Name: 이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: 학습하세요 리신형 및 아르기닌형 단량체를 포함하는 펩토이드 합성 방법을 통해 Leishmania mexicana에 대한 항기생충 활성을 평가하는 기술을. 이 프로토콜은 새로운 항감염제 개발에 활용됩니다.

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우리는 금융 지원을위한 공학 및 물리 과학 연구위원회 (EPSRC) (HLB)을 감사드립니다. 우리는 또한이 절차의 촬영 동안 그녀의 도움 스리 데비 Maalika Ramanoudjame 감사합니다.

펩 토이 드 1. 고상 합성 주 : 펩 토이 드를 수동 고체상 합성 펩 토이 드의 submonomer 절차를 사용하여 합성된다. 이 방법은 높은 결합 효율 좋은 최종 제품의 수율을 할 수 있습니다. 고상에의 합성은 과잉 반응물 각 단계의 마지막에 용이하게 제거 될 본 방법은 동일한 내에 포함되는 다른 작용 양이온 성 단량체 (즉, 아르기닌 형 리신 형 잔기)를 허용하기 위해 여기 수정 된 허용 시퀀스입니다. 1,2 <ol><li> 선형 펩 토이 드의 합성 주의 : 합성을 시작하기 전에 안전 평가를 수행합니다. 흄 후드에서 모든 반응을 수행하고 적절한 (즉, 일회용 니트릴 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트)로 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 다음 시약 및 용매를 사용하는 경우 특히주의하십시오. 디메틸 포름 아미드 (DMF)는 의심 기형 및 D입니다ichloromethane (DCM)이 발암 물질. N이며, N &#39;이소 프로필 카보 다이이 미드 (DIC) 및 피 페리 딘 호흡기 흡입을 통해, 눈, 피부에 유해하며, 피부 과민성을 일으킬 수 있습니다. 히드라진은 흡입하면 치명적 의심되는 발암 물질이며, 피부 나 눈에 심한 화상을 야기한다. 브로 모 산 또한 피부, 눈과 호흡기에 유해하고 접촉시 화상을 입을 수 있습니다. 트리 플루오로 아세트산 (TFA)는 휘발성 액체이며, 심한 화상 그렇게 취급에주의가 발생할 수 있습니다. 중부 장갑의 사용을 권장하고있다. <ol><li> 두 프릿으로 캡핑 된 폴리 프로필렌 20 ㎖의 반응 용기에 0.12 g의 FMOC 보호 스케이트장 아마이드 수지 (0.1 밀리몰, 전형적인 로딩 0.7 밀리몰 / g)를 추가한다. 수지를 팽윤시키고, 실온에서 적어도 60 분 동안 정치 용기를 떠나 5 ml의 디메틸 포름 아미드 (DMF)를 추가한다. 고상 추출 진공 플랫폼을 사용하여 DMF를 배출. </li><li> 팽윤 된 수지에 FMOC기를 탈 보호하기 위해, 2 ㎖의 피 페리 딘 용액을 추가 (DMF의 V에서 20 % / V). 에 용기를 놓습니다실내 온도 (450 RPM)와에서 통 플랫폼은 5 분 동안 흔들어. 진공 역을 통해 솔루션을 제거합니다. <ol><li> 2 ㎖의 피 페리 딘 용액 및 Fmoc 탈 보호를 반복하고, 실온에서 15 분 동안 진탕. 이전과 솔루션을 배출합니다. </li></ol></li><li> 2 ml의 DMF에 첨가하고 30 초 동안 수지를 혼합하여 수지를 세척 하였다. DMF를 드레인 세 번 이상 반복합니다. </li><li> 아세틸 들어 브로 모 아세트산 용액 (DMF 0.6 M) 및 1 ml의 추가 0.2 ㎖의 N, N &#39;이소 프로필 카보 다이이 미드 용액 (DIC, 50 % DMF에 V / V). 실온에서 20 분 동안 흔들어 반응 용기를 남겨주세요. 용액을 배출시키고 2 ml의 DMF로 3 회, 수지를 세척 하였다. </li><li> 변위를 들어, 아민 용액 (DMF 1.5 M) 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 60 분 동안 수지를 흔든다. 용액을 배출시키고 2 ml의 DMF로 3 회, 수지를 세척 하였다. <ol><li> 아르기닌 형 단량체를 추가하려면 단계 1.7을 따릅니다. 원하는 펩 토이 드 시퀀스에 따라, 서로 다른 아민추가됩니다. </li></ol></li><li> 반복 1.1.4와 1.1.5 단계를 반복합니다. </li><li> 구아니딘 관능 성 단량체 (즉, N의 Arg)를 포함하기 위해, 수지 보호 디아민 용액 (DMF 중 1.5 M) 중 하나를 가하여 실온에서 60 분 동안 진탕. <ol><li> 용액을 배출시키고 2 ml의 DMF로 3 회, 수지를 세척 하였다. </li><li> 무료 차 아민에 DDE 그룹을 추가하고 실온에서 60 분간 흔들어 2 acetyldimedone (0.2 g, 0.5 ml의 DMF 1 밀리몰, 10 당량)를 추가합니다. 용액을 배출시키고 2 ml의 DMF로 3 회, 수지를 세척 하였다. </li></ol></li><li> 원하는 순서가 될 때까지 1.1.7에 1.1.4에서와 같이 submonomer 합성을 계속합니다. 수지를 씻어 세 번 반복 2 ml의 DMF를 추가합니다. </li><li> 수지의 DDE 그룹을 탈 보호하기 위해 (DMF의 V IN / v)의 4 ml의 2 % 히드라진 용액을 첨가하고 실온에서 3 분 동안 흔들어. 솔루션을 배출하고 세 번 반복한다. </li><li> 용액을 배출시키고 2 ml의 DMF 삼t으로 수지를 세척IME를. </li><li> 및 N, N- 디 이소 프로필 에틸 아민 또는 DIPEA (유리 아민 당 6 당량) (DMF의 최소 부피, N의 Arg 단량체 단위, 즉 유리 아민 당 6 당량) 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘을 첨가하고 60 분 동안 실온에서 진탕 . </li><li> 솔루션을 배출하고 2 ml의 디클로로 메탄 3 회 수지를 씻는다. 다음 수지 절단 (2 절)까지 저장할 수있는 10 분 동안 공기 건조 수지를 남겨주세요. </li><li> 합성을 일시 중지하려면 세 번 DMF 2 ml의 수지를 씻는다. 2 ml의 DMF를 추가 합성 용기 스토퍼 흄 후드에서 실온에서 떠난다. 주 : 합성 임의 치환 공정 (diketopiperazines으로서 제 2 치환 공정을 제외하고 형성 될 수있다) 이후에 중지 될 수도있다. </li></ol></li><li> 측쇄 탈 수지로부터 절단 <ol><li> 표시 이후에 합성하는 동안 어느 시점에서 합성 (순도와 질량)의 진행 상황을 확인하기 위해 테스트 쪼개짐 착수시멘트 단계 첨가 또는 최종 시퀀스 DDE 보호기 또는 이후에 제거가 이루어지고있다. <ol><li> 새로운 8 ml의 폴리 프로필렌 프릿 카트리지로 반응 용기에서 약 10 수지 입자를 옮긴다. </li><li> 트리 플루오로 아세트산 절단 칵테일 용액 1ml를 첨가하여 (95 % TFA, 2.5 %의 H 2 O, 2.5 % 트리 이소 프로필 실란을 포함)을 실온에서 90 분 동안 진탕. </li><li> 둥근 바닥 플라스크 10 ㎖의에 프릿 반응 용기를 사용하여 수지에서 TFA 절단 칵테일을 필터링합니다. </li><li> 회전 증발기를 사용하여 절단 칵테일을 증발시키고, LC-MS 또는 HPLC 분석에 제출하기 위해 1 mL의 아세토 니트릴 / 물에 생성 된 오일을 재용. </li></ol></li><li> 최종 절단의 경우 : 합성에 사용한 것과 동일한 융해 된 폴리 프로필렌 반응 카트리지에 TFA 절단 칵테일 (95 % TFA, 2.5 %의 H 2 O, 2.5 %의 트리 이소 프로필 실란) 4 mL를 추가하고, 용기 커버. 실온에서 90 분 동안 흔든다. </li><li> 필터 일둥근 바닥 플라스크에 50 mL의 프릿에 반응 용기를 사용하여 수지로부터 E TFA 절단 칵테일. </li><li> 회전 증발기를 사용하여 절단 칵테일을 증발시켰다. TFA가 제거 된 후, 생성물을 오일로서 수득한다. 이 원유에서 TFA의 제거를 돕기 위해, 2 mL의 무수 디 에틸 에테르를 추가하고 펩 토이 침전한다. <ol><li> 어느 피펫을 통하여, 디 에틸 에테르를 제거하고 폐기 또는 회전 증발기를 사용하여 증발시켰다. 반복 디 에틸 에테르 침전 세 번. </li></ol></li><li> 10 ㎖ 아세토 나이트 릴 / 물로 산성화 용액 조 펩 토이 드를 용해 (V 물 중 50 % 아세토 니트릴, 0.1 % TFA / V). 미리 무게를 컨테이너에 전송, 20 ° C에서 동결 건조 분말을 동결 건조. </li></ol></li></ol> 2. 특성 및 정제 주 : 펩 토이 드 합성을 모니터링 할 수 있으며, C18 컬럼을 사용하고, EL 분석적 역상 HPLC로 평가 최종 펩 토이ectrospray 액체 크로마토 그래피 질량 분석 (LC-MS). LC-MS에 대한 용매의 모든 HPLC 용매 갓 준비를해야합니다. <ol><li> 분석 HPLC <ol><li> 작은 유리 병에 펩 토이 드의 1 mg의 무게. 용해와 물을 1 ml의 희석 아세토 니트릴의 최소 볼륨을 추가합니다. 펩 토이 드 완전히 용해되었는지 확인합니다. </li><li> 분석 HPLC에 10 μl를 주입 (제안 그라데이션 0-30 분 동안 100 % 용매 B를 위치 용매 A = 95 % 물, 5 % 아세토 니트릴, 0.05 % TFA 및 용매 B = 95 % 아세토 니트릴, 5 % 물, 0.03 % TFA) , 제조업체의 지침에 따라. </li><li> 220 nm에서 UV 스펙트럼을 시각화합니다. </li></ol></li><li> ESI LC-MS <ol><li> 단계 2.1.1에서와 같이 1 ㎎ / ㎖ 펩 토이 드 솔루션을합니다. </li><li> 대상 펩 토이 드의 분자량은 제조업체의 지침을 사용하여, 존재하는 경우를 결정하기 위해 LC-MS 전기 분무를 1 μl를 주입한다. </li><li> pept 펩 토이 드를 사용하는 시퀀스의 목표 질량을 확인계산기에 대한 지침에 따라 OID 계산기. (26)는이 웹 유틸리티는 질량 스펙트럼에서 볼 수있는 삭제 / 또한 제품의 할당을 할 수 있습니다. (26) </li></ol></li><li> 제조용 역상 HPLC <ol><li> 산성화시키고 2 ml의 물 / 아세토 니트릴 (95 % 물, 5 %의 MeCN, 0.1 % TFA)로 정제 펩 토이 드를 용해시키고, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 예비 RP-HPLC에 의해 정제. 분석 HPLC 및 열 크기에 따라 달라집니다 주입 된 양에서 얻은 용출 시간을 기준으로 기울기를 결정합니다. </li><li> 220 nm에서 설정 검출기를 사용하여 시각화. </li><li> 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 분수가, 20 ° C 및 동결 건조에서 동결 수집합니다. </li><li> LC-MS와 제조사의 프로토콜에 따라 분석 HPLC를 사용하여 분수를 다시하는 것은-분석 할 수 있습니다. 정제 된 분수를 재결합. </li></ol></li></ol> 슈만 편모충 멕시 카나 기생충에 대하여 3. 생물 테스트 카우기 :. 안전 평가는 합성을 시작하기 전에 수행해야합니다 슈만 편모충의 멕시 카나 전에 테스트를 시작하기 장소에 있어야합니다 영국과 적절한 통제 조치의 위험 그룹 2 병원체를 분류된다. 모든 작업은 클래스 2 미생물 학적 안전 캐비닛과 적절한 (즉, 니트릴 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트) 착용 적절한 개인 보호 장비에서 수행해야합니다. <ol><li> 기생충의 하위 문화 <ol><li> 30 초 동안 37 ° C를 물을 욕조에 병을 배치하여 1 ml를 -150 ° C 냉동 재고 슈만 편모충 멕시 카나 M379을 해동. </li><li> 비 벤트 캡 25 cm3의 세포 배양 플라스크 (15 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 pH를 7.0) 10 ㎖ 슈나이더의 곤충 매체에 원액을 전송. </li><li> 72 시간 동안 26 ° C에서 품어. </li><li> 상태를 확인하기 위해 현미경으로 기생충 (400X 배율)를 검사합니다. 일EY 곤충 무대 promastigotes, 많은 분열하는 세포와 로그 단계에서 procyclic 형태이어야한다. </li><li> 5 × 10 5 기생충 / ㎖ 3 일의 농도로 서브 배양 기생충에 의해 procyclic promastigotes을 유지한다. 노이 바 우어 개선 된 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li></ol></li><li> L.의 변환 포유 동물의 무대 무균의 amastigote 양식 (27)에 멕시 카나 곤충 무대 <ol><li> 날 0 : (15 % 열 - 불 활성화 된 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 pH를 7.0) 슈나이더의 곤충 매체에 5 × 10 5 기생충 / ㎖에서 로그 무대 기생충 10 ml의 문화를 준비합니다 25cm 3 셀 비 통풍 모자와 문화 플라스크. </li><li> 48 시간 동안 26 ° C에서 품어. </li><li> 주 3 : 5 분 447 XG에 50 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 전송 10 ML의 문화. </li><li> 오래된 매체를 붓고 20 %의 시간으로 보충 pH가 5.5에서 10 ml의 슈나이더의 곤충 매체 (추가) 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 먹고 불 활성화. 조심스럽게 피펫을 사용하여 새로운 매체 기생충의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 노이 바 우어 개선 된 혈구를 사용하여 기생충의 수를 계산합니다. 25 cm3의 세포 배양 플라스크의 pH 5.5 배지와 전사 5 × 105 기생충 / ml의 농도로 희석한다. </li><li> 약 6 일 동안 26 ° C에서 품어. </li><li> 9 일 : 현미경 (400X)에서 기생충을 검사합니다. 그들은 비 복제, 감염 metacyclic promastigote 단계에 있어야합니다. </li><li> 노이 바 우어 개선 된 혈구를 사용하여 기생충의 수를 계산합니다. pH가 5.5 중 5 × 105 기생충 / ml의 농도로 희석한다. </li><li> 세포 배양 10 ㎖를 제거하고 세포 배양 플라스크에 전송합니다. 5 일간 32 ° C에서 품어. </li><li> 일 14 : 현미경 (400X)에서 기생충의 모양을 확인합니다. 그들은 편모 문자가없는, 병원성 amastigote 단계에 있어야합니다promastigotes의 론적 및 분석을위한 준비. </li></ol></li><li> L.에 세포 독성 분석 멕시 카나 무균 amastigotes. 주 : 펩 토이 드의 생물학적 시험은 96 웰 플레이트에서 수행 높은 처리량 검정법을 사용한다. 이 프로토콜은 L.의 테스트를 설명 멕시 카나 무균 amastigotes하지만, 동일한 분석은 적절한 미디어에서 promastigote 무대 기생충에 수행 할 수있다. 60 분 동안 100 μM 후, 10 배 희석 한 다음 24 시간 동안 인큐베이션 - 화합물 3의 농도에서 기생충과 함께 배양된다. 결과 레사 주린 계 세포 생존 용액 (예 : 알라 마르 블루)과 배양 후 웰의 형광을 측정함으로써 획득된다. <ol><li> 화합물 재고 솔루션을 준비합니다. 분석 용 저울을 사용하여 최종 정제 된 생성물 펩 토이 1 밀리그램을 단다. 5 mm의 농도 분자 생물학 학년 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 적절한 볼륨을 추가합니다. 6 μL 씩을 확인하고-20 ° C에서 동결. </li><li> (100)에서 3 μM에 세중의 96 웰 플레이트 (권장 플레이트 레이아웃, 결과 섹션에서 볼 수있는 그림 6)에 복합 솔루션을 준비합니다. 맨 위 행 (즉, A)에서 각 화합물의 5 mM의 원액 2 μl를 추가합니다. 멀티 채널 피펫을 사용하여 위쪽 행 (PH 5.5 및 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)에서) 새로운 슈나이더의 곤충 배지 48 μL를 추가한다. 다른 모든 행 (- F B)를 25 μL 슈나이더의 곤충 매체를 추가합니다. <ol><li> 맨 윗줄에서 피펫 25 μl의 솔루션에 의해 일련의 희석을 수행하십시오. 아래의 행을 추가하고 혼합한다. 지난 25 μl의 용액을 폐기해야합니다 마지막 행까지 희석을 수행하십시오. </li><li> 세중에서 음성 대조군과 같은 긍정적 인 제어 및 DMSO (2 % 용액)로 암포 테리 신 B (5 mM의 주식)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 기생충 솔루션을 준비 : 전송 문화를 50 ml의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에로5 분 447 XG. 오래된 매체를 붓고 (PH 5.5에서 20 %의 FBS, 1 % P / S) 10 ml의 슈나이더의 곤충 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 피펫을 사용하여 새로운 매체 기생충의 펠릿을 용해와 노이 바 우어 개선 된 혈구를 사용하여 계산합니다. 8 × 10 6 기생충 / ㎖로 문화를 희석. </li><li> 25 μL L. 추가 각 웰에 멕시 카나 문화. 32 ° C에서 60 분 동안 접시를 품어. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 각 웰에서 40 μl의 솔루션을 제거합니다. </li><li> 90 μL에게 신선한 매체를 추가하고 32 ° C에서 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 각 웰에 10 μl를 레사 주린 기반 세포 생존 솔루션을 추가합니다. 32 ° C에서 4 시간 동안 품어. </li><li> 제조업체의 지침에 따라, (λ 안에 600 nm의 =, λ의 예 = 540 ㎚) 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정한다. (중간에서만 웰) 평균 배경 제거와 T에 대해 정규화 한 후 웰의 형광을 비교하여 데이터를 분석그는 컨트롤을 DMSO. </li></ol></li></ol>

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<html> 펩 토이 드는 점점 신규 치료제 3-5 세포 전달 제로서 애플리케이션의 화학 생물학 및 의약 화학 분야에서 연구되고있다 (18, 20)과 진단 툴. (29)은 일반적으로,이 서열은 위에 병원체에 대한 선택성의 정도를 제공하는 양이온이다 포유 동물 세포의 세포막을 관통하며, 수성 시스템에서의 용해도를 원조 할 수있는 능력. 문헌에서 단독으로 라이신 또는 아르기닌 모방 잔류 물을 포함하는 양이온 펩 토이 드의 수많은 사례가있다. 그러나, 지금까지 동일한 순서로 이들 양이온 성 잔기를 모두 포함 펩 토이 드의 합성은 적합한 합성 방법의 부족에 의해 방해되어왔다. 여기에 설명 된 프로토콜을 혼합 양이온 펩 토이 드 효율적인 방식으로 합성 할 수 있으며이 양친 매성 펩 토이 드의 생물학적 및 화학적 성질을 조절하는 경로를 제공로서 매우 바람직하다. NT는 &quot;&gt; 우리의 방법은 일반적으로 사용 submonomer의 펩 토이 드 합성 적응을 사용하며, 동일한 시퀀스 내에서 모두 라이신과 아르기닌 - 타입 단량체의 첨가를 허용한다. 실온 커플 링을 사용하며이 방법 것으로 예상되도록 그룹 화학 보호 설립 연구 그룹의 대부분에 유용 할 것이다. 아르기닌 형 잉위한 직교 보호를 추가하려면 보호 디아민 DDE-OH. 디아민 다양한 될 수로 60 분 커플 표준 용량 조건하에 첨가하고 보호 각각 1,6- 디아 미노 헥산에 1,2- 디아 미노가. 보호기 DDE-OH는 DMF에 잘 용해 즉, 설치하는 긴 2 탄소 6 개의 탄소에서 사이드 체인을 허용하고 매우 효율적이고 선택적 보호 그룹 인 사용 주 아민은. DDE를 보호 그룹은 영향을받지 예를 들어, 펩 토이 드 체인의 보호되지 않은 N 말단을 2 급 아민을 떠난다. 30 한 제한이있는가 SYN의 모든논문 수동으로 수행되었다; 그러나, 개발 커플 링 조건 자동화 펩티드 / 합성 펩 토이 드와 함께 사용하기위한 방법은 의무 할 것으로 예상된다. DDE를 집단의 수지에 탈 보호 된 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘을 사용하여 수지에 guanidinylated 수 유리 아민을 떠나야 DMF 2 % 히드라진 용액을 사용하여 수행된다. 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘 여섯 당량 및 DIPEA 여섯 등가물 수지에 유리 아민 당 사용된다 (즉, 각 N의 Arg 계 단량체 여섯 당량이 설치된다). 또,이 반응은 효율적이며 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘 시약 DMF에서 우수한 용해도를 갖는다. 반응 완료는 전형적으로 실온에서 60 분, LC-MS를 통해 알 수있다. submonomer 방법의 다양성에 일차 아민의 다양한이 치환 공정에서 사용할 수있는 조건으로 인해 결합 effi을 높이기 위해 최적화 될 필요가있을 수 있으므로위에서 설명한 순서에 대한 ciency 및 전체 제품 수율 또는 순도. (31)는, 특별한 조건이 성공적으로 커플 링 필요 없었다. 그러나 더 이상 변위 시간 이상 아민 농도는 문제가 변위 (즉, 잘못 친 핵성 또는 입체적으로 부피가 큰 아민의 경우)에 사용될 수 있습니다. 일부 아민이 경우 대신 submonomer 합성 이전 광범위한 방법과 같이 N 메틸 -2- 피 롤리 돈 (NMP) 또는 고상 반응을위한 다른 적절한 용제에 이들을 용해 권장 DMF에 완전히 용해하지 않을 펩 토이 드들. 32 클로로 아세트산을 사용하여 아세틸 화는 다른 그룹에 의해 효과적인 것으로 밝혀졌다, 측쇄에서 보호되지 않은 헤테로 원자를 함유 단량체를 포함한다.도 33은 또한 다른 수지 다른 C 단자 작용과 펩 토이 드를 수득하기 위해이 방법을 이용할 수있다. 왕 수지 및 2- 클로로 트리 클로라이드 수지는 일상적으로 사용펩 토이 드의 submonomer 합성. 예를 들어,이 방법은 성공적으로 스케이트장 아마이드 여기 (사용 된 특정 수지에 따라 다름) 논의에 2 다른 고체 지지체가 다른 넣기 절차가 필요합니다. 우리 그룹 2 - 클로로 트리 클로라이드 수지로 사용되어왔다 그래서 이것은 문헌으로 확인해야 합성하기 전에. 펩티드 합성 마찬가지로, 펩 토이 드 오프 수지의 최종 분해의 조건은 특정 서열에 대해 최적화 될 수있다. 이 프로토콜에서, TFA 절단 칵테일 (청소부와 같은 트리 이소 프로필 실란 및 물)를 사용 하였다. 여기에 제시된 펩 토이 드는 합리적으로 산 불안정 그룹에만 BOC 보호가 포함되어 있습니다. 이상 절단 시간 필요할 수 보호 잔기 또는 불안정한 보호기 적은 산의 큰 비율이 서열의 완전한 탈 보호를 보장하기 위해 (즉, 2 시간 초과 분해 시간은 PBF 또는 고등 BU를 포함하는 서열을 권장TYL 에스테르 보호 그룹). (예를 들어, 에탄 디티 올, 2- 메르 캅토 에탄올 종종 시스테인 또는 메티오닌과 같은 황 함유 측쇄를 가질 펩티드의 사용을 위해) 대안 거제는 전문 측쇄에 사용될 수있다. 제시된 생물학적 분석은 상이한 세포주에 맞게 변경 될 수있는 표준 독성 시험이다. 각 96 웰 플레이트를 얻은 결과의 신뢰도를 허용하기에 충분한 제어를 포함한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 병을 치료하기 위해 사용되는 공지 약물이기 때문에,이 경우, 암포 테리 신 B는 양성 대조군으로 사용되며, 이는 분석을 위해 화합물 축적량을 확인하는 데 사용되는 용매가 그대로 DMSO가 음성 대조군으로서 사용된다. 다른 세포주가 사용되는 경우, 다른 적합한 제어 수득 및 사용하기 전에 확인한다. L. 멕시 1 시간 (100) 및 2 μM의 농도 사이에서 펩 토이 드와 함께 배양되고, 그 후 기생충 / 펩 토이 드 용액으로 희석(즉, 우물이 처음에 100 μM 펩 토이 드 재고 10 μM로 희석) 하룻밤 배양을위한 10 배. 세포 생존율 시약은 분석의 단부에 각 웰 (총 웰 용적의 10 %)에 첨가된다. 가시 색상 변경없이 실행 가능한 기생충 (파란색)과 가능한 기생충의 중간 숫자 사이의 스펙트럼 가능한 기생충 (핑크), 제어 우물과 우물 사이에 볼 수있다. 형광은 살아있는 세포의 수에 비례하여 세포의 대사 활동에 대응하고; 레사 주린 염료 (비 형광) 대사 적 활성 세포의 환원 반응에 의해 형광 레조 루핀 (resorufin)로 변환된다. (34)이 분석에서, 세포 생존 시약 배양 시간은 L. 최적화되었습니다 멕시 카나. 플레이트 달라질 가능성 시약 배양 시간은 다른 세포 농도 또는이 방법을 사용할 수도있다, 예를 들어 상이한 세포주 (시드) 포유 동물 세포와. 사용되는 정확한 플레이트 판독기에 의존는 고려 형광 측정을 수행하기 전에 이루어질 필요가있다. 웰 기포 정확한 측정이 수행 될 수 있도록하기 위해 제거되어야한다. 일부 플레이트 리더는 경우 평면 사용되어야한다 96 웰 플레이트를 바닥있는 판의 바닥에서 읽습니다. 다른 컴퓨터는 판의 상부로부터 판독 할 수 있으므로 플레이트의 뚜껑을 측정하기 전에 제거되어야한다. 마지막으로, 앞으로,이 프로토콜은 동시에 여러 서열을 제조 할 수있는 자동화 된 합성기와 호환 될 수있다. 또한, 환상 펩 토이 드의 합성은이 방법을 사용하는 것도 가능하다. 이 프로토콜은 물질 또는 의약 분야를 포함한 다양한 애플리케이션에 이용 될 수도있다 라이신과 아르기닌 형 단량체 모두 신규 한 펩 토이 드 골격에 액세스하는 데 사용할 수있는 실용적인 합성 절차 연구를 제공한다.

펩 토이 드 (또는 폴리 N은 글리신 - 치환) 펩티드 유사한 특성을 제공하며, 같은 점점 더 의약 및 재료 응용 프로그램에 대한 연구되고있다 펩타이드 모방 체의 클래스입니다. 펩티드에서 각 아미노산의 측쇄는 아미드 주쇄의 α 탄소에 연결되고; 펩 토이 드의 측쇄가 주쇄의 질소 원자에 시프트된다. 결정적으로,이 펩 토이 드에게 단백질 분해에 더 큰 저항을 제공합니다. 펩 토이 드 일반적으로 1이다. Zuckermann 외., 펩 토이 드 단량체 고체 지지체 및 일차 아민을 사용하여 할로겐 후속 변위에 부착 된 아민 관능기 순차적 haloacetylation에 의해 만들어 질 수 의해 개척 submonomer 방법을 사용하여 합성된다 우리 그룹은 최근 개발 이 submonomer 방법에 대한 적응은 라이신과 아르기닌 형 펩 토이 드 잔류 물은 F에 대해 동일한 펩 토이 드 순서에 포함 할 수 있도록하는IRST 시간.이 합성 펩 토이 드하는이 매뉴얼 고상 방법은 실험실의 대부분이 접근 할 수 있도록 시판 시약 및 일반적인 실험실 장비를 사용합니다. 펩 토이 드 그람 음성균, 알려진 많은 항균 펩타이드에 필적 그람 양성 세균 및 진균 종의 넓은 범위에 대해 유망한 활동을하는 것으로 나타났다. 3-9 우리의 연구에서 펩 토이 드는 소외 열대 질환 슈만 편모충 증의 치료를위한 새로운 항 감염 화합물로 사용되어왔다. 5, 10 리 슈만 편모충 증은 전 세계적으로 80 개국 이상에서 발병이며이 만 12 명 이상이 전 세계적으로 감염되는 것으로 추정된다. 11를 질병은 샌드 플라이의 입에 의해 전송되는 원생 동물 기생충에 의해 발생합니다. 슈만 편모충 종은 피부 리 슈만 편모충 증, 점막에 흉터 및 손상에 이르게하는 조건, 또는 생명을 위협하는 내장 휴식을 일으킬 수 있습니다치명적인 장기 손상의 원인 hmaniasis. 백신이 질병중인없고 기존의 치료는 심각한 부작용을 약물의 적은 수에 의존한다. 또한, 기존의 약제에 대한 내성 때문에 새로운 치료법이 절실히 효과적으로 앞으로 슈만 편모충 증을 치료하기 위해 필요한 신흥 심각한 문제이다. 12-16 이러한 항균 애플리케이션에서, 펩 토이 드 종종 양이온 및 소수성 단량체의 혼합물 매성되도록 설계된다. 3,4- 이것은, 펩 토이 드를 균체 향해 선택성의 정도를 제공 포유류 세포에 독성을 감소시키고, 분자 수송 체로서의 활성을 향상시킬 수있다 . 17-20 문헌 항 감염성 펩 토이 드의 대부분 배타적 아미노 관능 리신 형 모노머 또는 아르기닌 잔기 형 어느 구성되는 양이온 성 측쇄를 함유한다. 양이온 체인이 ㄱ 구성되어 펩타이드 펩 토이 드의 키메라,미노 아미노산 리신 또는 아르기닌은 또한 활성 및 독성에있어서, 양이온 성 기의 효과를 조사하기 위해 합성되었다. 21-25 폴리 리신 펩 토이 드 용이 시판 BOC 보호 된 아민을 이용하여 합성 할 수있다. 폴리 아르기닌 펩 토이 드는 guanidinylation 제로서 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘을 사용하는 방법을 사용하여 제조 될 수보고. 펩 토이 제거 측쇄상의 수지 및 BOC 보호로부터 절단 된 후 18하지만, 이것은 단지 따라서 수행 될 수있다 시퀀스 내의 모든 리신 형 잔기가 아르기닌 잔기로 전환된다. 미세 조정하기위한 노력으로 화합물의 화학적 및 생물학적 특성은, 우리는 (예를 들어, N리스 및 N의 Arg)이 처음으로 임의의 주어진 펩 토이 드 시퀀스에 포함되는 이중 양이온 성 기능성을 허용하는 방법을 개발 하였다. (2) 여기서, 우리는 TW의 합성, 정제 및 특성을 설명동일한 순서로 모두 라이신과 아르기닌 형 잔류 물을 포함하는 새로운 펩 토이 드 오. 이 방법은 guanidinylation 시약과 같은 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘으로 수지에 직교하는 N과 N -Boc -Dde 보호를 이용한다. 이러한 펩 토이 드의 생물학적 평가도 슈만 편모충 멕시 카나, 피부 리 슈만 편모충 증의 원인균에 대한 세포 독성 분석에서 설명된다. 이러한 이중 기능성 양이온 펩 토이 드에 액세스하고 자신의 생물학적 활성을 평가하기위한 실용적인 방법을 제공한다. 또한이 방법은 앞으로 펩 토이 커뮤니티 매성 펩 토이 드의 합성을 돕는 것으로 예상된다.

<table><tbody><tr>이 준비에 사용되는 2 개의 프릿 <td>Crawford Scientific</td><td>12131017 및 12131015</td><td>20 ml 및 6 ml 카트리지</td><td>가있는 폴리 프로필렌 고체상 추출 카트리지</td></tr><tr><td>트리 플루오로 아세트산</td><td>도쿄 화학 산업 (유럽)</td> <td>T0431-100g</td> <td>> 98 %; 주의: 심한 화상과 호흡기 자극을 유발할 수 있음</td></tr><tr><td>N,N'-diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>38370-100ML</td><td>>98%; 주의: 눈, 피부 및 호흡기 흡입을 통해 유해하며 감작을 유발할 수도 있습니다</td></tr><tr><td>디메틸포름아미드</td><td>Fischer Scientific</td><td>10346180</td><td>HPLC 등급; 주의: 의심되는 기형 유발 성분</td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10407440</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>10354263</td><td>99.8%; 주의: 의심되는 발암 물질</td></tr><tr><td>Bromacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17000-100G</td><td>>99%; 주의 : 화상을 일으키고 피부, 눈 및 호흡기에 유해</td></tr>합니다 <tr><td>(S) -(-) -알파 메틸 벤질 아민</td><td>시그마 알드리치</td><td>115568-100G</td><td>98 %; 주의 : 삼키면 유해하고 피부와 접촉하면 독성이 있으며 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 일으키며 Nspe 단량체</td></tr> <tr><td>N-Boc 1,4-diaminobutane</td><td>Tokyo Chemical Industry (Europe)</td> <td>A1373-25g</td> <td>>98 %를 합성하는 데 사용됩니다. 주의 : NLys 단량체</td></tr> <tr><td>N-Boc 1,2- 디아 미노 에탄</td><td>도쿄 화학 산업 (유럽)</td> <td>A1371-25g</td> <td>> 97 %를 합성하는 데 사용되는 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 유발합니다. 주의 : 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으키며 Nae 단량체</td></tr><tr><td>1,2- 디아 미노 부탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>D13208-100G</td> 99 %를 합성하는 데 사용됩니다<td>. 주의: 인화성 액체 및 증기, 삼키거나 흡입하면 유해하고 피부와 접촉하면 독성이 있으며 NhArg 단량체</td></tr><tr><td>1,4-diaminoethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550-250ML</td><td>>99.5%의 합성에 사용되는 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 유발합니다. 주의: 가연성 액체 및 증기, 삼키거나 흡입하면 유해하며, 피부와 접촉하면 독성이 있으며, 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으킵니다. NnArg 단량체의 합성에 사용됩니다 &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1H-피라졸-1-카르복사미딘 HCl 시</td><td>그마 알드리치</td><td>402516-10G</td><td>HCl 염으로; 주의: 삼키면 유해하며 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있으며 심각한 눈 손상을 일으킵니다.</td></tr><tr><td>히드라진 일수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>207942-5G</td><td>시약 등급; 주의: 발암 물질로 의심되며 흡입하면 치명적이며 피부와 눈에 심한 화상을 입힙니다</td></tr>. <tr><td>2-아세틸 디메돈</td><td>Novabiochem</td><td>8510150005</td><td>Dde-OH</td></tr><tr><td>링크 아미드 수지</td><td>Novabiochem</td><td>8551190005</td><td>100-200 mesh, 고하중</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411027-1L</td><td>>99.5%, 규제 물질이므로 구매 전에 적절한 허가를 받아야 합니다. 주의 : 고인화성 액체 및 증기, 삼키면 유해하고 피부와 접촉하거나 흡입하면 독성이 있으며 심각한 피부 화상 및 눈 손상을 일으키며 장기적인 영향으로 수생 생물에 해롭</td></tr>습니다 <tr><td>트리 이소 프로필 실란</td><td>시그마 알드리치</td><td>233781-50G</td><td>98 %; 주의: 가연성 액체 및 증기는 피부 자극 및 심각한 눈 자극을 일으킵</td></tr>니다. <tr><td>alamarBlue</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td></td><td>DAL1025 위험한 것으로 분류되지 않음</td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9895-1L</td><td>분말, 배지는 사용 전에 제조업체의 지시에 따라 만들어야 합니다. 생물학적 분석에 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>734-1793</td><td>평평한 바닥(바닥에서 형광 측정 가능), 조직 배양 처리된</td></tr><tr><td>용매 저장소</td><td>VWR</td><td>613-1182</td><td>멀티 채널 피펫과 함께 사용</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Starlab Group</td><td>S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810</td><td>사용된 피펫에 따라 팁의 부피가 다릅니다. 10&nbsp; &마이크로; 엘, 10 - 200&nbsp; &마이크로; l 및 1,000&nbsp; &마이크로; l 권장 분석</td></tr><tr><td>25 cm3 세포 배양 플라스크</td><td>VWR</td><td>734-2312</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0791</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드 (분자생물학 등급)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td>위험으로 분류되지 않음</td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 소 세럼</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>10082139-100mL</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFischer&nbsp;</td><td>15140148-20mL</td><td>약어: P/S</td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>시그마 알드리치</td><td>46006-100mg</td><td>암포테리신 B 삼수화물, VetranalTM 분석 표준</td></tr></tbody></table>

이들 안티 leishmanial 역가의 혼합 리신 형 / 아르기닌 형 단량체 및 평가를 펩 토이 드의 합성을위한 효과적인 방법

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

이 프로토콜은 서로 다른 두 개의 기능화된 양이온 단량체를 포함하는 선형 펩토이드의 수동 고체상 합성을 설명합니다. 이 절차에서 아미노 기능화된 'lysine' 및 guanido 기능화된 'arginine' 펩토이드 단량체는 동일한 펩토이드 서열 내에 포함될 수 있습니다. 이 절차는 온 레진(N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)에틸) 또는 Dde 보호, 라이신 단량체의 Boc 보호에 직교하는 조건을 사용합니다. 후속 탈보호는 효율적인 수지 상의 구아니디닐화 반응을 통해 아르기닌 잔기를 형성할 수 있습니다. 이 절차는 펩토이드 합성에 일반적으로 사용되는 서브모노머 방법과 호환되므로 일반적인 실험실 장비와 시중에서 판매되는 시약을 사용하여 간단한 펩토이드를 만들 수 있습니다. 두 개의 혼합 펩토이드의 대표적인 합성, 정제 및 특성화가 설명됩니다. Leishmania mexicana에 대한 스크리닝 분석에서 잠재적인 항감염제로서 이러한 화합물을 평가하는 것도 설명됩니다. 원생동물 기생충 L. mexicana는 전 세계적으로 최대 1,200만 명에게 영향을 미치는 방치된 열대 질환인 피부 리슈마니아증의 원인 병원체입니다.

대표적인 결과 두 리신 형 단량체 및 두 아르기닌 계 단량체 각각 설명한다 함유 12 개의 잔기 펩 토이 드의 합성 및 특성화있다. 세포 독성 분석에서 후속 결과도 표시됩니다. 두 펩 토이 드 [(N narg를 N SPE의 N의 SPE) (N AE N SPE의 N의 SPE)] 2 (a) 및 [(N은 HARG N SPE의 N의 SPE) (N리스 N의 SPE의 N의 SPE)] 2 (b)는 합성 사용 120 mg의 스케이트장 아마이드 각 (로드 = 0.79 밀리몰 / g)을 수지. 상업적으로 구입 한 시약과 함께, 전술 한 바와 같이 모든 아세틸 및 치환 단계를 수행 하였다. 이들 잔기를 들어, 다음의 아민은 치환 공정에 사용 하였다 : N의 SPE (S) - (-) - α - 메틸 벤질 아민을 N AE N - (제 3 부 톡시 카르 보닐) -1,2- 다이아inoethane, N리스 N - (제 3 부 톡시 카르 보닐) -1,4- 디아 미노 부탄. 아르기닌 유도체 잔기를 들어, 다음 비보호 디아민 결합했다 : N HARG 1,4- 디아 미노 부탄 또는 N narg를 1,2- 디아 미노는 (DDE-OH) 2와 acetyldimedone에 수지 보호 하였다. 전체 서열이 합성 된 후 상기 DDE의 히드라진 guanidinylate 탈 보호하는 유리 아민을 산출한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig1.jpg" /> 그림 1. 펩 토이 드 구조의 (a) (N narg를 N SPE의 N의 SPE) (N AE N SPE의 N의 SPE)] (2)와 (b) (N HARG N SPE의 N의 SPE) (N <stro<html> NG&gt;리스 N SPE의 N의 SPE는)] 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig2.jpg" /> 도 2. 제가 혼합 아르기닌 / 리신 펩 토이 드를 합성하기 위해 사용하는 방법. 디아민과 submonomer 방법에서 표준 치환 공정; II. DDE-OH 90 분 추가 무료 아민을 보호하기 위해; III. 또한 추가의 submonomer 방법을 사용 펩 토이 체인을 확장하는 단계; IV. DDE은 DMF 2 % 히드라진을 사용하여 탈 보호; . DMF에 피라 졸 -1- 카 복스 아미 딘 및 DIPEA와 수지에 유리 아민의 V Guanidinylation; VI. BOC 기의 탈 수지로부터 산성 절단.large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. (a) 154 ㎎, (b) 163 mg을 : 수지 및 동결 건조에서 절단 후, 조질 제품 흰색 분말로서 수득 하였다. 최대 50 mg의 주사가 분석 컬럼에 UV-힘 검출기 (λ = 250 ㎚)와, 250mm X 10mm, 5 μm의 LC 펌프를 이용하여 설명한 바와 같이 제품 RP-HPLC로 정제 하였다; 속도 = 2 ml / 분 유량. 대상 질량에 대응하는 분획을 합하여 백색 분말로서 수득 하였다 : (a) 54 mg의 (b) 65 ㎎, 90 % 순수한 분획&gt; 약 30 %의 최종 수율. 정제 후의 최종 화합물 아이덴티티는 UPLC 및 포토 다이오드 어레이 검출기가 장착 된 삼중 사중 극 질량 분석 장치를 사용하여 LC-MS (도 3 참조)에 의해 확인되었다. 정확한 질량 분석 t에서 동일한 분석 장치를 사용하여 수행 하였다<html> 그는 [M + 2H] 2+ 이온. 계산 다음과 관측 된 질량은 가까운 계약 (그림 4)에서 발견되었다한다 : (a) 계산 = 896.0026 AMU, 관찰 = 896.0038 AMU; (b) 산출 = 952.0691 AMU 관찰 = 952.0730 AMU. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig3.jpg" /> 정제 된 펩 토이 드 그림 3. LC-MS. (A) m / z = 1792와 (b) m / z = 1903. 상단이 TIC, 중간 LC-MS 스펙트럼, 220 nm에서 바닥 UV 크로마토 그램이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig4.jpg" /> 도 펩 토이 드 4. 정확한 질량 분석 데이터 (a)와 (b).&quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 생성물 순도는 분석적 RP-HPLC하여 평가 하였다 (3.5 μm의 분석 칼럼, 4.6 mm × 100 mm를 자외선 힘 검출기 LC 펌프, 유량 = 1 ㎖ / 분), 220 nm의 흡광도에서 가시화 아미드 주쇄.도 5a 및도 5b는 화합물이 균질 것을 보여준다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig5.jpg" /> 도 5 분석 정제 된 펩 토이 드 용 HPLC (a) 및 (b). 40 ° C (A = 95 % H 2 O 5 %을 MeCN, 0.05에서 30 분, 컬럼 오븐 위에 구배 0 ~ 100 %의 B가있다 % TFA]. B는 95 %을 MeCN은 5 % H 2 O, 0.03 % TFA)은 = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig5large.jpg" target="_blank">카스티주세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. 정제 된 펩 토이 드 (a) 및 (b)는 L. 대해 세포 독성 분석법에서 시험 하였다 멕시 카나 무균 amastigotes. L.의 냉동 주식 멕시 카나는 해동 및 분석을위한 준비 amastigote 단계로 전환되었다. 72시간 해동 후, 기생충은 많은 분열하는 세포와 로그 단계에서 자신의 procyclic 형태의 곤충 무대 promastigotes을해야한다. 이 단계에서 기생충 변환의 일 9시. (27)에 기술 된 pH 및 온도 변화를 이용하여 amastigote 단계로 변형 될 수 있으며, 기생충은 비 복제 감염성 metacyclic promastigote 단계에있을 것이다. 마지막 날 (14)에서, 기생충은 기생충이 promastigotes의 특성 편모 부족 병원성 amastigote 단계에 있어야합니다. (28) 화합물 5 mM의 스톡 용액을 세포 배양 등급의 DMSO에서 만든에서 삼중 시험 하였다강인 데이터 세트를 확인하는 두 차례의 최소 수집 하였다. 대표적인 96- 웰 플레이트 계획은도 6에 도시되어있다. 상기 분석의 끝에, 세포 생존 시약은 각각의 시험 농도에서 기생충의 생존을 계산하는 바와 같이 (도 7 참조 측정 각 웰 형광 가하고 ). ED 50 값 펩 토이 드 (a)&gt; 100 μM, 37 μM 각각 펩 토이 드 (B)로 계산 하였다. 오차 막대는 표준 편차 웰 사이의 편차를 보여 플로팅 이들 대부분 바 합리적임을 알 수있다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig6.jpg" /> (양성 및 음성 대조군 포함) 2 펩 토이 드 솔루션에 세포 독성 분석 그림 6. 대표 96 웰 플레이트 계획. + = 매체 의대 (슈나이더의 곤충 중간의 pH 5.5, 20 % FBS, 1 % P / S). L. MEX. =의대 + 8 × 10 6 / ml의 기생충 문화. AmphoB = DMSO 5 mm이다. DMSO의 펩 토이 드 = 5 밀리미터 주식 솔루션. 빈 우물은 멸균 수를 포함해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54750/54750fig7.jpg" /> L.에 대한 세포 독성 분석 7. 결과를 그림 펩 토이 드를 사용 멕시 무균 amastigote 기생충 (a) 및 (b). 펩 토이 드 (b)는 (a) 두 화합물은 농도 의존적 효과를 갖는, 가능한 기생충의 비율을 줄이는 펩 토이보다 더 효과적임을 알 수있다. 플롯 에러 바는 표준 편차로 우물 사이의 변화를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

동일한 순서로 양이온 기능이 혼합된 펩토이드를 합성하는 프로토콜이 제시됩니다(라이신 및 아르기닌 유형 단량체). 피부 리슈마니아증을 일으키는 원생동물 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이러한 화합물의 후속 테스트도 설명됩니다.

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

본 절차의 전반적인 목표는 동일한 펩토이드 서열 내에 리신 및 아르기닌 유형의 단량체를 모두 도입하고, 소외 열대 질환인 피부 리슈만편모충증의 원인 기생충인 Leishmania mexicana에 대한 이 화합물들의 활성을 평가하는 것입니다. 피부 리슈만편모충증을 위한 새로운 치료제가 시급히 필요한 상황이며, 본 절차는 이 소외 열대 질환에 대한 새로운 잠재적 항감염제 클래스로서 펩토이드를 식별하고 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 혼합 양이온 기능을 포함하는 펩토이드를 합성할 수 있다는 점입니다.이는 서열의 생물학적 활성을 조절하는 데 도움이 될 수 있으므로 매우 바람직합니다. 이 방법은 기생충의 포유류 형태를 대상으로 테스트하지만, Leishmania mexicana의 곤충 단계에 사용하거나 포유류 세포주에 적용할 수도 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 합성의 단계적 특성과 Leishmania mexicana 생애 주기 각 단계에서의 기생충 배양 모습을 보여주기 때문에 매우 유용합니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 디메틸포름아마이드 용액을 준비하십시오. 그런 다음, 두 개의 프리트가 있는 캡이 달린 20-milliliter 폴리프로필렌 반응 용기에 Fmoc-protected rink amide resin 0.1 millimoles를 넣습니다. 디메틸포름아마이드 5 milliliters를 첨가하고 용기를 상온에서 60분 동안 그대로 둡니다.그 후, 고체상 추출(solid phase extraction) 진공 플랫폼을 사용하여 DMF를 제거합니다. 다음으로, 준비된 piperidine 용액 2 mL를 첨가합니다. 용기를 실온의 셰이커 플랫폼에 놓고 450 RPM으로 5분 동안 흔들어 줍니다.진공 스테이션을 사용하여 용액을 배출합니다. 그 다음, 피페리딘 용액 2 mL를 첨가하고 동일한 조건에서 15분 동안 흔들어 줍니다. 교반이 완료되면 진공 스테이션을 통해 용액을 배출합니다.레진을 세척하기 위해 2 mL의 DMF를 첨가하고 30초 동안 혼합합니다. DMF를 배출하고 세척 과정을 3회 반복합니다. 서브모노머 합성을 시작하려면, 준비된 bromoacetic acid 용액 1 mL와 준비된 DIC 용액 0.2 mL를 첨가합니다.실온에서 20분 동안 흔들어 섞어줍니다. 그런 다음 용액을 따라내고 2 mL의 DMF를 사용하여 세 번 세척합니다. 준비된 아민 용액 1 mL를 첨가합니다.그 다음, 상온에서 수지를 60분 동안 흔들어 줍니다. 용액을 따라내고 2 mL의 DMF를 사용하여 수지를 세 번 세척합니다. 이어서, 브로모아세트산 용액 1 mL와 DIC 용액 0.2 mL를 첨가합니다.실온에서 20분 동안 흔들어 줍니다. 그 다음, 용액을 따라내고 2 mL의 DMF를 사용하여 세 번 세척합니다. 구아니딘 기능화 단량체를 도입하려면, 보호기가 없는 디아민 용액 1 mL를 수지에 첨가합니다.실온에서 60분 동안 흔들어 줍니다. 그런 다음, 용액을 따라내고 2 mL의 DMF로 수지를 세 번 세척합니다. 준비된 2-acetyl dimedone 용액 0.5 mL를 첨가합니다.실온에서 60분 동안 흔들어 섞습니다. 그 후, 용액을 따라내고 레진을 2 mL의 DMF로 3회 세척합니다. 원하는 서열이 만들어질 때까지 서브모노머 합성을 계속합니다.그 다음, 준비된 hydrazine 용액 4 mL를 첨가하고 실온에서 3분 동안 흔들어 섞어줍니다. 용액을 따라내고 이 과정을 3회 반복합니다. 이후, 매회 2 mL의 DMF를 사용하여 레진을 3회 세척합니다.펩토이드 서열의 유리 아민당 DIPEA와 6당량의 pyrazole-1-carboxamidine을 첨가합니다. 실온에서 60분 동안 흔들어 섞어줍니다. 교반이 완료되면 용액을 따라 버립니다.각 세척 시 2 mL의 dichloromethane을 사용하여 수지를 세 번 세척합니다. 수지를 10분 동안 공기 건조한 후 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다. 합성 진행 상황을 확인하기 위해 아민 첨가 후 테스트 절단을 수행할 수 있습니다.최종 절단을 시작하려면, 합성에 사용했던 동일한 소결 반응 카트리지에 절단 칵테일 4 mL를 첨가하고 용기를 덮습니다. 상온에서 90분 동안 흔들어 줍니다. 그런 다음, 소결 반응 용기를 사용하여 레진으로부터 절단 칵테일을 둥근 바닥 플라스크로 여과합니다.회전 증발기를 사용하여 절단 칵테일을 증발시킵니다. 펩토이드(peptoid)를 침전시키기 위해 무수 디에틸 에테르 2 mL를 첨가합니다. 피펫을 사용하여 디에틸 에테르를 제거하고 폐기합니다.그런 다음, 디에틸 에테르 침전 과정을 3회 반복합니다. 침전이 완료되면, 조(crude) 펩토이드를 미리 준비한 10 milliliters의 아세토니트릴 및 산성수 용액에 녹입니다. 이를 미리 무게를 측정한 용기에 옮깁니다.그 후, -20 °C에서 냉동하고 동결 건조하여 역상 HPLC 정제에 사용할 수 있는 건조 분말 상태로 만듭니다. Leishmania mexicana 기생충을 배양하고 무균 amastigote 단계로 전환시킨 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 화합물 스톡 용액을 준비하여 세포독성 분석을 시작합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 96-well 플레이트의 첫 번째 줄에 5 mM 펩토이드 스톡 용액 2 µL, amphotericin B 대조군 및 DMSO 대조군을 첨가합니다.멀티 채널 피펫을 사용하여 맨 윗줄에 48 µL의 신선한 배지를 추가합니다. 나머지 모든 줄에는 25 µL의 신선한 배지를 추가합니다. 다음으로, 맨 윗줄에서 25 µL의 용액을 피펫팅하여 아래 줄에 추가하고 혼합함으로써 연속 희석을 수행합니다.마지막 하단 행에서 피펫팅한 마지막 25 µL를 버리면서 플레이트 전체에 대해 희석을 반복합니다. 그런 다음, 기생충 배양액을 50 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 447 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.기존 배지를 따라내고 신선한 배지 10 milliliters를 추가합니다. 다음으로 피펫을 사용하여 새로운 배지 내의 기생충 펠렛을 부드럽게 재부유시킵니다. Neubauer 개선형 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 수를 측정하고, 배양액을 milliliter당 8백만 마리의 기생충 농도로 희석합니다.배양액을 희석한 후, 각 웰에 기생충 25 µL를 첨가합니다. 플레이트를 32 °C에서 60분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 각 웰에서 용액 40 µL를 제거합니다.각 웰에 신선한 배지 90 µL를 첨가하고 32 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 그 후, 각 웰에 resazurin 기반 세포 생존능 솔루션 10 µL를 첨가합니다. 32 °C에서 4시간 동안 배양합니다.배양이 완료되면 플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정하십시오. DMSO 대조군에 대해 정규화한 후, 평균 배경값을 제거하고 웰의 형광을 비교하여 데이터를 분석하십시오. 본 연구에서는 각각 120 milligrams의 rink amide resin을 사용하여 두 가지 펩토이드를 합성하였습니다.생성물은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse-phase high-pressure liquid chromatography)를 통해 정제하며, 표적 질량에 해당하는 분획들을 모아 흰색 분말로 얻습니다. 두 펩토이드(peptoids)에 대해 수집된 양은 순도 90% 이상의 분획에 대해 약 30%의 수율로 여기에 표시되어 있습니다. 생성물의 순도는 분석용 역상 HPLC를 사용하여 평가하며, 아미드 골격의 흡수 파장인 220 nanometers에서 시각화합니다.두 펩토이드 모두 균질한 것으로 확인되었습니다. L Mexicana에 대한 세포독성 분석의 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 화합물의 5mM 스톡 용액을 세포 배양 등급의 DMSO로 제조하였으며, 데이터의 신뢰성을 확보하기 위해 최소 2회 이상 3반복으로 테스트하였습니다.펩토이드 B가 펩토이드 A보다 생존 기생충의 비율을 줄이는 데 더 효과적이며, 두 펩토이드 모두 용량 의존적 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있습니다. 본 영상을 통해 라이신 유형과 아르기닌 유형의 단량체를 모두 포함하는 펩토이드를 합성, 특성 분석 및 정제하는 방법과 이를 Leishmania mexicana에 대한 세포독성 분석에 사용하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 펩토이드에 이중 양이온 기능을 추가하는 당사의 방법은 일반적으로 사용되는 펩토이드 합성의 서브단량체 방법에 단 하나의 간단한 단계만 추가합니다.이 방법을 통해 라이신 또는 아르기닌 유형의 다양한 길이의 서브모노머를 추가하여 라이브러리 다양성을 높일 수 있으며, 예를 들어 2개에서 6개 길이의 탄소 측쇄를 사용할 수 있습니다. 펩토이드 합성을 시도할 때는 원치 않는 첨가 또는 결손 생성물이 발생하는 것을 방지하기 위해 단계 사이에 레진을 충분히 세척하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법은 연구자들이 혼합 양이온 기능화 펩토이드의 생물학적 활성을 탐구하고, 이를 라이신 또는 아르기닌 유형의 모노머만 포함하는 펩토이드의 활성과 비교할 수 있는 길을 열어줍니다.마지막으로, 본 프로토콜에 사용되는 기생충과 여러 시약이 매우 위험할 수 있음을 유념하십시오. 따라서 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하고, 필요한 경우 흄 후드나 미생물 안전 작업대 내에서 작업하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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