Name: 지방 수준을 결정하는 부력 기반 방법 초파리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 유충의 지방 저장 수준을 측정하는 부력 기반 분석 방법을. 이 기술은 유전학, 식이 또는 처리에 의한 대사 변화를 빠르고 경제적으로 선별하여 비만 소인의 유전적 및 신경적 기여를 연구하는 데 활용됩니다.

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K.E.H.는 Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730의 지원을 받았습니다. 이 작업은 NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 및 AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.의 지원을 받았습니다.

1. 관심의 유전자형과 파리에서 계란을 수집 주 : 이상적인 십자가 150 처녀 파리 적어도 75 명의 남성으로 구성되어 있습니다. 주식 컬렉션은 최소 200 파리로 구성되어야합니다. <ol><li> 포도 접시를 준비합니다. <ol><li> 4 L 플라스크에 1.5 L 증류수에 37.5 g 한천을 추가합니다. </li><li> 121 ºC (250 ºF)에서 50 분 동안 오토 클레이브 물 / 한천 혼합. </li><li> 물 / 한천 혼합 고압 증기 멸균 동안, 500 ml의 포도 주스에 50g의 설탕을 추가하고 설탕이 녹을 때까지 가열 교반 접시에 교반 막대로 저어. </li><li> 열을 끄고 70 아래 ºC로 포도 주스 / 자당 혼합물을 냉각 교반을 계속합니다. 알코올 온도계 내부 온도를 테스트합니다. </li><li> 포도 주스 / 자당 혼합물을 따뜻하게 녹여 교반 (예를 들어, Tegosept) 3g 초파리 항 곰팡이 제를 추가합니다. </li><li> 물 / 배지 혼합물을 오토 클레이브를 벗어나면, 플라스크 때때로 소용돌이에 의해 터치 식힌다. </li><li&gt; 물 / 한천 혼합물 포도 주스 / 자당 혼합물을 결합하고 잘 혼합 때까지 저어. </li><li> 작은 페트리 접시 (35 × 10 밀리 스타일)의 뚜껑에 포도 액 10 ㎖ - 8을 추가하기 위해 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 뚜껑 벽의 높이가 볼록 형상을 형성하는 것보다 높은 혼합물 크라운 할 수있다. </li><li> 포도 판 4 ºC에서 밀폐 용기에 실온에서 2 시간 동안 냉각 한 후 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 효모 페이스트를 준비합니다. <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 4g 라이브 활성 건조 효모에 6 ml의 인산염 완충 용액 (PBS)를 추가하고 부드러운 때까지 주걱으로 섞는다. </li><li> 저장 효모는 4 ºC에 붙여 넣습니다. </li></ol></li><li> 포도 판의 중간에 효모 붙여 넣기의 작은 덩어리 (약 1/8 작은 술)를 추가합니다. 주걱으로 어떤 거친 가장자리를 부드럽게. </li><li> 그들은 주위 온도에 도달 할 때까지 인큐베이터에서 포도 접시를 놓습니다. </li><li> 계란 수집 챔버와 장소 포도 판 w에 관심이 파리로 이동상단에 안쪽을 향하게 i 번째 효모 붙여 넣기. 계란 수집 챔버에 테이프 포도 판은 판 열외시키는 방지 할 수 있습니다. 포도 판의 하단에 중요한 유전자형과 날짜 정보를 기록해야합니다. </li><li> 파리는 포도 접시에 알을 낳기 할 수 있도록 계란 수집 챔버를 뒤집다. </li><li> 상자를 배치 또는 계란 수집 챔버를 통해 커버하고 25 ºC에서 인큐베이터에 배치합니다. </li><li> 6 시간 - 파리 4 알을 낳기 할 수 있습니다. </li><li> 계란 수집 챔버에서 포도 판을 복용하고 음식의 자신의 병에 다시 파리를 전송하여 수집을 종료합니다. 포도 판에서 초과 효모 페이스트를 닦아 주걱을 사용합니다. 24 시간 ~ 25 ºC에서 가습 인큐베이터에서 더 큰 페트리 접시에 보관 포도 접시입니다. </li></ol> 실험 식품 2. 전송 애벌레 <ol><li> 실험 음식을 준비합니다. 참고 :이 음식 조리법이 블루밍턴 재고 센터 레시피 (18)에 기초한다. 중요 변경무대를 방황의시기에 의해 평가로 음식의 영양 가치를 최적화 할 수있는 효모의 양을 증가 포함 (112 사이 - 120 시간 25 ºC에서 계란을 수집 후). 우리는 건강과 우리의 실험 애벌레의 개발을위한이 조리법에 적합 찾을 수 있지만, 어떤 음식 조리법 단계 3.10에 나와있는 예들이 긍정적이고 부정적인 컨트롤과 허용 주어진 교정이다. <ol><li> 1,600 ml의에게 증류수를 측정한다. </li><li> 134g의 옥수수 가루 10.6 g 초파리 한천 타입 II, 및 1 L의 비커에 물 일부 (~ 500 ml)에 혼합한다. 전동 핸드 믹서 2 분 동안 혼합. </li><li> 70g 라이브 활성 건조 효모, 18.4 g 간장 가루, 84.8 g 맥아 추출물, 또 다른 1 L의 비커에 물을 약간 (~ 500 ml)에 섞는다. 전동 핸드 믹서 2 분 동안 혼합. </li><li> 각 비커를 소용돌이와 4 L 플라스크에 붓는다. 비커를 씻어 플라스크에 추가 남아있는 물을 사용합니다. </li><li> 소용돌이에 의해 혼합, 140 ml의 빛 옥수수 시럽을 측정하고 플라스크에 추가 할 수 있습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 액체 환경에서 121 ºC (250 ºF)에서 50 분 동안 오토 클레이브. </li><li> 고압 증기 멸균 한 후, 4 L 비이커에 음식을 부어 냉각 할 수 있습니다. 전동 핸드 믹서로 혼합하여 냉각 과정을 도와주세요. </li><li> 플라스크 터치 충분히 냉각되면, 8.8 ml의 프로피온산 및 16.8 ml의 초파리 항진균 에이전트 / 에탄올 용액을 추가합니다. 잘 섞다. (용액이 70 ºC를 초과하지 않도록하고, 380g 초파리 항 곰팡이 제 L 1-200 증거 에탄올을 첨가하고 용해 될 때까지 따뜻한 접시에 교반 초파리 항 곰팡이 제 용액을 확인합니다.) </li><li> 음식이 약 1 인치 깊이 때까지 튜브로 음식을 붓고 2 실온에서 냉각 할 수 - 3 시간. 25 ºC에서 인큐베이터에서 튜브 및 저장소를 연결합니다. 주일 이내에 사용하십시오. </li></ol></li><li> 점수는 그것 음식의 유리 병의 상단 층에 주걱을 여러 번 플 런지. 이 굴 및 공급하는 유충 도움이 될 것입니다. </li><li> 22 - 24 시간 계란 컬렉션이 후종단, 같은 대략적인 크기의 50 첫째 령 (L1) 애벌레를 수집하는 작은 붓을 사용합니다. 실험 음식에 애벌레를 놓습니다. 다른 유전자형을 계속하기 전에 붓에 남아있는 애벌레가 없는지 확인 와이프 실험실에 페인트 브러시를 청소합니다. </li><li> 25 ºC에서 인큐베이터에서 유충의 병을 놓고 개발 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 애벌레의 지방 수준을 결정 <ol><li> 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 1 L의 10 배 PBS 주식을 준비합니다. <ol><li> 교반 막대를 포함하는 2 L의 비커에 800 ml의 물에 80g의 NaCl, 2 g의 KCl, 14.4 g이 나 HPO 4, 2.4 g의 KH 2 PO 4를 추가합니다. 모든 염이 통합 될 때까지 더 가열 교반한다. 7.4으로 산도를 가져옵니다. 물 1 L에 볼륨을 높입니다. </li></ol></li><li> 2 L 1X PBS를 준비합니다. 1,800 ml의 물에 200 ml의 10 배 PBS 주식 솔루션을 추가합니다. </li><li> 20 % / V 자당 승하기 위해 1X PBS의 콘텐츠를 사용합니다. </li></ol></li><li> 로부터 유충의 병을 제거(일반적으로 계란 컬렉션 후 다섯 번째 날에) 유리 병의 측면을 방황하는 40 애벌레 - 인큐베이터 번 (20)이있다. 일시 분석뿐만 아니라 유충 방황의 수를 기록한다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 11.5 ml의 PBS 9 ml의 20 % 자당을 추가하여 실험적인 솔루션을 준비합니다. </li><li> 바이알의 상단에서 1 인치 - 0.5이 될 때까지 바이알에 20 %의 슈 크로스를 추가한다. </li><li> 부드럽게 여전히 음식에 굴을 파기하는 무료 유충에 음식의 상단 층을 자극하기 위해 주걱을 사용합니다. 모든 유충 자당 용액의 표면으로 상승 할 것이다. </li><li> 부드럽게 단계 3.3에서 초기 자당 농도에 애벌레를 전송하는 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게이 솔루션의 애벌레를 저어 주걱을 사용합니다. </li><li> 원뿔 튜브를 모자와 철저하게 솔루션을 혼합시키기 위해 거꾸로 여러 번 흔들어 준다. </li><li> 원뿔형 관 뚜껑을 벗기다하고 부드러운 소용돌이를 만드는 소용돌이 친다. </li><li> 하나의 해결책 또는시의 상단에 떠있는 유충이 정착 할 수 있도록 허용바닥에 nking. 애벌레 해결하기위한 5 분 - 2 기다립니다. 참고 : 하나 부동 또는 침몰 확실히하지 유충이 여전히 존재하는 경우, 플로터 또는 싱커 중 하나로 애벌레 라벨을 절단 지점으로 사용할 수있는 라인을 선택합니다. 모든 유전자형이 같은 기준을 적용합니다. 우리는 19 돌연변이 분석 교정 용 음성 대조군으로서 사용될 수있는 양성 대조군과 lsd2로서 사용될 수있다 우리 경계. ADP SIR2 또는 17 돌연변이 애벌레와 원추형 튜브의 하단에 각도를 사용한다. </li><li> 부유 유생의 수와 시험 특정 농도를 기록한다. </li><li> 밀도를 증가시키는 실험 용액에 1 ㎖의 20 % 슈 크로스를 추가한다. </li><li> 반복 3.10-3.7 단계를 반복합니다. 부유 유생의 수와 새로운 농도를 기록한다. </li><li> 유충의 95 % 이상이 부동 때까지 단계 3.12와 3.13을 계속합니다. </li><li> PBS 가득 해부 접시에 모든 애벌레를 수집하기 위해 집게를 사용합니다. </li><li> OBS어떤 작은 애벌레, 사전 번데기, 번데기, 또는 유전자형 사이에 다른 차이가있는 경우 현미경과 주에서 정말 짜증나 애벌레. 참고 : 이상적으로, 모든 애벌레가 균일하고 동일한 발달 단계에 나타납니다. 우리는 이러한 조건에서 일관된 지방 측정을 관찰했다. </li><li> 유충의 수를 기록한다. </li><li> 집게 사용, 건조 닦아 실험실에 10 애벌레를 전송합니다. 미세 원심 튜브를 라벨 및 튜브 (10)의 유충을 배치합니다. </li><li> 플래시는 액체 질소의 유충을 동결. -20 ºC에서 튜브를 저장합니다. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

10 - 지질 수준 8을 측정하기 위해 개발 된 기술이 다수가있다. 그러나, 이러한 각각의 방법은 위에 설명 된 부력 기반 분석에 의해 해결 된 몇 가지 큰 단점이 함께 제공됩니다. 우선,이 분석은 매우 빠르다. 60 분 - 전체 농도 구배를 테스트하는 것은 더 이상 30 이상 걸립니다. 이것은 현재 사용중인 대부분의 기술에 큰 개선이다. 이를 분석하는 지질 및 다른 여러 시간 분리 9 시간 - 예를 들어, MS에 의한 지질 정량 7 걸린다. 동물의 다수의 화면을 수행 할 때 강한 억제력이다. 빠른 부력 표현형을 측정함으로써, 하나는 신속하게 관심의 표현형이 유전자형에 집중할 수 있습니다. 둘째, 밀도 분석은 (PBS에 대한) 소금과 설탕으로 만 일반적인 시약이 필요합니다. 이는 더 쉽고 더 저렴 유충 다수의 화면 또는 신속 흥미롭게 유전자형을 테스트 할 수있다. 마지막으로,이 프로토콜 난비 침습적 및 유생들 말에 여전히 살아있다. 이것은 상기 실험은 특정 지질 정량 ...

노랑 초파리는 유전학 및 기타 기본적인 생물학적 질문의 연구에서 한 세기에 걸쳐 사용되어왔다. 초파리는 사람의 질환에 대한 연구를 위하여 강력한 도구가 있음을 지난 수십에서는 명백 해졌다. 인간의 질병과 관련된 유전자의 80 % 식별 된 비행 ortholog 1가 - - 70으로 4, 초파리는 복잡한 질병을 연구하기에 간단 아직 번역 시스템을 제공한다. 특히 대사는 연구로부터 혜택을 받았다. 뿐만 아니라 초파리와 인간 사이에서 보존 된 대사 유전자가 있지만, 관련 기관, 세포 유형은 2,5- 매우 유사하다. 예를 들어, 포유 동물의 간 및 흰색 지방 조직 (6)에서 수행 된 것과 모두 triacylglycerides (TAG)과 글리코겐, 기능과 유사 플라이 점포의 지방이 몸. 인간의 비만의 모델로 초파리를 사용하면 훨씬 지질에 대한 우리의 이해를 개선했다신진 대사와 비만 (7)의 유전학. 개발의 애벌레 단계가 공급하기 위해 최선을 다하고 있습니다 에너지의 저장은 pupariation 동안 사용으로 저장 또는 사용에 영양소의 분리를 공부에 특히 유용합니다. 현재, 초파리 지방 저장 레벨을 결정하는 다양한 정량 방법이있다. 가장 널리 사용되는 방법은 결합 비색 분석 (CCA) -8,9-이다. CCA 인간 혈청 TAG 수준을 결정하기 위해 개발되고 궁극적으로 착색 된 생성물을 생성하는 산화 환원 커플 링 반응의 결과로 여러 반응을 겪을 것이다 트리글리세리드의 백본에서 해방 글리세롤 전제로 동작한다. 빛의 특정 파장의 흡수 후, 글리세롤의 존재의 초기 양을 측정한다. 그러나, 글리세롤은 TAG뿐만 아니라 모노 - 및 디아 실에서 해방 될 수 있으므로들에 대한 정확한 측정하지 않을 수 있습니다tored 체지방 9. 또한, 분쇄 성인 파리의 눈 안료는 약간의 흡광도 판독을 방해하고 결과 9,10을 복잡하게 할 수 있습니다. 따라서, CCA는 동반 10,11 농도계에 의해 정량화 될 수있는 대부분의 지질 군의 분리를 허용 박층 크로마토 그래피 (TLC)에 의해 검증되어야한다. 그러나, 스테롤 등 일부 지질 분류 분석 할 수 없으며, 다른 방법 (12)을 정량한다. 질량 분석 (MS)의 주요 세포 지질 12, 13의 모든 클래스를 정량 할 수있는 정확한 방법입니다. 그러나, MS에 의해 분석 할 필요 지질 추출 절차는 두 시간 소모적 (대부분 촬영 거의 전체 일) 및 비용이다. 여기서 우리는 신속하고 저렴 초파리의 L3 유충에 유기체 지방 수준을 결정하기위한 다른 방법을 제시한다. 아래에 제시된 방법은 지방 조직, 마른 조직 사이의 밀도의 차이를 이용한다. 포유 동물 FAt 조직은 1.06 g / ㎖ (15)의 밀도는 약 0.9 g / ㎖ 14 동안 골격근의 밀도를 갖는다. 이 차이는 지방의 높은 점포 동물들이 고정 농도의 용액에 더 부유 할 수 있도록 지방의 낮은 매장과 동물보다 낮은 밀도를 가질 것을 의미합니다. 이 호텔은 저렴하고 비 침습적 모두있는 동안 동물의 많은 수의 매우 빠른 스크리닝 할 수 있습니다. 부력 기반 분석은 또한 비만 16,17 새로운 유전 적 신경 레귤레이터를 식별하기 위해 같은 지방 수준의 공지 된 레귤레이터 변경의 표현형을 확인하는 데 모두 사용되어왔다.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch's Original 100% 포도 주스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>피셔</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td>200 프루프</td></tr><tr><td>베이커 효모</td><td>Fleichmann's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow 옥수수 가루</td><td>퀘이커</td><td></td><td>농축 탈아</td></tr><tr><td>초파리 한천 유형 II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>콩</td>가루 <td>ADM 특수 성분</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>맥아 추출물</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>가벼운 옥수수 시럽</td><td>카로</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>인산 칼륨 일 염기성</td><td>시그마</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 무수</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm 페트리 플레이트</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원추형</td><td>Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

지방 수준을 결정하는 부력 기반 방법<em&gt; 초파리</em

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster는 지방 조절 연구의 핵심 실험 시스템입니다. 현재 초파리에 저장된 지방의 수준을 측정하기 위한 수많은 기술이 존재하지만 대부분은 비용이 많이 들거나 힘들고 명확한 한계가 있습니다. 여기에서는 L3 Drosophila 유충의 유기체 지방 수준을 빠르고 저렴하게 측정하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 지방 조직과 제지방 조직 간의 밀도 차이에 의존하며 지방 및 제지방 표현형을 신속하게 검출할 수 있습니다. 우리는 중성 지질 추출 및 질량 분석법(GCMS)과 결합된 가스 크로마토그래피에 의해 결정된 체지방 비율과 비교하여 이 방법의 정확성을 검증했습니다. 또한 유충의 수집 및 동기화를 위한 자세한 프로토콜과 관련 실험 레시피를 간략하게 설명합니다. 아래에 제시된 기술은 가장 널리 사용되는 지질 정량 분석법의 주요 단점을 극복하고 유충의 무결성을 유지하면서 L3 유충에서 지방 조절 표현형을 빠르고 민감하게 스크리닝할 수 있는 강력한 방법을 제공합니다. 이 분석법은 초파리를 사용한 신진대사 및 지방 조절 연구에 광범위하게 응용됩니다.

그림 1은 부력 기반의 분석은 유전자 조작 유충 모두 높고 낮은 지방 점포를 감지 할 수있는 방법의 예를 나타낸다. 그림 1a는 애벌레 뇌에서 신경 세포의 특정 부분 집합 (E347)의 여자 또는 침묵을 보여줍니다 유도 낮은 및 높은 지방 각각 저장한다. 동일한 유전 적 배경 제어는 두 경우 모두에서 사용 하였다. (1B)의 농도 분석에 의해 얻어진이 표현형 GCMS에 의해 중성 지질 추출 및 정량에 의해 뒷받침되는 방법의 예를도. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54744/54744fig1.jpg" /> 애벌레 뇌의 특정 지역에있는 그림 1.</st...

여기에서 우리는 세 번째 령 (L3) 초파리의 애벌레 단계에서 유기체 지방 수준을 측정하는 방법을 제시한다. 이 방법은 변경된 지방 저장과 애벌레를 구분하는 지방 조직의 비교적 낮은 밀도를 이용한다. 부력 기반의 분석은 신속하게 재현, 경제적 선별을위한 유용한 도구입니다.

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

본 분석의 전반적인 목표는 유전학, 식단 또는 처치의 변화로 인해 발생할 수 있는 지방 저장 수준의 변화를 결정하는 것입니다. 이러한 방법들은 비만 소인에 대한 유전적 또는 신경적 기여와 같이 대사 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 현재 사용되는 다른 방법들과 비교했을 때 빠르고 경제적이며 재현성이 매우 높다는 점입니다.이 방법이 처음이거나 방황기(wandering stage) 유충을 다루는 것이 처음인 연구자는 유전자형에 따라 발달 시기가 매우 다양할 수 있으므로 이 프로토콜을 수행하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 격자 플레이트(grate plate) 중앙에 효모 페이스트를 소량 얹습니다. 스패튤라를 사용하여 거친 가장자리를 매끄럽게 펴줍니다.다음으로, 대상 파리들을 알 수집 챔버로 옮기고, 효모 페이스트가 도포된 그레이트 플레이트의 윗면이 안쪽을 향하도록 그 위에 놓습니다. 그다음 그레이트 플레이트가 떨어지지 않도록 알 수집 챔버에 테이프로 고정합니다. 그레이트 플레이트 바닥면에 중요한 유전자형과 날짜 정보를 반드시 기입하십시오.그 후, 파리가 격자판(grate plate) 위에 알을 낳을 수 있도록 알 수집 챔버를 뒤집습니다. 그런 다음, 알 수집 챔버를 열린 상자로 덮고, 이를 25 °C의 배양기에 4~6시간 동안 두어 파리가 알을 낳도록 합니다. 작업이 완료되면 알 수집 챔버에서 격자판을 꺼내고 파리를 원래의 먹이가 들어 있는 병으로 다시 옮깁니다.스패튤라를 사용하여 그레이트 플레이트에서 과잉의 효모 페이스트를 닦아냅니다. 그 후, 그레이트 플레이트를 더 큰 페트리 접시에 담아 25 degrees celsius의 습윤 인큐베이터에서 24시간 동안 보관합니다. 이 과정에서, 유충이 파고 들어가 먹이를 섭취할 수 있도록 스패튤라로 먹이의 상층부를 여러 번 찔러 흠집을 냅니다.알 수집 후 22~24시간이 지나면, 작은 붓을 사용하여 크기가 거의 동일한 1령 유충 50마리를 수집하여 실험용 먹이 vial에 넣습니다. 거의 동일한 크기의 유충을 선택하여 실험용 먹이로 옮기는 것이 매우 중요합니다. 이렇게 해야 유충 발달의 정밀한 동기화를 보장할 수 있습니다.다음으로, 실험용 와이프로 붓을 닦아내고 다른 유전자형으로 넘어가기 전에 붓에 남아 있는 유충이 없는지 확인하십시오. 그 후, 유충이 든 바이알을 25 °C 인큐베이터에 넣고 발육시킵니다. 바이알 벽면을 타고 올라오는 유충이 20~40마리가 되면 인큐베이터에서 유충 바이알을 꺼냅니다.분석 날짜와 시간 및 배회 유충의 수를 기록합니다. 그런 다음 50 mL 원심 분리 튜브에 11.5 mL의 PBS와 9 mL의 20% sucrose를 넣어 실험 용액을 준비합니다. 바이알 상단에서 1인치 지점에 도달할 때까지 20% sucrose를 추가합니다.스파출라를 사용하여 먹이의 윗부분을 조심스럽게 저어, 여전히 그 속에 파고 들어가 있는 유충들을 분리합니다. 모든 유충은 설탕 용액의 표면으로 떠오르게 됩니다. 그 후, 유충들을 처음의 설탕 용액으로 조심스럽게 옮기고 살살 저어줍니다.유충을 실험 용액으로 옮길 때, 유충을 쥐어짜거나 찌르지 않도록 주의하십시오. 이는 분석 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 원심 분리관의 뚜껑을 닫고 여러 번 뒤집어 용액을 충분히 혼합하십시오.그런 다음 원추형 튜브의 캡을 열고 가볍게 회전시켜 부드러운 와류를 형성합니다. 유충이 용액 상단으로 뜨거나 바닥으로 가라앉아 안정될 때까지 2~5분 동안 기다립니다. 떠 있는 유충의 수와 테스트한 특정 sucrose 농도를 기록합니다.그 다음, 밀도를 높이기 위해 실험 용액에 20% sucrose 1 mL를 첨가합니다. 이어서, 스패출러를 사용하여 유충을 부드럽게 저어줍니다. 그 후, 원심 분리관의 캡을 닫고 여러 번 뒤집어 용액을 충분히 혼합합니다.그 후, 원추형 튜브의 캡을 열고 가볍게 회전시켜 부드러운 소용돌이를 만듭니다. 떠오른 유충의 수와 새로운 농도를 기록합니다. 유충의 최소 95%가 떠오를 때까지 이 과정을 반복합니다.원추형 바이알의 상단에서 1인치 정도 남을 때까지 20% sucrose를 추가합니다. 다음으로 PBS가 채워진 해부 접시에 모든 유충을 수집합니다. 현미경으로 유충을 관찰하여 작은 유충, 전번데기, 번데기 또는 유전자형 간의 기타 차이점이 있는지 확인하여 절차가 적절하게 수행되었는지 검토합니다.그 다음 유충의 총 마리 수를 기록합니다. 이후, 건조를 위해 10마리의 유충을 실험실용 와이프(laboratory wipe) 위로 옮깁니다. 마이크로원심분리 튜브에 라벨을 부착하고 유충을 튜브에 넣습니다.그 후, 유충을 액체 질소로 급속 냉동하고 튜브를 -20 °C에서 보관합니다. 여기는 부력 기반 분석법을 통해 유전자 조작 유충에서 축적된 지방의 증가 및 감소를 어떻게 검출할 수 있는지 보여주는 예시입니다. 이 그림은 유충 뇌의 특정 신경세포 하위 집합을 활성화하거나 억제했을 때, 각각 저장 지방이 감소하거나 증가함을 보여줍니다.두 경우 모두 동일한 유전적 배경 대조군이 사용되었습니다. 다음은 밀도 분석을 통해 얻은 이 표현형이 중성 지질 추출 및 GCMS 정량을 통해 어떻게 입증되는지에 대한 예시입니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있으며, 다른 유전자형과 병행하여 수행할 수 있습니다.이 실험 절차를 수행할 때, 실험용 유충의 발달 단계를 최대한 동기화하는 것이 중요합니다. 이 절차를 마친 후, 유충을 액체 질소로 급속 냉동하여 가스 크로마토그래피-질량 분석법(gas chromatography mass spectrometry)과 같은 다른 분석법에 활용함으로써 유충 내 특정 지질 유형의 분류와 같은 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 이 기술의 개발을 통해 대사 연구자들은 Drosophila의 비만에 기여하는 유전적 또는 신경적 요인을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.이 영상을 시청한 후, 저장 지방 수치의 변화를 확인하기 위해 유전자형을 빠르게 스크리닝하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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이 비디오는 초파리 파리의 장 산성화를 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. pH 지시 염료가 보충된 식품을 섭취한 후 장 내강(intestinal lumen)의 산성화로 인해 염료의 색이 변합니다. 색깔 변화를 검사하기 위해 파리의 소화관을 육안으로 검사하면 산성화의 증거가 나타납니다.

Gut Acidification Monitoring Assay: Bromophenol Blue Dye를 사용하여 초파리의 장 내강을 산성화하는 방법을 연구하는 기법

우리는 공부에 대한 강력한 생화학 및 미세 방법을...

에서 지방 질량의 생화학 및 높은 처리량 미세 평가<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

여기에서 우리는 높은 처리량 검사를 가능하게 초파리의 비행 성능의 신속하고 정확한 측정하는 방법을 설명합니다.

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em

대사 질환은 인간에서 가장 흔한 질병 중 하나들이다. 유 전적으로 다루기 쉬운 모델 생물 D. melanogaster의 대사를 조절하는 신규 한 유전자를 확인하는데 사용될 수있다. 이 논문은 자신의 CO 2 생산을 측정하여 파리의 신진 대사 속도를 연구 할 수있는 비교적 간단한 방법을 설명합니다.

대사율의 측정에<em&gt; 초파리</em&gt; Respirometry를 사용하여

제브라피쉬는 식이 지질 처리 및 대사 질환의 중요한 모델로 부상하고 있습니다. 지질이 풍부한 유충 사료의 프로토콜, 식이 형광 지질 유사체의 실시간 이미징 및 음식 섭취의 정량화가 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 다양한 스크리닝, 이미징 및 가설 기반 조사 기술에 적용할 수 있습니다.

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

CApillary FEeder (CAFE) 분석은 음식 섭취의 기저에 있는 메커니즘을 조사하기 위한 간단하고 예산 친화적이며 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 다재다능한 유전자 모델 유기체인 Drosophila melanogaster와 함께 사용되는 이 제품은 음식 섭취의 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.

복부 색소 침착 정량화<em&gt; Drosophila melanogaster</em

이것은 높은 지방 다이어트를 먹이 초파리, 이해 기본적인 분자 메커니즘 lipotoxicity에 연루에 대 한 모델에서에서 비만 유발 하는 프로토콜 이다. 초파리 와 다양 한 식이, 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 (곤충) 잠재적으로 다른 모델에 지방 축적을 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과를 제공 합니다.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

여기에 제시된 보디피 493/503, 지질 방울 특이적 형광 염료를 사용하여 드로소필라 유충에서 에노세포의 해종 및 지질 방울 염색에 대한 상세한 방법이 제시되어 있다.

초파리 유충에 있는 Oenocytes의 해부 그리고 지질 물방울 염색

여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

현재 프로토콜은 영양소 고갈을 통한 초파리 멜라노가스터 유충 지방체에서 자가포식 유도를 설명하고 형질전환 파리 균주를 사용하여 자가포식의 변화를 분석합니다.

Drosophila melanogaster 유충 지방체에서 기아로 인한 자가포식 분석

배우세요 Drosophila melanogaster 유충의 지방 저장 수준을 측정하는 부력 기반 분석 방법을. 이 기술은 유전학, 식이 또는 처리에 의한 대사 변화를 빠르고 경제적으로 선별하여 비만 소인의 유전적 및 신경적 기여를 연구하는 데 활용됩니다.

지방 수준을 결정하는 부력 기반 방법

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