여과 물 샘플 및 환경 DNA의 추출을위한 필터 카트리지의 사용

이 프로토콜의 전반적인 목표는 다양한 수생 생물의 메타바코드 eDNA에서 필터를 제거하기 위해 하우징을 절단하여 열 필요 없이 필터 카트리지로 물 샘플을 여과하고 환경 DNA를 추출하는 것입니다. 이 방법은 생물 다양성 모니터링 및 지역 사회 생태학과 같은 생태 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 필터 카트리지가 더 많은 양의 물을 수용할 수 있고 여과 및 DNA 추출을 멸균 방식으로 수행할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 흡입기 펌프의 입력 커넥터에 고진공 튜브를 부착하십시오. 튜브의 다른 쪽 끝을 매니폴드에 부착합니다. 매니폴드에 있는 3개의 빨간색 T-밸브가 꺼짐 위치에 있는지 확인하십시오.

다음으로, 깨끗한 장갑을 끼십시오. 진공 고무 튜브의 상단 끝에 암 루어 피팅을 삽입합니다. 그런 다음 하단에 진공 커넥터를 삽입합니다.

암 루어 피팅을 필터 카트리지의 배출 포트에 조심스럽게 부착합니다. 그런 다음 진공 커넥터를 실리콘 마개에 부착합니다. 준비된 비닐 봉지에 샘플링 된 물 1 리터를 붓습니다.

나사 캡을 수 루어락 커넥터로 둘러쌉니다. 그런 다음 조립된 필터 카트리지의 흡입구를 수 루어락 커넥터와 조심스럽게 연결합니다. 모든 연결이 안전한지 확인합니다.

그런 다음 메쉬 패널의 두 갈래에서 비닐 봉지를 걸어 놓습니다. 실리콘 마개를 매니폴드의 입구 포트에 삽입합니다. 그런 다음 흡입기를 켭니다.

여과를 위해 빨간색 T-밸브를 엽니다. 필터 카트리지가 마를 때까지 매니폴드를 실행합니다. 그런 다음 빨간색 T-밸브를 닫습니다.

이 전체 과정을 반복하여 원하는 양의 물을 여과합니다. s가 모두 되면amp물을 여과한 후 비닐 봉지와 진공 용기에서 필터 카트리지를 조심스럽게 제거합니다. 카트리지의 양쪽 끝을 적절한 루어 캡으로 덮습니다.

그런 다음 용제 방지 펜을 사용하여 카트리지와 흡입구 루어 캡에 레이블을 붙입니다. DNA 추출을 수행할 준비가 될 때까지 섭씨 20도에서 보관하십시오. 4리터보다 큰 샘플의 경우, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 10리터 책병을 준비합니다.

물을 추가합니다.amp여과할 le. 그런 다음 10ml 피펫 팁을 책 병의 밸브에 단단히 삽입하십시오. 필터 카트리지의 입구 포트를 피펫 팁에 단단히 삽입합니다.

그런 다음 실리콘 마개를 매니폴드의 입구 포트에 삽입합니다. 흡인기 전원을 켭니다. 그런 다음 여과를 위해 빨간색 T-밸브를 엽니다.

필터 카트리지가 마를 때까지 매니폴드를 실행합니다. 여과가 완료되면 빨간색 T-밸브를 닫습니다. 비닐 봉지와 진공 커넥터에서 카트리지를 조심스럽게 제거합니다.

그런 다음 카트리지의 양쪽 끝을 적절한 루어 캡으로 덮습니다.솔벤트 방지 펜을 사용하여 카트리지와 주입구 루어 캡에 레이블을 붙입니다. DNA 추출을 수행할 준비가 될 때까지 섭씨 20도에서 보관하십시오.

인큐베이터를 섭씨 56도로 예열합니다. 그런 다음 2.0ml 튜브에서 힌지 캡을 자르고 캡을 버립니다. 필터 카트리지에서 흡입구 루어 캡을 제거합니다.

그런 다음 입구 포트를 2.0ml 튜브에 삽입합니다. 자체 밀봉 필름을 사용하여 카트리지와 수집 튜브 사이의 연결을 단단히 밀봉합니다. 다음으로, 결합된 장치를 15ml 원추형 튜브용 원심분리기 어댑터에 삽입합니다.

카트리지를 5000g 속도로 1분 동안 원심분리하여 필터에 남아 있는 액체를 제거합니다. 원심분리가 완료되면 필터 카트리지에서 수집 튜브를 제거하고 튜브를 폐기합니다. 그런 다음 입구 포트를 다시 캡핑합니다.

다음으로, 20마이크로리터의 단백질 A-Case 용액, 220마이크로리터의 인산염 완충 식염수 및 200마이크로리터의 완충 AL을 혼합합니다. 주입구 캡을 제거하고 피펫을 사용하여 혼합물을 카트리지에 추가하고 피펫을 주입구 포트에 완전히 삽입합니다. 입구 포트를 다시 요약합니다. 그런 다음 필터 카트리지를 회전식 셰이커에 놓습니다.

예열된 인큐베이터에 로터리 셰이커를 놓고 셰이커를 20분 동안 20rpm으로 설정합니다. 배양하는 동안 새 2.0ml 튜브에 용제 방지 펜으로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.

배양이 완료되면 주입구 캡을 제거합니다. 그런 다음 주입구 포트를 새 2.0밀리리터 튜브에 삽입합니다. 원뿔형 튜브를 나사 캡으로 덮습니다.

추출된 DNA를 수집하기 위해 5000회 g에서 1분 동안 원심분리기를 사용합니다. 그런 다음 멸균된 집게를 사용하여 2.0ml 튜브의 카트리지를 제거합니다. 튜브의 뚜껑을 덮고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 추출된 DNA를 정제합니다.

이 절차에서는 두 개의 고유한 필터를 사용하여 동일한 매니폴드에서 4가지 다른 부피의 해수를 여과한 다음 eDNA를 추출합니다. 필터 카트리지는 유리 섬유 필터보다 평균적으로 50% 더 많은 종을 감지했습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 두 시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 필터 카트리지로 물 샘플을 여과하는 방법과 다양한 수생 생물의 eDNA를 메타바코딩하는 필터를 제거하기 위해 하우징을 절단하지 않고 eDNA를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.