Name: 애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: 배우세요 지방이 풍부한 먹이를 이용한 Danio rerio 유충의 식이 지질 대사 연구 방법입니다. 형광 지질 유사체를 활용한 실시간 영상으로 지질 흡수 역학을 정량화하고 대사 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는 이미지를 제공해 준 Meng-Chieh Shen, 원고에 도움이 되는 설명을 제공해 준 Jennifer Anderson, 이러한 기술을 개발하는 데 기여한 Farber 연구소 구성원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 NIDDK-NIH 상 RO1DK093399(S.A.F.), RO1GM63904(제브라피시 기능 유전체학 컨소시엄: PI Stephen Ekker 및 Co-PI S.A.F) 및 F32DK096786(J.P.O.)의 지원을 받았습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation은 S.A.F 실험실과 Carnegie Institution for Science 기부금에 추가 지원을 제공했습니다.

이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다. 1. 동물 준비 <ol><li> 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드. </li><li> 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사용에 최적화되어 있습니다. 프로토콜은 다른 연령대와 배경의 유충에 대한 수정 될 수 있습니다. 외래 음식을 이전 6 DPF를 제공하지 않습니다. </li><li> 배아 매체 Tricaine (EM)와 유충 실온 (RT) (4 mg을 100 ㎖의 EM 당 / ㎖ Tricaine 4.2 ㎖) 마취. </li></ol> 지질이 풍부한 달걀 노른자 피드 2. 준비 <ol><li> 준비하고 닭고기 달걀 노른자를 저장합니다. 12 닭고기 달걀의 노른자와 흰색을 구분합니다. , 나누어지는 1 ml의 1.5에 노른자를 풀1 년에 -80 ° C 최대의 ML의 튜브, 저장 (12 노른자는 ~ 80 분취를 만들 것입니다). 백인, 저장 수영장, 지질 가난한, 단백질이 풍부한 사료로 사용합니다. </li><li> 원한다면 준비 형광 리피드 유사체 (들) 난황 사료에 첨가한다. <ol><li> 제조업체의 지침에 따라, 불투명 유리 튜브에 나누어지는 (다음 참고 용매를 논의 참조) / μL 0.1 μg의 100 % 에탄올 또는 100 % 클로로포름 구입, 분말 형광 지질 아날로그를 일시 중단 파라 필름으로 밀봉, 저장. 때문에 유기 용매의 빠른 증발에 장기 저장을 위해 ~ 400 μL 이하 분취 볼륨을 사용하지 않는다. 주 : 지질 아날로그 에탄올에 현탁하는 경우는, 클로로포름보다 N 2하에 빠르게 건조되므로 지질 아날로그 다량 사용한다. 지질 아날로그 에탄올에 현탁 경우 단계 2.2.4에서 리포솜 피드에 추가하기 전에 건조시키고, 재현 탁 될 수 없지만, 전체 에탄올 농도는 0을 초과하지 않아야한다.리포좀 피드의 1 % 에탄올 잠재적으로 혼란 생리 학적 효과를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 형광 지방산 유사체의 경우 : EM 20 mL의 5 % 난황 에멀젼의 총 부피를 준비한다. 그 라이브 공 초점 이미지 및 음식 섭취 분석 또는 1 μg의 / ㎖ 6.4 μM 4,4- 디 플루오로 -4- 보라 -3a, 4a- 디아 자 - S - 인다 센의 최종 농도 (BODIPY C 16)와 5 ml의 분취 량을 준비 입체 영상에 대한 BODIPY C (12). 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 형광 지질 아날로그 원하는 금액을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조. </li><li> 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 5 μL의 100 % 에탄올에 재현 탁을 95 μL의 EM을 추가하고, 잘 혼합한다. 참고 : 혼합물이 균질 나타납니다; 컬러 지질 튜브의 측면에 유지되거나 액체가 덩어리 진 나타나면 지질 완전히 용해 에탄올 등을 필요로하지 않았다. 이리저리 튜브를 보호얼음 m 빛과 상점. </li><li> 형광 콜레스테롤 아날로그의 경우 : 라이브 영상 연구를위한 5 ml의 0.5 % 달걀 노른자 에멀젼 2.4 μg의 / ㎖ 콜레스테롤의 최종 농도를 준비합니다. 1.5 ml의 플라스틱 튜브로 콜레스테롤의 정량을 전송. 튜브에서 지질을 날려 않도록주의하면서, N 2의 스트림에서 지질을 건조. </li><li> 즉시, 상기 튜브의 양쪽 다운 스트림을 피펫 정제 H 2 O. RT에서 1 %의 지방산이없는 BSA 85 μL와 혼합하여 RT 100 % 에탄올 15 μL에 재현 탁 빛으로부터 튜브를 보호하고 얼음에 저장합니다. </li></ol></li><li> 계란 노른자 리포좀 피드를 준비합니다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 EM에 달걀 노른자의 해동 나누어지는을 추가합니다. 1-2 분 동안 희석 된 난황 혼합물을 와동; 혼합물이 균질 한 에멀젼으로 나타납니다. </li><li> 새로운, 신선한 50 ML 원뿔 튜브에 단백질 대기업을 제거하고 수집하는 좋은 메쉬 스트레이너를 통해 혼합물을 붓고. </li><li> 펄스 SONICA리포좀을 만들 RT에서 :; 한 네 번째 인치 테이퍼 마이크로 팁과 (6 W 출력 강도 각 세트 사이에 5 ~ 10 초 일시 중지 5 회 (5 × 1 초, 1 초 오프)) 계란 혼합물을 테. 초음파기 전원 설정 종속 기기이며, 따라서 각각의 악기와 마이크로 팁에 대한 최적화를 필요로한다. 주 : 계속 사용할 때까지 동질성을 유지하기 위해 RT에서 리포좀 혼합물을 흔들어. </li></ol></li><li> 원하는 경우, 달걀 노른자 리포좀에 형광 지질 아날로그를 추가합니다. 즉시 초음파 처리 한 후, 리포솜에 통합 30 초 동안 고속으로 리포솜 혼합물 소용돌이로 제조 된 지질 피펫. 호일에 튜브를 배치하여 빛의 혼합물을 보호하고 실온에서 락을 계속합니다. </li></ol> 3. 수유 패러다임 <ol><li> 먹이의 애벌레를 준비합니다. <ol><li> 공급을 방해 할 수 명백한 형태 학적 결함에 대한 공급, 화면 애벌레를 시작하기 전에. 60mm X 15mm 페트리 접시 또는 6 또는 12도 괞 찮아로 전송 애벌레TES, EM 최소로 감소시키고, 제조 된 리포좀 용액 5 ㎖로 교체한다. </li><li> 필요한 경우, EM 5 ML의 EM 및 / 또는 5 ml의 5 % 달걀 흰색에 unfed 제어 유충을 전송하고 병렬로 처리합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 형광 지질 유사체가있는 경우 빛으로부터 보호하기 위해 계속하는 동안 음식 섭취를 장려하기 위해 공급 전반에 걸쳐 배양 로커의 유충 (30 rpm에서 29 ~ 31 °의 C를) 바위. 애벌레 필요가 빛에 노출 될 경우, 착색 유리 인큐베이터 덮개 노출을 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 공급 기간의 끝에서, EM 3 회 자유롭게 수영 유충을 헹군다. 참고 : 애벌레 피드 동안 어느 시점에서 리포좀을 소비 시작할 수 있습니다. 이 유충이 동시에 공급하기 시작하는 것이 중요한 경우, 음식 섭취에 대한 화면 급전 1 시간 후 (3.4 참조) 공급을 완료 난황 에멀젼 공급을 개시 한 경우에만 애벌레를 반환한다. </li><li> 소수로 음식 섭취량이 시점에서 유충 화면 EA 않을 수도t (일반적 ~ 0~5%). 그들이 공급 한 경우 결정하기 위해 얼음에 금속 블록에 마취 또는 약간 냉각 된 유충의 장을 검사 : 리포좀을 섭취 한 유충은 어두운 소장 (그림 1)을해야합니다. </li><li> 바로 음식 섭취에 대한 이미지 또는 공정 애벌레. 또는, 장소 신선한 EM의 유충 및 28 ° C에서 부화 대사 처리가 발생 할 수 있습니다. </li></ol> 라이브 영상에 대한 유충을 설치 (4) <ol><li> 장착 미디어를 준비합니다. <ol><li> 3 % 메틸 셀룰로오스의 경우 : -20 ° C에서 년 동안 근처 끓는 EM, 소용돌이, 4 ° C에서 2~3일 완전히 용해 될 때까지 실온에서 바위, 저장 25 ml의 0.75 g의 메틸 셀룰로오스를 추가합니다. 4 ° C에서 동결 융해의 반복주기는 공기 방울을 제거합니다. 애벌레를 설치하는 동안 얼음에 3 % 메틸 셀룰로오스를 저장합니다. </li><li> 1.2 % 낮은 마운트 아가로 오스의 경우 : 0.3 g 추가 25 ㎖ EM에 아가로 오스 낮은 용융 및 2 ML의 t에 종기, 나누어지는로 가져 와서 용해ubes, 그리고 열 블록에 26 ~ 28 ℃로 유지한다. 미사용 분취 량을 RT에서 저장 또는 -20 ° C 및 사용시에 다시 비등 될 수있다. 아가로 오스는 유충에 노출하거나 가열을 통해-수 있습니다 전에 처리 할 수있을만큼 멋진 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 낮은 배율, 중간 처리량 라이브 영상의 경우, 얼음에 금속 블록에 조직에 유리 슬라이드를 배치하고 슬라이드가 식을 때까지 기다립니다. 에 붙어 낚시 줄 포커를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스에 유충을 전송, 슬라이드에 (얼음에 4 ° C로 유지 된) 3 % 메틸 셀룰로오스의 충분한 양을 적용 (0.41 mm 직경의 낚시 줄 유리 모세관의 끝)이 메틸 셀룰로오스 희석되지 않는다 (따라서 과잉 EM 드레인) 및 원하는대로 유충 위치로 약속하다를 생성한다. </li><li> 단기 (&lt;20 분)의 경우, 수직 오일 에멀젼의 목적으로 고배율 라이브 영상은, 방법 희박로 커버 슬립과 애벌레를 탑재합니다. <ol><li> 에 시아 노 아크릴 레이트 기반의 접착제 (순간 접착제)를 사용하여유리 슬라이드의 일단에 AA 22mm X 30mm의 coverslip에 연결합니다. 커버 슬립에 인접한 슬라이드에 3 % 메틸 셀룰로오스의 세선을 넣어 전체 보어 파스퇴르 피펫으로 슬라이드에 유충을 전송 포커를 사용한다. 는 메틸 셀룰로오스를 희석되지 않도록 초과 EM을 제거합니다. </li><li> 포커를 사용하여 부드럽게 커버 슬립 옆에 그들의 머리와 함께 (오른쪽 이미지에 담낭을 측면이 위로 간 더 많은 이미지 왼쪽) 자신의 양쪽에있는 메틸 셀룰로오스에 애벌레를 놓습니다. </li><li> 부드럽게 두 번째 커버 슬립의 코너에서 스팟 순간 접착제는 애벌레를 브리징, 장착 된 커버 슬립에 커버 슬립 및 슬라이드의 다른 한쪽 끝을 배치합니다. 이 단계 동안이나 그 유충이 손상되지 않은 상태로 유지하면서 이미지 있도록 목적으로 과잉 압력을 적용하지 않도록 조심해서. </li></ol></li><li> 장기의 경우, 수직 침지 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스에 애벌레를 탑재합니다. 아가로 오스 다음 전송 1.2 % 낮은 용융의 작은 나누어지는에 유충을 추가배양 접시에 아가로 오스의 작은 볼륨에서 애벌레. <ol><li> 빨리 아가로 오스 응고 전에 포커와 애벌레를 놓습니다. 아가로 오스는 2 ~ 3 분 동안 건조 건조되는 것을 방지하기 위해 신선한 EM 완벽 아가로 오스를 포함 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장기의 경우, 역 목적으로 고배율 영상은, 아가로 오스의 유리 바닥 접시에 애벌레를 탑재합니다. <ol><li> 얼음에 금속 블록 쿨. 과도한 냉각 및 유충의 동결을 방지하기 위해 조직에 의해 분리 된 금속 블록에 접시를 놓습니다. 접시에 애벌레를 전송하고 티슈로 위킹하여 EM을 제거합니다. </li><li> 유충의 상단에 28 ° C 낮은 용융 아가로 오스 (1.2 %)의 하락을 놓고 즉시 포커 (아래 최상의 이미지에 왼쪽 간, 아래로 담낭 이미지 오른쪽)에 위치. 추위 블록에서 요리를 제거 2 ~ 3 분 동안 건조 할 수 있도록하고, 아가 로스를 커버하는 신선한 EM의 충분한 볼륨을 추가 (~ 2-5 ㎖). </li></ol></li></ol> 5. 식품 섭취시험 <ol><li> 6.4 μM BODIPY C 16 함유 난황 리포솜 공급의 마지막에, 플라스틱이 1.5 ㎖의 튜브 10 세정 유충 최소 EM 풀을 제거하고 동결 스냅. 샘플을 몇 달 동안 빛으로부터 보호 -80 ° C에서 저장 될 수있다. 참고 : 가능하면 여러 복제를 수집합니다. (사용되는 동일한 클러치에서 이상적으로 유충) 배경 지질 형광에 대한 정상화를이 단계에서 unfed 애벌레를 수집하는 것이 중요하다. </li><li> 수정 후 Bligh-다이어 지질 추출 3,21을 수행합니다. <ol><li> 얼음 샘플 (2 O를 사용할 수 있습니다 대안 정제 H) 100 ㎕를 균질화 버퍼 (20 mM 트리스 - CL, 1 mM의 EDTA)를 추가합니다. (1 초 오프 1 초 5 초 총)는 마이크로 팁의 초음파기와 얼음에 균질화. 그 애벌레 완전히 균질화를 확인; 하지 않을 경우, 반복합니다. 13 ml의 일회용 유리 배양 관에 전송 (다른 유리관이 사용될 수있다). 참고 : 클로로포름은 위험합니다; 이후의 모든 지질 전을 수행화학 후드에서 실온에서 견인 단계. </li><li> (: 메탄올 클로로포름) 2 : 사용 균질화 버퍼의 각 100 μL, 1의 375 μl를 추가합니다. 소용돌이 30 ~ 60 초, 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 당 클로로포름, 소용돌이 30 초 125 μl를 추가, 10 분을 품어. </li><li> 200 mM 트리스 산도의 125 μl를 추가 7.5 사용 100 ㎕를 균질화 버퍼 (빛으로부터 보호 2,000 X g, 5 분, RT) 소용돌이 30 초, 원심 분리기 당. 조심스럽게 원심 분리기에서 샘플을 제거합니다. 상부상은 수성이다 유생 파편의 인터페이스 및 하부 유기상 (지질을 포함)은 이들 두 개의 단계로 구분된다. </li><li> 깨끗한 유리 피펫 하단 유기상을 수집하고 깨끗한 13 mL 유리 튜브로 옮긴다. 주 : 계면의 성상 및 유생 파편을 피하기 위해주의; 오염이 발생하는 경우, 원심 분리 단계 및 배열 회수 반복한다. 상단, 수성 상을 폐기; 그것을 제거하고이를 폐기하는 것이 도움이 될 수 있습니다유기상을 수집하기 전에 단계. 샘플 1 개월까지 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 빛으로부터 보호하면서 진공 유기상 (0.12 기압)을 건조. 이 지질 용해도가 감소하므로 액체가 증발 후 샘플을 건조 계속하지 마십시오. 2의 지질을 재현 탁 : 얼음에 저장 : 1 (메탄올 클로로포름). 클로로포름의 최적 량 : 메탄올 용액을 사용하는 측정 방법에 따라, 낮은 시작하고 필요에 따라 희석을 계속합니다. 일반적인 지침은 10 풀링 유충 10 μl를 사용하는 것입니다. </li></ol></li><li> 채널 화 TLC 판에 균등 간격으로 전체 샘플 볼륨을 파악하고 정기적으로 생체 분자 영상 (예를 들어, 형광 플레이트 리더)에 사용되는 레이저 스캐너와 함께 접시를 검사합니다. 510-665 nm 내지 500-650 nm의 최대 발광의 여기 최대 값을 가진 물질의 목록에 포함 된 형광 리피드 유사체를 들어, 520 nm의 발광 회수를 가진 488 nm의 레이저를 사용하여. <ol><li> 이미징 소프트웨어 각 스폿의 총 형광 정량화. 참고 : 자연스럽게 쌍, unfed 애벌레 샘플의 형광을 뺀 배경 지질 형광을 발생에 대한 올바른. </li></ol></li></ol>

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여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수행합니다. 낮은 공급 속도 미만 6 음식 섭취 (즉, 턱 또는 소장 기형, 제대로 수영을 할 수없는)을 방해 발달 돌연변이 내생 노른자 에너지 공급, 건강에 해로운 고기, 생선 남아와 DPF 물고기를 관찰 할 수있다. 자신의 내생 노른자 저장이 소진되고 노른자 고갈이 소화 시스템을보다 효율적으로 시각화 할 수 있습니다 때까지 애벌레 외래 음식을 필요로하지 않기 때문에 파버 연구소는 일반적으로 6~7일 게시물 수정 (DPF)에 공급하는 연구를 수행한다. 급송RT에서도 크게 먹는 애벌레의 수를 줄일 수 있습니다. 음식 섭취량과 결과를 혼...

소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다. 제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, - 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7), 심혈관 질환 (8) 모델의 다양한 당뇨 9, 10, 간 지방증 11-13, 비만 14-16, 신진 대사 통찰력의 호스트를 제공하기 위해 등장하고있다. 대사 연구로 유생 전환 지브라 피쉬의 중요한 양태는 제브라 피쉬와의 고유의 장점을 활용할 새로운 분석법의 개발에 다른 모델 동물 개발 기술의 최적화이다. 이 프로토콜은 기술이 LIPI 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기 위해 개발 및 최적화 제공D가 풍부한 식사, 세포 내 해상도로 몸 전체에서식이 지질 처리를 시각화하고, 음식 섭취를 측정한다. 그것은 지방과 콜레스테롤 (지질이 ~ 닭 계란, 60 %가 중성 지방은 콜레스테롤입니다 ~ 5 %가되는 노른자, 35 %의 58 %는 인지질이 구성의 높은 수준을 포함로 닭고기 달걀 노른자는 지방이 풍부한 식사를 구성하기 위해 선택되었다 ). 제브라 피쉬 사료 및 먹이 연대는 랩 17에서 표준화되지 않은으로 닭고기 달걀 노른자는 전형적인 상업 제브라 피쉬 micropellet 식품 (~ 15 %의 지질)과 특정 지방산 종의 알려진 비율과 표준화 공급되는 장점보다 더 많은 지방을 제공합니다. 또한, 달걀 노른자에서 제공하는 형광 지질 유사체는 박층 크로마토 그래피를 통해 신진 대사를 조사, 운송 및식이 지질 (18)의 축적과 같은 중요한 염료 3 복잡한 지질에 공유 결합을 통해 모두 작용하여 지질 방울 포함 이미지 세포 성분을 시각화 (TLC) (19) </sup&gt; 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) (SAF 미발표 데이타), 총 음식 섭취 20 정량적 분석을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄술로프네이트 염)</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040-25G</td><td>유충 제브라피</td></tr>쉬 <tr><td>마취 닭고기 달걀</td><td>해당 없음</td><td></td><td>유기농, 케이지 프리 달걀, 오메지-3 지방산에 농축되지 않음</td></tr><tr><td>초음파 처리기 3000 초음파 처리기</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>달걀 노른자 리포좀을 만들기 위해</td></tr><tr><td>Sonabox 음향 인클로저</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>달걀 노른자 리포솜</td></tr><tr><td>1/8" 테이퍼 마이크로팁</td><td>Misonix, Inc.를</td> 만들기 위해<td>419</td><td>달걀 노른자 리포솜을 만들기 위해</td></tr><tr><td>호박색 바이알 (4 ml, 유리)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>지질 저장; 바이알, 오픈-탑 캡, 캡 셉타</td></tr><tr><td>포함 Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>벤치마크</td><td>1222U12</td><td>사료용 인큐베이션 쉐이커</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-헥사데칸노산)</td></tr><tr><td>바디피 FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-도데판산)</td></tr><tr><td>바디피 FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜탄산)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>형광 지질 유사체; (4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산)</td></tr><tr><td>TopFluor 콜레스테롤&nbsp;</td><td>아반티 폴라 지질 Inc.</td><td>810255</td><td>형광 지질 유사체; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td></tr><tr><td>지방산-무료 BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td><td>TopFluor 콜레스테롤 용해화용</td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>살아있는 애벌레 이미징을 위한 마운팅 미디어; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>살아있는 애벌레용 마운팅 미디어 이미징; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR 현미경 슬라이드&nbsp;</td><td>폭스바겐&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>라이브 이미징을 위한 마운팅 애벌레</td></tr><tr><td>Coverslips&nbsp;</td><td>커버 유리</td><td>12-544A</td><td>라이브 이미징을 위한 마운팅 애벌레</td></tr><tr><td>슈퍼 글루</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>라이브 이미징을 위한 마운팅 애벌레</td></tr><tr><td>FluoroDish (유리 바닥 접시)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>실시간 이미징을 위한 장착 애벌레; 35 mm 접시, 23 mm 유리, 0.17 mm 유리 두께&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>현미경은 고배율 라이브 이미징을 위한</td></tr><tr><td>스테레오스코프</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td> 현미경을 사용합니다. 저<td>배율 라이브 이미징을 위한</td></tr><tr><td>유리 배양 튜브&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>지질 추출; (13 x 100mm, 13ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 플러스&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>지질 추출</td></tr><tr><td>채널 TLC 플레이트</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>식품 섭취 분석; LK5D 실리카겔 150A, 20 x 20cm, 250um 두께; 단종</td></tr><tr><td>채널 TLC 플레이트</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>식품 섭취 분석; Whatman Scientific TLC 플레이트의 직접 교체</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 가변 모드 이미저</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>식품 섭취 분석용 형광판 판독기</td></tr><tr><td>ImageQuant 소프트웨어</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>식품 섭취 분석</td></tr><tr><td>분석 5 3/4' 넓은 구멍, 보로실리케이트 일회용 파스퇴르 피펫&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>이송 유충</td></tr></tbody></table>

애벌레 zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 모델로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 유충 제브라피쉬에게 배아 배지에서 달걀 노른자를 초음파 처리하여 생성된 닭고기 달걀 노른자 리포솜의 에멀젼으로 구성된 지질이 풍부한 식사를 먹이는 방법을 설명합니다. 먹이를 먹지 못한 유충이 실험 결과를 혼동하지 않도록 유충의 달걀 노른자 섭취를 선별하기 위한 자세한 지침이 제공됩니다. 닭 달걀 노른자 리포좀에는 지방산 및 콜레스테롤을 포함한 형광 지질 유사체가 첨가될 수 있어 식이 지질 처리의 전신 및 세포 내 시각화가 가능합니다. 고배율 및 저배율에서 직립 및 반전 대물렌즈를 모두 사용하여 단기 및 장기 라이브 이미징에 도움이 되는 유충을 장착하기 위한 몇 가지 방법이 설명됩니다. 또한 형광 지질 유사체를 먹인 유충의 지질을 추출하고, 박층 크로마토그래피 플레이트에서 지질을 발견하고, 형광을 정량화하여 유충 먹이 섭취량을 정량화하는 분석법이 제시되어 있습니다. 마지막으로, 절차의 중요한 측면, 중요한 제어 항목, 특정 실험 질문을 해결하기 위해 프로토콜을 수정하는 옵션 및 잠재적 제한 사항에 대해 논의합니다. 이러한 기술은 집중적이고 가설에 기반한 조사뿐만 아니라 식이 지질 대사 및 음식 섭취 조절을 연구하기 위한 다양한 화면 및 실시간 이미징 기술에도 적용할 수 있습니다.

29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54735/54735fig1.jpg" /> 그림 1 :. 식품 섭취를 위해 애벌레를 선별 야생 타입 6-DPF 유충은 2 시간 동안 EM 5 % 달걀 노른자를 공급 또는 unfed 컨트롤을 얻기 위해 EM에서 병렬로 처리 하였다. 입체경에 10 배에서 몇 군데 때 계란 노른자를 섭취 한 먹이 애벌레 어두운 장을하면서 Unfed 유...

제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 중요한 모델로 부상하고 있습니다. 지질이 풍부한 유충 사료의 프로토콜, 식이 형광 지질 유사체의 실시간 이미징 및 음식 섭취의 정량화가 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 다양한 스크리닝, 이미징 및 가설 기반 조사 기술에 적용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

본 실험 프로토콜의 전반적인 목적은 제브라피시 치어에게 형광 지질 유사체를 첨가할 수 있는 지질 풍부 식단을 급여함으로써, 치어의 시각적 지질 흡수 역학을 관찰하고 식이 지질 섭취량을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 식이 지질이 어떻게 대사되는지, 그리고 음식 섭취가 어떻게 조절되는지와 같이 대사 및 위장 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 지질 유사체를 식이 리포좀을 통해 효율적으로 전달할 수 있다는 점입니다.제브라피쉬 유충의 광학적 투명성 덕분에 현미경을 통해 세포 내 지질 처리 과정을 밝혀낼 수 있습니다. 먼저, 분말 형태의 형광 지질 유사체 1 mg을 100% chloroform 2 mL에 현탁하여 최종 농도를 0.5 µg/µL로 맞춥니다. 이 유사체를 테플론 가스켓이 포함되어 있고 용매와 호환되는 스크루 캡이 달린 갈색 유리 튜브에 소분하여 담습니다.이 스톡들을 냉동고에 보관하십시오. 0.5 µg/µL 형광 지질 아날로그 스톡 10.4 µL를 1.5 mL 튜브에 넣고, 지질이 튜브 밖으로 튀어나가지 않도록 주의하며 질소 기류 하에서 건조시킵니다. 건조된 지질을 100% ethanol 5 µL로 즉시 재현탁시키되, 튜브 벽면을 따라 천천히 피펫팅하여 가하십시오.그 다음, 배아 배지 95 µL를 첨가하고 혼합물이 균질해 보일 때까지 피펫팅으로 충분히 섞어줍니다. 튜브를 빛으로부터 차단하고 필요할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 형광 콜레스테롤 리포좀 용액을 만들려면, 난황 에멀젼에 첨가했을 때 최종 농도가 2.5 µg/mL가 되도록 1.5 mL 튜브에 충분한 양의 형광 콜레스테롤 유사체 스톡을 넣습니다.이전과 같이 질소 기류 하에서 콜레스테롤 스톡을 건조합니다. 튜브 벽면을 따라 천천히 분주하여 상온의 100% ethanol 15 µL에 형광 콜레스테롤 유사체를 즉시 재현탁합니다. 그리고 1% fatty acid free BSA 및 물 85 µL와 혼합합니다.지질이 사료 내에 균일하게 분포되고 모든 유충이 고르게 섭취할 수 있도록, 형광 지질 유사체를 난황 에멀젼에 첨가하기 전에 에탄올과 배아 배지에 완전히 용해시키는 것이 필수적입니다. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 얼음 위에 보관하십시오. 급이 용액을 만들려면 50 mL 원추형 튜브에 배아 배지 19 mL를 넣은 다음, 난황 분취액 1 mL를 추가하십시오.혼합물을 1~2분 동안 볼텍싱하여 균질한 에멀젼을 만듭니다. 미세 체에 혼합물을 부어 단백질 응집물을 제거하고, 이를 새 50 milliliter 원심분리관에 수집합니다. 다음으로, 6 watts의 출력과 1/4 inch 테이퍼드 마이크로팁을 사용하여 달걀 혼합물을 1초 작동, 1초 정지 방식으로 5회 펄스 초음파 처리합니다.초음파 처리 프로그램을 4회 더 반복합니다. 이를 통해 리포좀이 생성되며, 균질성을 유지하기 위해 사용 전까지 지속적으로 쉐이킹(rocking)해야 합니다. 초음파 처리 직후, 리포좀 혼합물 5 mL에 적절한 양의 형광 지질 유사체를 첨가합니다.형광 지질 유사체가 리포좀에 통합되도록 고속으로 30초 동안 볼텍싱합니다. 튜브를 호일로 감싸 혼합물을 빛으로부터 보호하고, 다시 로커에 놓습니다. 피딩 디쉬에 유충 50마리를 넣고, 배아 배지를 제거한 후 먹이 5 milliliters를 추가합니다.먹이 섭취를 촉진하기 위해, 인큐베이터 내의 로커(rocker)에서 유충을 부드럽게 흔들어 주며, 형광 지질 유사체를 사용하는 경우 빛을 차단하십시오. 먹이 공급 기간이 끝나면, 5 mL의 배아 배지(embryo medium)로 유충을 세 번 세척합니다. 유충을 고정시키려면, 금속 블록을 얼음 위에 놓고 과도한 냉각을 방지하기 위해 그 위에 티슈를 덮은 다음, 배아가 담긴 디쉬를 그 위에 올려 냉각시키십시오.해부 현미경 하에서 10배율로 유충을 관찰하여, 리포좀 먹이를 섭취한 유충을 판별합니다. 리포좀을 섭취한 유충은 장이 어둡게 변색됩니다. 장의 변색 여부를 확인하여 유충의 섭식 여부를 판단하는 것이 매우 중요합니다.일반적으로 유충의 1~5%는 먹이 활동을 하지 않으며, 이를 식별하여 제거하지 않으면 실험 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 도립 렌즈를 이용한 장기간의 고배율 이미징을 위해서는, 먼저 얼음 위에 놓인 금속 블록에서 유충을 냉각시킵니다. 유충을 유리 바닥 접시로 옮긴 후, 티슈로 흡수시켜 배아 배지를 제거합니다.42 °C의 저융점 1.2% agarose 한 방울을 유충 위에 떨어뜨리고, 즉시 포커(poker)를 사용하여 위치를 잡습니다. 콜드 블록에서 디쉬를 꺼내 agarose가 2~3분 동안 굳도록 둡니다. 마지막으로, agarose를 덮어 건조를 방지할 수 있을 만큼 충분한 양의 신선한 배아 배지를 추가합니다.이제 시료를 이미징할 준비가 되었습니다. 리포좀 공급이 끝나면, 세척된 유충을 최소 10마리 이상 1.5 milliliter 튜브에 모읍니다. 배아 배지를 제거한 후 유충을 급속 냉동시킵니다.대조군으로서 먹이를 주지 않은 유충 10마리를 사용하여 별도의 튜브에서 동일하게 반복합니다. 샘플을 얼음 위에 둔 상태에서, 각 튜브에 100 µL의 균질화 버퍼를 첨가한 다음 마이크로팁 소니케이터로 균질화합니다. 균질화된 조직을 13 mL 배양 튜브로 옮깁니다.각 균질화 버퍼 슬러리에 1:2 클로로포름:메탄올 혼합물을 375 µL씩 첨가합니다. 30~60초 동안 볼텍싱한 후, 상온에서 10분간 배양합니다. 클로로포름 125 µL를 추가로 첨가하고 30초 동안 볼텍싱합니다.다음으로, 200 millimolar TRIS pH 7.5를 125 µL 첨가하고 30초 동안 볼텍싱한 후, 빛을 차단한 상태에서 2000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 분리된 층이 섞이지 않도록 주의하며 원심분리기에서 샘플을 꺼냅니다. 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 하단의 유기층을 수집하고 이를 깨끗한 13 mL 유리 튜브로 옮깁니다.상층의 수성 층이나 중간의 유충 잔해 층이 옮겨지지 않도록 주의하며 이를 제거합니다. 빛을 차단한 상태에서 0.12 기압의 진공 하에 유기 층을 건조시키되, 액체가 모두 증발하면 즉시 중단하십시오. 단일 샘플을 2:1 비율의 chloroform과 methanol 혼합액 10 µL에 재현탁하고, 샘플 전체 부피를 채널이 있는 박층 크로마토그래피 플레이트에 점적합니다.나머지 시료들에 대해서도 일정한 간격으로 점적하여 동일하게 반복합니다. 마지막으로, 형광 플레이트 리더를 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 실험 조건 하에서 로커(rocker) 위에서 사육된 유어의 장을 관찰하면, 난황 에멀젼을 섭취한 어류의 전형적인 특징인 장의 암색화가 나타납니다.먹이를 공급하지 않은 유충은 보통 장이 투명하므로, 급이 기간 동안 사료 배지를 섭취하지 않은 개체는 쉽게 구별할 수 있습니다. 형광 지질 유사체를 섭취한 유충은 이러한 식이 지질의 운송 및 축적 과정을 시각화합니다. 본 실험에서는 급이 8시간 후 소화 기관 전체에서 형광 신호가 관찰됩니다.다양한 지질 유사체는 복합 지질로 서로 다르게 대사되기 때문에, 서로 다른 고유한 세포 구조에 통합되어 이를 시각화합니다. 본 연구에서 Fluorescent-C16 및 C12 유사체는 지질 방울을 표지합니다. Fluorescent-C5는 간관 및 췌관, 지질 방울, 세포막, 그리고 동맥 네트워크를 표지합니다.Fluorescent-C2 유사체는 간관, 췌관 및 세포막을 표지합니다. 야생형 유충과 Apolipoprotein A4B1을 과발현하는 형질전환 유충의 섭식 활동을 연구하기 위해 유충 먹이 섭취 분석을 수행하였으며, 4시간의 섭식 기간 동안 형질전환 유충이 야생형보다 적게 먹는 것을 확인하였습니다. 교배군은 짝을 이룬 굶주린 대조군 유충을 사용하여 표준화하였습니다.급여 후 Apo A4를 과발현하는 야생형 및 형질전환 유충의 형광을 정량화한 결과, 야생형과 비교하여 형질전환 유충의 섭취량이 유의미하게 감소한 것으로 나타났습니다. 숙련되면 난황 형광 지질 유사체 먹이를 약 15분 만에 준비할 수 있습니다. 먹이 섭취량은 10~12개의 풀링된 샘플로부터 약 4시간 내에 정량화할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, 기형 턱, 미발달된 장 또는 운동성 저하와 같이 먹이 섭취를 저해할 수 있는 발달 결함이 있는지 유충을 선별하는 것이 중요합니다. 특정 단백질과 세포 신호 전달 경로가 먹이 섭취 및 지질 대사를 어떻게 조절하는지와 같은 추가적인 의문에 답하기 위해, 약물 처리나 게놈 편집과 같은 방법들을 이 실험 프로토콜에 통합할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 위장관 생리학 및 세포 생물학 분야의 연구자들이 제브라피쉬 유충에서 식이 지질의 운반 및 축적을 시각화할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청한 후, 지질이 풍부한 제브라피시 유충 먹이 준비 방법, 먹이 섭취 여부에 따른 유충 스크리닝, 단기 및 장기 이미징을 위한 유충 마운트 방법, 그리고 먹이 섭취량 정량화 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 초음파 분쇄기(sonicator) 사용은 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 반드시 청력 보호구를 착용해야 합니다.

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

본 연구에서는 표준 배아 미세주입 및 실체현미경 장비를 활용한 제브라피쉬 치어의 새로운 미세강제투여(microgavage) 방법을 제시합니다. 우리는 미세강제투여가 다양한 물질을 제브라피쉬 치어의 장관 내로 정밀하게 정량 투여하는 데 유용한 안전하고 효율적인 기술임을 입증합니다.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

이 비디오는 제브라피시 유충의 회피 및 도둑 모타시스 분석을 설명합니다. 이 비디오는 시각적 혐오 자극에 반응하는 제브라피시 유충의 행동을 조사합니다.

제브라피시 회피 및 티그모타시스 분석: 혐오스러운 시각적 자극에 대한 반응으로 유충의 행동을 조사하는 고처리량 방법

우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

여기, 선물이 애벌레 zebrafish fathead 미노 운동 활동 및 photomotor 응답 (PMR) 자동된 추적 소프트웨어를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 공통 통합 독성 생물 검정, 이러한 행동의 분석 화학 bioactivity를 검사 하는 진단 도구를 제공 합니다. 이 프로토콜은 카페인, 모델 neurostimulant를 사용 하 여 설명 합니다.

애벌레에서 행동 응답 프로필을 조사 하기 위한 실험 프로토콜: 신경 흥분 제 카페인에 응용

이 프로토콜의 목표 높은 처리량 패션에 애벌레 zebrafish의 용기를 통해 붙일 레이블 음식의 통과 시간을 측정 하는 것입니다.

애벌레 Zebrafish를 사용 하 여 창 자 환승 시간의 높은 처리량 측정

Zebrafish (Danio rerio) 널리 사용 된 척추 동물 모델 미생물 식민과 병에 대 한 되 고 있다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레에 식품을 매개로 감염에 대 한 차량으로 Paramecium caudatum protozoan의 사용을 설명합니다. P. caudatum 쉽게 박테리아를 유입 하 고 애벌레 zebrafish 자연 먹이 행동에 의해 촬영 얻을.

Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

여기에서는 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경 및 면역 세포 환경에 미치는 영향을 연구하기 위해 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 관련 간세포 암종 (HCC) 제브라 피쉬 모델을 생성하는 방법을 제시합니다.

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

배우세요 지방이 풍부한 먹이를 이용한 Danio rerio 유충의 식이 지질 대사 연구 방법입니다. 형광 지질 유사체를 활용한 실시간 영상으로 지질 흡수 역학을 정량화하고 대사 질환 연구에 활용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

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