픈 필드 테스트를 사용하여 분석되어 질병 과정을 종합적으로 평가합니다.

실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 다양한 평가 지표

다발성 경화증의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염을 유도하기 위해, 마우스를 자가항원 및 완전한 프로인트 보조제를 함유하는 유중수 에멀젼으로 면역화시킨다. 이러한 에멀젼의 제조를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 에멀젼 제조를 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 프로토콜이 여기에 제시된다.

실험적 자가면역 뇌척수염 유도를 위한 항원/보조 에멀젼을 제조하기 위한 빠르고 간단하며 표준화된 균질화 방법

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

배우세요 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질(MOG)의 간단한 생산 및 정제 방법을 통해 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 기술을 익히세요. 표준 실험실 장비만으로도 다발성 경화증 연구가 가능합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

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