단백질의 품질 관리 시스템을 공부

이 이미징 기법의 전반적인 목표는 Dictyostelium discoideum 세포에서 열 스트레스로 인해 유도된 세포 섭동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 아메바인 Dictyostelium discoideum의 열 스트레스 반응 및 단백질 품질 관리 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 이미징에 적용되는 온도를 엄격하고 정밀하게 제어할 수 있다는 점입니다.

절차를 시작하려면, 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 Dictyostelium 세포를 준비하십시오. 이미징 전날, 세포를 저형광 배지로 분할하여 mL당 10,000 cells가 되도록 하십시오. 이미징 전에 LFM이 담긴 조직 플레이트에서 세포를 수확한 다음, 적절한 수의 세포를 유리 바닥 배양 접시로 옮기십시오.

세포가 가라앉을 때까지 20분 동안 기다린 후, 가라앉지 않은 세포를 제거하기 위해 사용한 배지를 신선한 배지로 조심스럽게 교체합니다. 비스트레스 조건의 23°C에서 세포 이미지를 촬영하고, 최소 6개의 시야(field of view)를 확보합니다. 세포의 전체 부피를 캡처하기 위해 1~0.25 µm 간격으로 최대 7 µm의 Z-스택(Z-stacks)을 획득합니다.

그 다음, 전체 세포 수를 평가하기 위해 기준 명시야(bright field) 이미지를 획득합니다. 이어서 냉각 챔버의 온도를 30 °C로 조정합니다. 온도 표시창에 설정값이 도달하면, 명시야 채널에서 수동으로 초점을 다시 맞춥니다.

타임랩스를 시작하기 전에 기록된 모든 FOV를 확인한 다음, 시간 간격을 5~10분으로 설정하여 4시간 동안의 열 스트레스 타임랩스를 시작합니다. 처음 두 번의 시점 데이터를 획득하는 동안 초점이 정확한지 확인하십시오. 열 스트레스 처리가 완료되면 온도를 다시 23 °C로 낮춥니다.

온도 표시가 조정될 때까지 기다린 후 수동으로 초점을 다시 맞춥니다. 그 다음, 회복 단계에서 10~20분 간격으로 8~10시간 동안 타임랩스 영상을 기록합니다. 첫 번째 시점의 영상을 획득하는 동안 초점이 정확하게 맞았는지 확인하십시오.

Cell Counter 플러그인이 설치된 이미지 프로세싱 패키지를 실행하여 시작하십시오. File을 클릭한 다음 Open을 선택하여 명시야 이미지 스택을 불러옵니다. 이어서 Cell Counter 플러그인을 열고, Initialize를 클릭하여 이미지 스택을 로드하십시오.

적절한 상자를 클릭하여 카운터 유형을 선택하십시오. 그 후, 총 세포 수를 세고 Save Markers를 클릭하여 마커를 저장하십시오. 마커가 저장되면 형광 이미지 하이퍼스택의 최대 투영(maximum projection) 영상을 로드하십시오.

Cell Counter 플러그인을 열고 Load Markers를 클릭하여 마커를 불러옵니다. 다음으로, 세포질 초점(cytosolic foci)에 대한 마커 유형을 선택하고 세포 수를 측정합니다. 기존 마커를 개별 세포 위치의 안내 지표로 활용할 수 있습니다.

Results를 클릭하여 슬라이스당 카운트 수를 확인한 다음, 추가 계산을 위해 해당 카운트 값을 다른 곳에 저장하십시오. 본 연구에서는 Dictyostelium 세포 내에서 GFP가 태그된 폴리글루타민 단백질 Q103의 분포를 관찰하였습니다. 일반적인 성장 조건에서 Q103-GFP는 세포질에 확산되어 분포합니다.

열 스트레스 동안, Q103-GFP 마커는 점상 구조로 응집됩니다. 스트레스가 해제되고 일반적인 성장 조건에서 배양하면 이러한 구조는 용해됩니다. Q103-GFP의 재분포와 열 스트레스로 인해 유도된 세포질 초점의 형성은 이미지 분석을 통해 정량화됩니다.

열 스트레스 반응의 대표적인 결과는 여기에서 확인할 수 있습니다. 열 스트레스가 지속됨에 따라 세포질 내 Q103-GFP foci가 형성된 세포의 수가 증가합니다. 열 스트레스 동안에는 단백질 품질 관리 시스템에 과부하가 걸려, 응집되기 쉬운 단백질들이 가용성 상태로 유지되지 못합니다.

열 스트레스 이후 세포질 내 초점(cytosolic foci)을 가진 세포의 수가 감소하며, 이는 응집된 단백질이 용해됨을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 아메바인 Dictyostelium discoideum에서 열 스트레스로 유도된 섭동을 모니터링하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이미지 촬영 전반에 걸쳐, 사용 중인 현미경에 하드웨어 자동 초점 기능이 없다면 초점이 적절하게 조정되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

본 프로토콜에서 제시된 온도 제어 방법은 열 스트레스 반응 분야 외에도 활용될 수 있습니다. 온도 제어를 통해 일반적인 성장 조건에서 이미징을 수행하면 광독성 효과를 현저히 줄일 수 있습니다.