실험자가 면역 뇌척수염 연구 간단하고 효율적인 생산 및 마우스 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질의 정제

이 프로토콜의 전반적인 목표는 실험용 자가면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 데 사용할 수 있는 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 또는 MOG의 세포 외 도메인을 기반으로 단백질을 생성하는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하면 모든 실험실에서 EAE를 유도하는 항원으로 사용하기 위해 MOG 단백질을 만들 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 특수 단백질 취급 장비에 의존하지 않고 거의 모든 면역학 실험실에서 볼 수 있는 표준 장비를 사용할 수 있다는 것입니다.

글쎄요, 이 프로토콜은 마우스 버전을 기반으로 MOG 태그 단백질에 최적화되었으며, 정제를 위해 hestate를 통합하는 다른 MOG 단백질 발현 시스템에서도 작동해야 합니다. 멸균 육수 5ml에 BL 21 MOG 태그 글리세롤 스톡을 접종하고 섭씨 37도 및 200RPM에서 밤새 배양합니다. 500 밀리리터의 멸균 LB가 들어있는 500 밀리리터 플라스크에 100 밀리리터 암피실린 500 밀리리터를 첨가합니다. 1ml의 하룻밤 배양을 LB 육수 두 플라스크 각각에 옮깁니다.

섭씨 37도 및 200RPM에서 5시간 동안 또는 최대 0.6의 광학 밀도까지 배양합니다. 원하는 세포 밀도에 도달하면 각 배양 플라스크에 0.5ml의 1몰 IPTG를 추가합니다. 플라스크를 배양하고 섭씨 37도와 200RPM으로 4시간 동안 설정한 다음 실온에서 하룻밤 동안 75RPM으로 설정합니다.

고속 원심분리와 호환되는 250ml 병에 배양물을 고르게 분배하고 이 시점부터 병을 얼음 위에 두십시오. 세균성 세포를 22, 000 시간 g에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 펠릿으로 만든다. 모든 박테리아 펠릿을 재현탁하고 총 30ml의 용해물 완충액에 결합합니다.

이 부피를 고속 원심화가 가능한 약 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 이 튜브를 섭씨 30도의 수조에 30분 동안 넣습니다. 배양 시간 동안 튜브를 두 번 흔들어 세포를 다시 현탁시킵니다.

배양 후 튜브를 얼음 위로 운반하고 20 킬로 헤르츠와 진폭 70 % 펄스로 용액을 초음파 처리하고, 3 초 동안 펄스를 켜고 5 펄스로 3 초 동안 끄고, 용액을 5 펄스로 총 6 회 초음파 처리하여 용액이 라운드 사이에 얼음에서 냉각되도록합니다. 다음으로, 24, 000 시간 g에 용액을 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리한 다음 펠릿을 30밀리리터의 버퍼 A에 재현탁시키고 용액을 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, 이전과 같이 얼음에서 용액을 초음파 처리 한 다음 17.2g의 guanidine HCl을 용액에 첨가하십시오.

MOG 태그 단백질을 용해시키기 위해 얼음에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 니켈 수지를 충전하고 평형을 이루려면 먼저 수지가 들어 있는 각 튜브에 40ml의 물을 추가하여 수지를 세척하십시오. 튜브를 로커에 수평으로 놓고 섭씨 4도에서 5분 동안 교반합니다.

완료되면 섭씨 4도에서 8분 동안 4500회 g으로 튜브를 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 피펫팅으로 상층액을 폐기하십시오. 그런 다음 각 튜브에 40ml의 충전 버퍼를 추가합니다.

튜브를 로커에 옮기고 섭씨 4도에서 15분 동안 교반한 후 이전과 같이 다시 원심화합니다. 상층액을 버리고 튜브에 40ml의 완충액 B를 추가합니다. 튜브를 로커로 옮기고 섭씨 4도에서 5분 동안 교반한 후 튜브에 레진을 다시 한 번 원심화시킵니다.

MOG 태그 단백질을 정제하려면 용해된 단백질의 전체 부피를 니켈 수지가 들어 있는 첫 번째 튜브로 옮깁니다. 혼합 후 튜브를 섭씨 4도의 로커에 1시간 동안 수평으로 놓습니다. 섭씨 4도에서 8분 동안 4500회 g의 튜브를 중앙 융합한 후 이 상등액을 니켈 수지의 두 번째 튜브로 옮기고 이전과 같이 배양합니다.

그 동안 첫 번째 튜브의 니켈 수지를 40ml 진화 완충액에 다시 현탁시키고 이전과 같이 원심화하기 전에 섭씨 4도의 로커에 튜브를 5분 동안 수평으로 놓습니다. 언급된 MOG 태그 단백질을 포함하는 상등액을 정제된 MOG 태그 단백질이라고 표시된 250ml 병에 옮깁니다. 이 병을 섭씨 4도로 유지하십시오.

각 용리 단계마다 생성된 상층액을 이 병에 모읍니다. 첫 번째 튜브에 있는 니켈에 40ml의 스트립 버퍼를 추가하고 섭씨 4도에서 5분 동안 로커에 수평으로 놓습니다. 튜브를 원심 분리하고 상등액을 버리고 이전과 같이 상승한 니켈을 재충전합니다.

완료되면 첫 번째 튜브에 대해 수행한 것처럼 두 번째 튜브로 앞으로 이동합니다. 용융된 단백질을 하전된 니켈 수지에 총 4회 흡수하고 용출하면 대부분의 단백질이 회수됩니다. 약 30cm의 뱀 피부 투석 튜브를 자릅니다.

뱀 피부의 끝을 세 번 접고 접힌 끝을 지혈기로 고정하여 잠금 지혈기로 한쪽 끝을 고정합니다. 뱀 피부를 희석된 MOG 태그 단백질로 채웁니다. 그런 다음 열린 끝에서 뱀 가죽을 강제로 빼내어 뱀 가죽에서 기포를 제거합니다.

마지막으로 두 번째 잠금 지혈기를 사용하여 튜브의 다른 쪽 끝을 밀봉합니다. 다음으로, 큰 양동이에 1리터의 1 x 아세테이트 완충액에 4개의 어금니 구아니딘을 채웁니다. MOG 태그 단백질이 들어 있는 투석 튜브를 최대 두 절까지 버킷에 넣습니다.

테이프를 사용하여 지혈기를 양동이 측면에 고정하여 자기 교반 막대가 바닥에서 방해받지 않고 회전할 수 있는 공간을 남겨둡니다. 양동이를 마그네틱 스커트 플레이트의 섭씨 4도 방에 놓고 느린 회전 속도로 켭니다. 투석은 완충액 내 구아니딘의 양을 점차적으로 줄이는 데 최소 3일이 걸립니다.

튜브가 손상되지 않고 시작되고 끝이 단단히 닫혀 있는지 정기적으로 확인하십시오. 4-5시간 후, 1리터의 1 x 아세테이트 완충액을 투석 버킷에 추가합니다. 이 과정을 4-5시간마다 총 3회 반복하면 양동이에 총 4리터가 됩니다.

버킷에 있는 버퍼의 절반을 버린 후 1리터의 아세테이트 버퍼를 다시 채우고 튜브와 교반 막대를 설정합니다. 마지막으로, 양동이에 있는 4리터 부피 전체를 4리터의 새 1 x 아세테이트 완충액으로 교체하고 4-5시간 동안 저어줍니다. 최상의 결과를 얻으려면 단백질 농도 당일에 이 단계를 수행하십시오.

MOG 태그 단백질을 농축하려면 펜에 알루미늄 호일을 깔고 알루미늄 호일을 PEG 3350 및 PEG 1000으로 1:1 비율로 덮습니다. PEG 3350은 농축 중 단백질 응집을 방지하는 데 도움이 될 수 있으며 효과적인 동결 보존제입니다. 뱀 가죽 튜브가 포함된 MOG 태그 단백질을 알루미늄 호일 위에 놓고 PEG 8000으로 덮습니다.

이것을 실온에 두고 부피가 예상 최종 부피와 같거나 낮을 때까지 정기적으로 부피를 확인하십시오. 농축 과정에서 펜이 물에 과포화되면 알루미늄 호일과 PEG로 새 팬을 설정하십시오. 정제 프로토콜 전반에 걸쳐 채취한 단백질 샘플 또는 SDS 페이지 젤에서 실행하여 순도를 확인합니다.

대표적인 겔이 표시되어 있으며, 31.86 킬로달톤에서 고도로 정제된 MOG 태그를 보여줍니다. MOG 태그 단백질이 올바르게 접혔는지 확인하기 위해 MOG 태그 단백질을 CD19 양성, CD4 음성, MOG 단백질에 특이적인 면역글로불린 중쇄를 발현하는 야생형 C57 블랙 식스 마우스 또는 IgH MOG 마우스의 림프절에서 9개의 B 세포에 대한 결합을 유세포 분석을 사용하여 평가했습니다. 이 프로토콜은 처음부터 끝까지 최소 10일이 소요됩니다.

분리 과정 전반에 걸쳐 단백질을 추적하고 보관해야 할 것과 버려야 할 것을 기억하는 것이 중요합니다. 니켈 수지를 충전하는 데 사용되는 니켈 설페이트 육수화물을 사용할 때는 매우 위험하므로 흡입이나 피부나 눈에 닿지 않도록 주의해야 함을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 자신의 MOG 태그 단백질을 생성하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

정제가 완료되면 MOG 태그 단백질은 완전한 Freund 보조제에서 유화되어 EAE를 유도하기 위한 면역으로 사용될 수 있습니다. MOG 태그에 의해 유도된 EAE는 중추신경계 자가면역에서 CD4 또는 CDAT 세포 또는 B 세포와 같은 여러 세포 유형의 관여를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. MHC가 제한되는 쇼트 펩타이드와 달리 단백질 항원은 모든 마우스 균주에 사용할 수 있습니다.