과분극 ⁽¹³⁾ C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 동적 핵 분극을 사용하여 탄소 13 표지 분자를 과분극화하고 탄소 13 자기 공명, 역시경 이미징을 사용하여 체외에서 enyzmatic 변환을 측정하는 것입니다. 이 방법은 탄소의 공명 신호를 10, 000에서 100, 000 겹에 의하여 증가해, 층을 이룬 화합물이 그들의 변화 산물에서 구별되는 것을 허용하고, 화상 진찰에 의해 몸에서 국지화되는 것을 허용하. VR 기법과 비교했을 때 이 방법의 가장 큰 장점은 살아있는 유기체에서 자연적으로 발생하는 물질의 신진대사를 실시간으로 볼 수 있다는 것입니다.

또한 이 방법은 암의 대사에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 체외(in vitro)로 확인할 수 있습니다. 또한 동물 모델 및 인간 환자에게도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 적용은 종양 국소화를 능가합니다.

대사성 종양 아형을 찾아 구별하고 최첨단 기술과 함께 치료를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 먼저 gadoterate meglumine의 1 밀리 몰 용액과 농축 된 1 탄소 13 피루브 산을 준비하십시오. 혼합물에 트리틸 라디칼 OX063을 첨가하여 15 밀리몰 최종 농도를 달성하고 완전히 용해시킵니다.

DNP 편광판 소프트웨어에서 Cool Down'을 클릭하여 가변 온도 인서트(VTI)의 온도를 1.4켈빈 미만으로 낮춥니다. VTI가 냉각되면 약 8마이크로리터의 탄소 13 라벨 샘플 용액을 플라스틱 샘플 컵에 넣습니다. 컵을 샘플 삽입 로드에 부착합니다.

소프트웨어에서 Insert Sample(샘플 삽입)'Select Normal Sample(일반 샘플 선택)'을 클릭한 후 Next(다음)'를 클릭하면 샘플 홀더가 올라가고 VTI에 대한 주입 밸브가 열려 샘플 삽입이 가능합니다. 프롬프트에서 삽입 로드를 사용하여 샘플 컵을 VTI에 밀어 넣습니다. 샘플 컵을 분리하고 삽입 로드를 조심스럽게 빼냅니다.

샘플이 로드에서 분리되었고 폐쇄 절차 중에 VTI 밖으로 밀려나지 않았는지 확인합니다. 다음'을 클릭하여 밸브를 닫고 sample cup을 액체 헬륨으로 내린 다음 Finish'를 클릭하여 최적의 분극 주파수를 찾으려면 먼저 RINMR 소프트웨어를 시작하십시오. 구성 화면에서 Select Sample'을 클릭하고 Micro Sweep 수행'데이터를 저장할 파일을 만듭니다.

DNP 편광판 소프트웨어로 다시 전환합니다. Calibrate' 탭을 선택하고 마이크로파 스윕 매개변수를 설정한 다음 마이크로파 스윕 프로세스를 시작합니다. 마이크로파 스윕이 완료되면 최대 측정 신호 진폭으로 주파수를 기록하십시오.

RINMR 소프트웨어로 돌아가서 Solid Build Up'을 선택한 다음 DNP Polarizer 소프트웨어에서 Polarization'을 클릭하여 최적의 마이크로파 주파수와 전력을 입력합니다. Next(다음)를 클릭하고 'Enable Polarization Buildup Monitoring(편광 축적 모니터링 활성화)'을 클릭하고 Finish(마침)를 클릭합니다.95% 이상의 편광을 달성하기에 충분한 시간 동안 샘플을 편광합니다. 편광 중에는 수집 플라스크를 과편광 샘플 배기 튜브에 연결하고 분광계 근처에 놓습니다.

3초 간격으로 110도 RF 펄스의 13개 탄소 스캔 시리즈가 있는 1개의 테슬라 NMR 분광계를 설정합니다. 피루브산 분극 중에 세포 배양 준비를 시작합니다. 세포 배양 플라스크에서 세포 배지를 제거합니다.

약 10ml의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다. 배양 플라스크에 트립신 5ml를 추가합니다. 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양물을 배양한 다음 10% 태아 송아지 혈청을 부피 기준으로 함유한 약 5ml의 F12K 배지로 트립신을 비활성화합니다.

그런 다음, 원하는 수의 세포를 포함하는 세포 현탁액의 부피를 플라스틱 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 샘플을 1200G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10% FCS로 충분한 F12K 매체에 팔레트를 다시 매달아 최종 부피 800마이크로리터를 달성합니다.

서스펜션을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 따뜻한 물을 채운 플라스틱 용기에 튜브를 넣습니다. 탄소 13 자기 공명 분광법을 통한 데이터 수집을 시작하려면 세포 샘플이 준비되고 피루브산 분광이 95% 이상일 때 DNP 편광판 소프트웨어에서 Run Dissolution'을 클릭합니다. 용해 챔버의 상단 밸브를 통해 용해제의 측정 부피를 로드합니다.

용해 스틱을 활성 위치로 이동합니다. DNP 편광자 소프트웨어에서 '세포 샘플이 실험을 위해 준비되면 Finish'를 클릭하여 용출 프로세스를 초기화합니다. 용해 과정이 완료될 때까지 기다리십시오.

200마이크로리터의 과분극 피루브산 용액을 800마이크로리터의 세포 샘플에 추가합니다. 피펫으로 잘 섞은 다음 약 600 마이크로 리터의 혼합물을 5mm NMR 튜브에 넣습니다. NMR 튜브를 분광계에 로드하고 실행'을 클릭하여 측정을 시작합니다.

그런 다음 s가 부착된 용해 스틱을 이동합니다.ample cup을 세척 위치로 이동하고 DNP 편광판 소프트웨어에서 Finish'를 클릭합니다. 탄소 13 자기 공명 이미징을 시작하려면 과분극 과정을 시작한 후 세포 수가 10에서 8번째 사이인 800마이크로리터의 재현탁 세포 샘플을 3ml 주사기로 옮깁니다. 주사기를 긴 카테터에 연결하고 MRI 스캔 베드에 주사기를 놓습니다.

카테터가 MRI 스캐너 외부에 닿을 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인하십시오. 주사기 옆에 10% 가도테레이트 메글루민과 함께 10개의 몰 탄소 13 요소가 포함된 보정 팬텀을 놓습니다. 주사기에 탄소 13 튜닝 RF 수신기 코일을 놓습니다.

관심 물체가 MRI 스캐너의 등심원에 있도록 스캐닝 베드를 스캐너에 삽입합니다. 연결 플라스크를 과편광 샘플 배기 튜브에 연결하고 카테터 끝 부분에 가깝게 놓습니다. 표준 3면 현지화 시퀀스를 실행하고 필요한 경우 주사기 위치를 조정합니다.

그런 다음 주사기 국소화를 포함하는 양성자 T2 가중 해부학적 시퀀스를 설정하고 실행합니다. 결과 해부학적 이미지에서 탄소 13 팬텀을 포함하여 관심 영역의 연속 슬라이스 5개를 선택합니다. carbon 13 spectroscopic calibration acquisition을 설정하고 pulse sequence 라이브러리에서 2D block siert calibration sequence를 선택합니다.

펄스 시퀀스를 스캐너에 다운로드하고 분광 사전 스캔을 실행합니다. 스펙트럼 크기 플롯에서 carbon 13 calibration phantom peak를 스캐너 주파수의 중심으로 설정합니다. 수신기 게인을 최대로 설정하고 Scan'을 클릭하여 보정 시퀀스를 실행합니다.

보고된 전송 게인 및 중심 주파수를 기록합니다. 그런 다음 선택한 해부학적 슬라이스에 대한 탄소 13 화학적 이동 이미징 획득을 설정합니다. 2D echo-planar spectroscopic imaging sequence를 선택하고 pulse sequence를 스캐너에 다운로드합니다.

분광 사전 스캔을 실행하고 보정 값을 기반으로 중심 주파수와 전송 게인을 조정하여 MRI 분광계 설정을 마칩니다. 피루브산이 95% 분극에 도달하면 DNP 편광판 소프트웨어에서 '용해 실행'을 클릭하고 용출제를 로드합니다. 용해 스틱을 활성 위치로 이동합니다.

다음'을 클릭한 다음 마침'을 클릭합니다.용해된 과분극 샘플이 수집 플라스크에 도달하면 약 1ml의 과분극 용액을 주사기에 주입하고 200마이크로리터가 세포 샘플에 도달하도록 카테터에 주입합니다. Scan'을 클릭하여 실험 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집이 완료되면 s가 부착된 용해 스틱을 이동합니다.ample cup을 세척 위치로 이동하고 DNP NMR 소프트웨어에서 Finish'를 클릭합니다.

피루브산과 젖산의 대사 교환율은 빈도와 시간에 대한 과분극 젖산염과 피루브산의 탄소 13 NMR 분광법 신호 강도를 모니터링하여 전립선 암종 PC3 세포에서 연구되었습니다. 젖산 동역학 값은 단순 비율 모델과 2-부위 교환 차이 모델에 의해 평가되었으며 세포 수로 정규화되었습니다. 두 모델 모두에서 세포 수가 증가함에 따라 젖산 생산이 감소하는 추세가 관찰되었습니다.

이는 시료의 세포 농도와 점도가 더 높기 때문입니다. 세포 수가 2 곱하기 10에서 7 미만인 샘플은 매우 작은 젖산 신호 대 잡음비를 보여주므로 표준 편차 값이 크므로 샘플에 정보 데이터를 얻기 위해 최소한 해당 수의 세포가 포함되어야 함을 나타냅니다. 우수한 스펙트럼 해상도의 MRI를 통해 공간 국소화를 달성하여 특정 주파수 영역에 대한 탄소 13 이미지를 획득할 수 있었습니다.

공간 분포는 원시 데이터에서 결정되었습니다. 탄소 13 이미지는 이전에 획득한 양성자 이미지와 함께 정합될 수도 있습니다. 이 실험을 마스터하고 적절하게 수행하면 60분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 동적 핵 분극 기술을 사용하여 원하는 분자의 과분극을 수행하는 방법과 간단한 NMR 분광학 및 세포 이미징 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 매우 빠른 것이 중요합니다. 과분극 샘플이 편광판을 떠난 후에는 2분 이내에 얻은 모든 NMR 신호가 손실된다는 점을 기억하십시오.

결론적으로, 용출 DNP는 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에는 당뇨병과 같은 질병에 대한 연구 또는 다양한 유형의 암의 대사 변화를 관찰하는 것뿐만 아니라 조직의 pH를 측정하는 것도 포함됩니다.