여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

본 프로토콜의 전반적인 목적은 필터 카트리지로 수중 샘플을 여과하고, 하우징을 절단하여 필터를 제거할 필요 없이 환경 DNA를 추출함으로써 다양한 수생 생물의 메타바코딩 eDNA를 분석하는 것입니다. 이 방법은 생물 다양성 모니터링 및 군집 생태학과 같은 생태학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 필터 카트리지가 더 많은 양의 물을 수용할 수 있으며, 여과 및 DNA 추출을 멸균 상태에서 수행할 수 있다는 점입니다.

이 절차를 시작하려면, 고진공 튜브를 흡입 펌프의 입력 커넥터에 연결하십시오. 튜브의 반대쪽 끝을 매니폴드에 연결하십시오. 매니폴드에 있는 세 개의 빨간색 T-밸브가 모두 꺼짐(off) 위치에 있는지 확인하십시오.

다음으로, 깨끗한 장갑을 착용하십시오. 진공 고무 튜브의 상단 끝에 암형 루어 피팅(female luer fitting)을 삽입합니다. 그런 다음, 하단 끝에 진공 커넥터를 삽입하십시오.

필터 카트리지의 배출구 포트에 암형 루어 피팅(female luer fitting)을 조심스럽게 연결합니다. 그런 다음, 진공 커넥터를 실리콘 마개에 연결합니다. 준비된 플라스틱 백에 채수된 물 1L를 붓습니다.

수 나사형 루어락 커넥터(male luer-lock connector)가 달린 스크류 캡을 씌웁니다. 그런 다음, 조립된 필터 카트리지의 입구 포트를 수 나사형 루어락 커넥터에 조심스럽게 연결합니다. 모든 연결 부위가 단단히 고정되었는지 확인하십시오.

그 다음, 플라스틱 백을 메쉬 패널의 프롱 두 개에 겁니다. 매니폴드의 유입구 포트에 실리콘 스토퍼를 삽입합니다. 그런 다음, 아스피레이터를 켭니다.

여과를 위해 빨간색 T-밸브를 엽니다. 필터 카트리지가 마를 때까지 매니폴드를 가동하십시오. 그 다음, 빨간색 T-밸브를 닫습니다.

원하는 양의 물을 여과할 때까지 이 모든 과정을 반복합니다. 샘플링한 모든 물의 여과가 완료되면, 플라스틱 백과 진공 용기에서 필터 카트리지를 조심스럽게 꺼냅니다. 카트리지의 양 끝을 적절한 루어 캡(luer cap)으로 막습니다.

그런 다음, 내화학성 펜을 사용하여 카트리지와 입구 루어 캡에 라벨을 부착하십시오. DNA 추출을 수행할 때까지 20 °C에서 보관하십시오. 4 L보다 큰 샘플의 경우, 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 10 L 북 보틀을 준비하십시오.

여과할 물 샘플을 추가합니다. 그런 다음, 10 mL 피펫 팁을 북 보틀의 밸브에 단단히 삽입합니다. 필터 카트리지의 입구 포트를 피펫 팁에 단단히 삽입합니다.

그 다음, 매니폴드의 유입구 포트에 실리콘 마개를 삽입합니다. 아스피레이터를 켭니다. 그런 다음, 여과를 위해 빨간색 T-밸브를 엽니다.

필터 카트리지가 마를 때까지 매니폴드를 작동시키십시오. 여과가 완료되면 빨간색 T-밸브를 닫으십시오. 플라스틱 백과 진공 커넥터에서 카트리지를 조심스럽게 제거하십시오.

그 다음, 카트리지의 양 끝을 적절한 루어 캡(luer cap)으로 밀봉합니다. 유기용제용 펜을 사용하여 카트리지와 입구 루어 캡에 라벨을 부착합니다. DNA 추출을 수행할 때까지 20 °C에서 보관하십시오.

인큐베이터를 56 °C로 예열하십시오. 그런 다음, 2.0 mL 튜브의 힌지 캡을 잘라내어 폐기하십시오. 필터 카트리지에서 입구 루어 캡을 제거하십시오.

그 다음, 유입구를 2.0 milliliter 튜브에 삽입합니다. 자가 밀봉 필름을 사용하여 카트리지와 수집 튜브 사이의 연결 부위를 단단히 밀봉합니다. 이어서, 결합된 유닛을 15 milliliter 원추형 튜브용 원심분리기 어댑터에 삽입합니다.

필터에 남아 있는 액체를 제거하기 위해 카트리지를 5000 ×g에서 1분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 완료되면 필터 카트리지에서 수집 튜브를 분리하여 폐기합니다. 그런 다음, 유입구 포트의 캡을 다시 닫습니다.

다음으로, 20 µL의 protein A-Case 용액, 220 µL의 phosphate-buffered saline 및 200 µL의 buffer AL을 혼합합니다. 입구 캡을 제거하고 피펫을 입구 포트에 완전히 삽입하여 혼합액을 카트리지에 넣습니다. 입구 포트의 캡을 다시 닫습니다. 그런 다음 필터 카트리지를 rotary shaker 위에 놓습니다.

회전 쉐이커를 예열된 인큐베이터에 넣고, 쉐이커를 20 rpm으로 설정하여 20분 동안 작동시킵니다. 배양하는 동안, 내화학성 펜을 사용하여 새 2.0 milliliter 튜브에 라벨을 붙입니다. 그런 다음, 이를 50 milliliter 원추형 튜브에 넣습니다.

배양이 완료되면 입구 캡을 제거합니다. 그런 다음, 입구 포트를 새로운 2.0 milliliter 튜브에 삽입합니다. 원뿔형 튜브를 스크류 캡으로 닫습니다.

추출된 DNA를 수집하기 위해 5000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 멸균 핀셋을 사용하여 2.0 mL 튜브 내의 카트리지를 제거합니다. 튜브의 캡을 닫고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추출된 DNA를 정제합니다.

이 절차에서는 두 종류의 고유 필터를 사용하여 동일한 매니폴드에서 네 가지 서로 다른 부피의 해수를 여과한 후, eDNA를 추출합니다. 필터 카트리지는 유리 섬유 필터보다 평균적으로 50% 더 많은 종을 검출했습니다. 이 기술을 숙달하여 적절하게 수행한다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 영상을 시청하고 나면 필터 카트리지를 이용해 수질 시료를 여과하는 방법과, 다양한 수생 생물의 메타바코딩 eDNA를 분석하기 위해 하우징을 절단하여 필터를 제거할 필요 없이 eDNA를 추출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.