이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

이 절차의 전반적인 목표는 동일한 펩토이드 서열 내에 라이신과 아르기닌 유형 단량체를 모두 도입하고 방치된 열대 질병인 피부 리슈마니아증의 원인 기생충인 리슈마니아 멕시카나에 대한 이러한 화합물의 활성을 평가하는 것입니다. 피부 리슈마니아증에는 새로운 치료법이 시급히 필요하며, 이 절차는 이 방치된 열대 질환에 대한 새로운 종류의 잠재적 항감염제로서 펩토이드를 식별하고 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 혼합된 양이온 기능을 포함하는 펩토이드를 합성할 수 있다는 것입니다.

이는 염기서열의 생물학적 활성을 조절하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 매우 바람직합니다. 이것은 기생충의 포유류 형태에 대해 테스트하지만 Leishmania mexicana의 곤충 단계에 대해 사용하거나 포유류 세포주에 적용 할 수도 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 합성의 단계적 특성과 Leishmania mexicana의 수명주기의 다양한 지점에서 기생충 배양을 보여주기 때문에 정말 유용합니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 디메틸포름아미드로 용액을 준비합니다. 그런 다음 0.1 밀리몰의 Fmoc-protected 링크 아미드 수지를 두 개의 프릿이 있는 캡이 있는 20밀리리터 폴리프로필렌 반응 용기에 추가합니다. 디메틸포름아미드 5ml를 넣고 용기를 실온에서 60분 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 고체상 추출 진공 플랫폼을 사용하여 DMF를 배출합니다. 다음으로, 준비된 피페리딘 용액 2ml를 첨가합니다. 용기를 실온에서 450RPM의 셰이커 플랫폼에 놓고 5분 동안 흔듭니다.

진공 스테이션을 사용하여 용액을 배출합니다. 그런 다음 피페리딘 용액 2ml를 넣고 같은 조건에서 15분 동안 흔듭니다. 진탕이 완료되면 진공 스테이션을 통해 용액을 배출합니다.

DMF 2ml를 넣고 30초 동안 혼합하여 수지를 세척합니다. DMF를 배출하고 세척을 세 번 반복합니다. 서브모노머 합성을 시작하려면 준비된 브로모아세트산 용액 1ml와 준비된 DIC 용액 0.2ml를 추가합니다.

실온에서 20분간 흔듭니다. 그런 다음 용액을 배출하고 매번 2ml의 DMF를 사용하여 세 번 씻습니다. 준비된 아민 용액 1ml를 추가합니다.

그런 다음 실온에서 60분 동안 수지를 흔듭니다. 용액을 배출하고 매번 2ml의 DMF를 사용하여 수지를 세 번 세척합니다. 다음으로 브로 모 아세트산 용액 1 밀리리터와 DIC 용액 0.2 밀리리터를 첨가합니다.

실온에서 20분간 흔듭니다. 그런 다음 용액을 배출하고 매번 2ml의 DMF를 사용하여 세 번 씻습니다. 구아니딘 기능성 단량체를 도입하려면 수지에 1ml의 보호되지 않은 디아민 용액을 첨가하십시오.

실온에서 60분간 흔듭니다. 그런 다음 용액을 배출하고 2ml의 DMF로 수지를 세 번 세척합니다. 준비된 2-아세틸 디메돈 용액 0.5ml를 추가합니다.

실온에서 60분간 흔듭니다. 그런 다음 용액을 배출하고 2ml의 DMF로 수지를 세 번 세척합니다. 원하는 염기서열이 만들어질 때까지 서브모노머 합성을 계속합니다.

그런 다음 준비된 히드라진 용액 4ml를 넣고 실온에서 3분 동안 흔듭니다. 용액을 배출하고 세 번 반복합니다. 그런 다음 각 세척마다 2ml의 DMF를 사용하여 수지를 세 번 세척합니다.

펩토이드 염기서열에서 유리 아민당 DIPEA와 6개의 등가물 pyrazole-1-carboxamidin을 추가합니다. 실온에서 60분간 흔듭니다. 진탕이 완료되면 용액을 배출하십시오.

각 세척마다 2밀리리터의 디클로로메탄을 사용하여 수지를 세 번 세척합니다. 수지를 10분 동안 자연 건조하고 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오. 합성 진행 상황을 확인하기 위해 아민 첨가 후 테스트 절단을 수행할 수 있습니다.

최종 절단을 시작하려면 합성에 사용되는 것과 동일한 프릿 반응 카트리지에 4ml의 절단 칵테일을 추가하고 용기를 덮습니다. 실온에서 90분 동안 흔듭니다. 그런 다음 프릿 반응 용기를 사용하여 수지의 절단 칵테일을 바닥이 둥근 플라스크로 여과합니다.

회전 증발기를 사용하여 분열 칵테일을 증발시킵니다. 펩토이드를 침전시키기 위해 2밀리리터의 무수 디에틸 에테르를 첨가합니다. 피펫을 사용하여 디 에틸 에테르를 제거하고 폐기하십시오.

그런 다음 디 에틸 에테르 침전을 3 회 반복합니다. 침전이 완료되면 조잡한 펩토이드를 10ml의 준비된 아세토니트릴 및 산성화된 수용액에 용해시킵니다. 미리 계량된 용기로 옮깁니다.

그런 다음 섭씨 영하 20도에서 동결하고 역상 HPLC에 의해 정제할 준비가 된 건조 분말로 동결건조합니다. Leishmania mexicana 기생충을 배양하고 axenic amastigote 단계로 형질전환한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 compound stock solution을 준비하여 세포독성 분석을 시작합니다. 2마이크로리터의 5밀리몰 펩토이드 원액, 암포테리신 B 대조군 및 DMSO 대조군을 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 96웰 플레이트의 맨 윗줄에 추가합니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 48마이크로리터의 새 배지를 맨 윗줄에 추가합니다. 다른 모든 줄에 25마이크로리터의 새 배지를 추가합니다. 다음으로, 맨 윗줄에서 25마이크로리터의 용액을 피펫팅하여 아래 줄에 넣고 혼합하여 연속 희석을 수행합니다.

전체 플레이트에 대해 희석을 반복하고 맨 아래 줄에서 피펫팅된 마지막 25마이크로리터를 버립니다. 그런 다음 기생충 배양을 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 447회 g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.

오래된 매체를 붓고 새 매체 10ml를 넣으십시오. 다음으로 피펫을 사용하여 새 배지에 기생충 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다. Neubauer의 개선된 혈구계를 사용하여 계수하고 배양액을 밀리리터당 800만 개의 기생충으로 희석합니다.

배양액을 희석한 후 각 웰에 25마이크로리터의 기생충을 추가합니다. 플레이트를 섭씨 32도에서 60분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면 각 웰에서 40마이크로리터의 용액을 제거합니다.

각 웰에 90마이크로리터의 신선한 배지를 추가하고 섭씨 32도에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 10마이크로리터의 레사주린 기반 세포 생존도 용액을 추가합니다. 섭씨 32도에서 4시간 동안 배양합니다.

배양이 완료된 후 플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다. 평균 배경을 제거하고 정규화 후 웰의 형광을 DMSO 대조군과 절제하여 데이터를 분석합니다. 이 연구에서는 각각 120mg의 링크 아미드 수지를 사용하여 두 개의 펩토이드를 합성합니다.

제품은 역상 고압 액체 크로마토그래피를 통해 정제되고 목표 질량에 해당하는 분획이 결합되어 백색 분말로 얻어집니다. 두 개의 펩토이드에 대해 수집된 양은 순도 90% 이상의 분획에 대해 약 30%의 수율로 여기에 나와 있습니다. 제품 순도는 분석적 역상 HPLC를 사용하여 평가되고 아미드 골격의 흡광도인 220나노미터에서 시각화됩니다.

펩토이드는 둘 다 균질한 것으로 보입니다. L Mexicana에 대한 세포독성 분석의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다. 화합물의 5밀리몰 스톡 용액은 세포 배양 등급 DMSO로 만들어지며 강력한 데이터를 보장하기 위해 최소 2회 3회 테스트됩니다.

펩토이드 B는 펩토이드 A보다 생존 가능한 기생충의 비율을 줄이는 데 더 효과적이며 둘 다 용량 의존적 효과를 가지고 있음을 알 수 있습니다. 이 방법을 시청한 후에는 라이신 유형 및 아르기닌 유형 단량체를 모두 포함하는 펩토이드를 합성, 특성화 및 정제하는 방법과 Leishmania mexicana에 대한 세포 독성 분석에 이를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 펩토이드에 이중 양이온 기능을 추가하는 당사의 방법은 펩토이드 합성에 일반적으로 사용되는 서브모노머 방법에 간단한 한 단계만 추가합니다.

이 방법에 따라 길이가 다른 라이신 또는 아르기닌 유형 서브모노머를 추가하여 예를 들어 탄소 길이가 2-6개인 측쇄를 사용하여 라이브러리 다양성을 높일 수 있습니다. 펩토이드 합성을 시도하는 동안 원치 않는 추가 또는 삭제 제품을 방지하기 위해 단계 사이에 수지를 잘 세척하는 것을 기억하는 것이 정말 중요합니다. 이 방법은 연구자들이 혼합된 양이온 기능화 펩토이드의 생물학적 활성을 탐구하고 이 활성을 라이신 또는 아르기닌 유형 단량체를 독점적으로 포함하는 것과 비교할 수 있는 길을 열어줍니다.

마지막으로, 이 프로토콜에 사용되는 기생충과 여러 시약은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 말자. 따라서 항상 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 적절한 경우 흄 후드 또는 미생물 안전 캐비닛 내부에서 작업하는 것이 중요합니다.