애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 중요한 모델로 부상하고 있습니다. 지질이 풍부한 유충 사료의 프로토콜, 식이 형광 지질 유사체의 실시간 이미징 및 음식 섭취의 정량화가 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 다양한 스크리닝, 이미징 및 가설 기반 조사 기술에 적용할 수 있습니다.

이 실험 프로토콜의 전반적인 목표는 유충 제브라피시에게 형광 지질 유사체로 스파이크할 수 있는 지질이 풍부한 식사를 제공하여 유충을 시각적 지질 흡수 역학에 장착하고 식이 지질 섭취량을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 식이 지질이 대사되는 방법 및 음식 섭취가 조절되는 방법과 같은 신진대사 및 위장 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 지질 유사체가 식이 리포좀에서 효율적으로 전달될 수 있다는 것입니다.

유충 제브라피시(Zebrafish)의 광학적 투명도는 현미경 검사를 통해 세포 내 지질 처리를 밝힐 수 있습니다. 먼저 100% 클로로포름 2밀리리터에 분말 형광 지질 유사체 1mg을 현탁시켜 마이크로리터당 0.5마이크로그램의 최종 농도를 만듭니다. 테프론 개스킷이 포함된 용매와 호환되는 나사 캡이 있는 호박색 유리관에 유사체를 분주합니다.

이 재고는 냉동실에 보관하십시오. 1.5 밀리리터 튜브에 0.5 마이크로그램 형광 지질 유사체 스톡 10.4 마이크로리터를 첨가하고 튜브에서 지질을 불어내지 않도록 주의하면서 질소 흐름 아래에서 건조시킵니다. 건조된 지질을 5마이크로리터의 100% 에탄올에 튜브의 측면을 따라 피펫으로 주입하여 즉시 재현탁합니다.

그런 다음 95마이크로리터의 배아 배지를 추가하고 혼합물이 균일하게 나타날 때까지 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다. 튜브를 빛으로부터 보호하고 필요할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 형광 콜레스테롤 리포좀 용액을 만들려면 1.5 밀리리터 튜브에 충분한 형광 콜레스테롤 아날로그 스톡을 첨가하여 달걀 노른자 에멀젼에 첨가할 때 밀리리터당 2.5마이크로그램의 최종 농도를 만듭니다.

이전과 같이 질소 흐름으로 콜레스테롤 저장고를 건조시킵니다. 즉시 형광 콜레스테롤 유사체를 15 마이크로 리터의 실온 100 % 에탄올에 튜브 측면으로 스트림을 피펫으로 주입하여 재현 탁엽시킵니다. 그리고 85 마이크로 리터의 1 % 지방산이없는 BSA 및 물과 혼합하십시오.

계란 난황 에멀젼에 첨가하기 전에 에탄올 및 배아 배지에서 형광 지질 유사체를 완전히 용해시켜 사료 내 지질의 균일한 분포와 모든 유충에 대한 균일한 가용성을 보장하는 것이 중요합니다. 호일로 튜브를 빛으로부터 보호하고 얼음 위에 보관하십시오. 수액을 만들기 위해 50ml 원뿔형 튜브에 19ml의 배아 배지를 추가한 다음 1ml의 달걀 노른자 분취액을 추가합니다.

혼합물을 1-2분 동안 와류로 처리하여 균일한 에멀젼을 만듭니다. 미세한 여과기에 혼합물을 부어 단백질 덩어리를 제거하고 새로운 50ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 다음으로, 6와트에서 1/4인치 테이퍼 마이크로팁으로 계란 믹스를 1초 켜기, 1초 끄기, 5회 펄스 초음파 처리합니다.

초음파 처리 프로그램을 네 번 더 반복합니다. 이것은 리포솜을 생성하며, 이제 균질성을 유지하기 위해 사용할 때까지 지속적으로 흔들어야 합니다. 초음파 처리 직후 5 밀리리터의 리포좀 혼합물에 적절한 양의 형광 지질 유사체를 첨가하십시오.

형광 지질 유사체를 리포좀에 통합하기 위해 30초 동안 고속으로 소용돌이칩니다. 튜브를 호일로 싸서 혼합물을 빛으로부터 보호하고 로커에 다시 넣으십시오. 먹이 접시에 50 마리의 유충을 넣고 배아 배지를 제거한 다음 5ml의 사료를 추가합니다.

음식 섭취를 장려하려면 부화한 로커에서 유충을 부드럽게 흔들고 형광 지질 유사체를 사용하는 경우 빛으로부터 보호하십시오. 먹이 주기가 끝나면 배아 배지 5ml로 유충을 세 번 씻습니다. 유충을 움직이지 못하게 하려면 얼음 위에 금속 블록을 놓고 조직을 덮어 과도한 냉각을 방지한 다음 배아 배지 접시에 유충을 올려 식힙니다.

해부 현미경으로 10배로 유충을 관찰하고 그 중 어느 유충이 리포좀 사료를 섭취했는지 확인합니다. 리포좀을 섭취한 유충은 장이 어두워집니다. 유충이 먹이를 먹었는지 여부는 장이 어두워졌는지 확인하여 확인하는 것이 중요합니다.

일반적으로 유충의 1-5%는 먹지 않으며 식별하여 제거하지 않으면 실험 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 반전된 대물렌즈를 사용한 장기간의 고배율 이미징의 경우, 먼저 얼음 위의 금속 블록에서 유충을 식히십시오. 유충을 유리 바닥 접시에 옮기고 티슈로 심지하여 배아 배지를 제거합니다.

유충 위에 섭씨 42도의 저용융 1.2% 아가로스 한 방울을 떨어뜨리고 즉시 포커로 배치합니다. 차가운 블록에서 접시를 제거하고 아가로스를 2-3분 동안 그대로 두십시오. 마지막으로, 아가로스를 덮고 건조를 방지하기 위해 충분한 양의 신선한 배아 배지를 추가합니다.

이제 표본을 이미징할 준비가 되었습니다. 리포좀 사료가 끝나면 세척된 유충 10마리 이상을 1.5ml 튜브에 모읍니다. 배아 배지를 제거한 다음 유충을 스냅 동결합니다.

먹이를 먹지 않은 유충 10마리를 대조군으로 하여 별도의 튜브에서 반복합니다. 샘플을 얼음 위에 두고 각 튜브에 100마이크로리터의 균질화 완충액을 추가한 다음 마이크로팁 초음파 처리기로 균질화합니다. 조직을 13ml 배양 튜브로 옮깁니다.

375마이크로리터의 1-2개의 클로로포름을 메탄올에 첨가하여 각 균질화 완충액 슬러리에 첨가합니다. 30-60초 동안 소용돌이친 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. 125마이크로리터의 클로로포름을 더 넣고 30초 동안 소용돌이칩니다.

다음으로, 125 마이크로리터의 200 밀리몰 TRIS pH 7.5를 첨가하고 30초 동안 와류를 일으킨 다음 빛으로부터 보호된 5분 동안 2000배 g에서 원심분리합니다. 분리된 상을 방해하지 않도록 원심분리기에서 샘플을 조심스럽게 제거합니다. 깨끗한 유리 피펫을 사용하여 하부 유기상을 수집하여 깨끗한 13ml 유리관에 옮깁니다.

상부 수성 또는 중간 유충 파편 단계를 옮기지 않도록 주의하고 폐기하십시오. 진공 상태에서 유기상을 0.12 대기압으로 건조시키면서 빛으로부터 보호하고 액체가 증발하면 중지하도록 주의하십시오. 단일 시료를 2:1 클로로포름에서 메탄올로 10마이크로리터에 재현탁하고 전체 시료 부피를 채널형 박층 크로마토그래피 플레이트에 고정합니다.

나머지 샘플에 대해 반복하여 균일한 간격으로 스포팅합니다. 마지막으로 형광판 리더로 플레이트를 스캔합니다. 실험 조건에서 로커에서 먹이를 먹은 유충을 조사한 결과 달걀 노른자 유제를 섭취한 물고기의 전형적인 어두워진 창자가 나타났습니다.

먹이를 먹지 않은 유충은 일반적으로 장이 맑기 때문에 먹이를 먹는 기간 동안 다이어트 공식을 섭취하지 않은 유충은 쉽게 구별할 수 있습니다. 형광 지질 유사체를 먹인 유충은 이 식이 지질의 수송 및 축적을 시각화합니다. 여기에서 형광 신호는 수유 8시간 후 소화 기관 전체에서 볼 수 있습니다.

다양한 지질 유사체가 복합체 지질로 차등적으로 대사되기 때문에 고유한 세포 구조 세트에 통합되어 시각화됩니다. 여기서 형광성-C16 및 C12 유사체는 지질 방울을 표시합니다. 형광등 C5는 간관 및 췌관, 지질 방울, 세포막 및 동맥 네트워크를 표시합니다.

그리고 형광등 C2 아날로그는 간관과 췌관, 세포막을 라벨링합니다. 유충 음식 섭취 분석은 Apolipoprotein A4B1을 과발현하는 야생형 유충과 형질전환 유충의 섭식을 연구하는 데 사용되었으며, 4시간 이상 먹이를 먹은 형질전환 유충이 야생형보다 적게 먹는 것으로 나타났습니다. 번식은 쌍을 이루고 먹이를 먹지 않은 대조군 유충을 사용하여 정규화되었습니다.

먹이를 먹은 후 Apo A4를 과발현하는 야생형 및 형질전환 유충의 형광을 정량화한 결과, 야생형에 비해 형질전환 유충의 섭취가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 일단 마스터하면 달걀 노른자 형광 지질 아날로그 사료를 약 15분 안에 준비할 수 있습니다. 음식 섭취량은 약 4시간 내에 10개에서 12개의 통합 샘플로 정량화할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 기형적인 턱, 장이 덜 발달하거나 이동성이 감소하는 등 음식 섭취를 손상시킬 수 있는 발달 결함이 있는지 유충을 선별하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 특정 단백질 및 세포 신호 전달 경로가 음식 섭취 및 지질 대사를 조절하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 제약 치료 또는 게놈 엔지니어링과 같은 방법을 이 실험 프로토콜에 통합할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 위장 생리학 및 세포 생물학 분야의 연구자들이 유충 제브라피시의 식이 지질 수송 및 축적을 시각화할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 지질이 풍부한 유충 제브라피시 사료를 준비하고, 음식 섭취를 위해 유충을 선별하고, 단기 및 장기 이미징을 위해 유충을 장착하고, 음식 섭취를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 초음파 처리기로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안 귀마개를 착용해야 합니다.