2016년 12월 2일
사회적 아메바 Dictyostelium discoideum은 최근 단백질 미스폴딩과 프로테오스타시스를 연구하는 시스템으로 확립되었습니다. 여기에서는 D. disccoideum에서 온도 유도 단백질 응집과 세포 스트레스 반응을 연구하기 위한 새로운 이미징 기반 방법론에 대해 설명합니다.
이 이미징 기술의 전반적인 목표는 Dictyostelium discoideum 세포에서 열 스트레스로 인한 세포 섭동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 아메바 Dictyostelium discoideum에서 열 스트레스 반응 및 단백질 품질 관리의 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 파일 이미징에 적용되는 온도를 엄격하고 정밀하게 제어할 수 있다는 것입니다.
절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 Dictyostelium 셀을 준비합니다. 화상 진찰 전일, 10에 낮은 형광 매체로 세포를 나누는, 밀리리터 당 000의 세포. 이미징하기 전에 LFM의 조직 플레이트에서 세포를 채취한 다음 적절한 수의 세포를 유리 바닥 접시로 옮깁니다.
세포가 20분 동안 안정되도록 한 다음 사용한 배지를 새 배지로 조심스럽게 교체하여 침전되지 않은 세포를 제거합니다. 섭씨 23도에서 스트레스가 없는 조건에서 이미지 셀은 최소 6개의 시야를 획득합니다. 1에서 0.25마이크로미터 단계로 최대 7마이크로미터의 Z 스택을 획득하여 셀의 전체 부피를 캡처합니다.
그런 다음 참조 명시야 이미지를 획득하여 총 세포 수를 평가합니다. 다음으로 냉각실의 온도를 섭씨 30도로 조정합니다. 온도 표시가 원하는 값에 도달하면 명시야 채널에서 수동으로 다시 초점을 맞춥니다.
타임랩스를 시작하기 전에 기록된 모든 FOV를 확인한 다음 시점 사이에 5분에서 10분의 시간 간격으로 4시간의 열 스트레스에 대한 타임랩스를 시작합니다. 처음 두 개의 시점을 획득하는 동안 초점이 올바른지 확인하십시오. 열 스트레스가 완료되면 온도를 다시 섭씨 23도로 낮추십시오.
온도 표시가 수동으로 조정되고 다시 초점을 맞출 때까지 기다립니다. 그런 다음 복구 단계에서 10분에서 20분 간격으로 8-10시간 동안 타임랩스 동영상을 녹화합니다. 첫 번째 시점을 획득하는 동안 초점이 올바른지 확인하십시오.
Cell Counter 플러그인이 장착된 이미지 처리 패키지를 열어 시작합니다. 명시야 이미지 스택을 불러오려면 File(파일)을 클릭한 다음 Open(열기)을 클릭합니다. 그런 다음 Cell Counter 플러그인을 열고 Initialize를 클릭하여 이미지 스택을 로드합니다.
해당 상자를 클릭하여 카운터 유형을 선택합니다. 그런 다음 총 셀 수를 계산하고 마커 저장을 클릭하여 마커를 저장하십시오. 마커가 저장되면 형광 이미지 하이퍼스택의 최대 투영을 로드합니다.
Cell Counter 플러그인을 열고 Load Markers를 클릭하여 마커를 로드합니다. 다음으로, cytosolic foci에 대한 marker 유형을 선택하고 세포를 계수합니다. 기존 마커는 개별 세포의 위치에 대한 지침으로 사용할 수 있습니다.
Results를 클릭하여 슬라이스당 카운트 수를 검색한 다음 추가 계산을 위해 다른 곳에 카운트를 저장합니다. 이 연구에서는 딕티오스텔리움 세포에서 GFP 태그가 지정된 폴리글루타민 단백질 Q103의 분포가 관찰되었습니다. 정상적인 성장 조건에서 Q103-GFP는 세포질에 확산 분포합니다.
열 스트레스 동안 Q103-GFP 마커는 구조물에 구멍을 뚫기 위해 합쳐집니다. 정상적인 성장 조건에서 응력이 방출되고 성장하면 이러한 구조가 용해됩니다. Q103-GFP의 재분포 및 열 스트레스 유도 세포질 병소의 형성은 이미지 분석을 사용하여 정량화됩니다.
열 스트레스 반응의 대표적인 결과를 여기에서 볼 수 있습니다. 세포질 Q103-GFP 병소를 가진 세포의 수는 지속적인 열 스트레스에 따라 증가합니다. 열 스트레스 동안에는 단백질 품질 관리 시스템에 과부하가 걸리므로 응집되기 쉬운 단백질을 용해성 상태로 유지할 수 없습니다.
열 스트레스 후에는 세포질 초점(cytosolic foci)을 가진 세포의 수가 감소하는데, 이는 응집된 단백질이 용해됨을 시사합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아메바 Dictyostelium discoideum에서 열 스트레스로 인한 섭동을 모니터링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이미징 전반에 걸쳐 현미경에 하드웨어 자동 초점이 없는 경우 초점이 적절하게 조정되었는지 확인하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜에 표시된 온도 제어는 열 스트레스 반응 분야를 넘어 사용할 수 있습니다. 온도 제어를 사용하여 정상적인 성장 조건에서 이미징하면 광독성 효과를 현저히 줄일 수 있습니다.
이 연구는 사회적 아메바인 Dictyostelium discoideum에서 온도 유발 단백질 응집 및 세포 스트레스 반응를 조사하기 위한 새로운 이미징 방법론을 제시합니다. 이 기술은 정밀한 온도 제어를 가능하게 하여 연구자들이 단백질 품질 관리에 대한 열 스트레스 효과를 관찰할 수 있게 합니다.
Temperature-controlled live cell imaging in Dictyostelium discoideum enables precise interrogation of protein quality control mechanisms under stress, supporting early-stage target validation for protein aggregation pathways. This approach enhances predictive confidence in mechanistic studies relevant to neurodegeneration and proteostasis. The method's ability to reduce phototoxicity and quantify dynamic protein aggregation provides actionable insights for portfolio triage in discovery biology.
This imaging protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical validation of protein aggregation targets.