Name: 과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 학습하세요 동적 핵분극을 이용한 과분극(13)C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징 방법으로 전립선암 세포에서 젖산 탈수소효소 활성을 실시간 측정하는 기술입니다. 이 방법은 암 대사 연구에 활용됩니다.

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E.K.는 뮌헨 공과대학교(Technische Universität München)의 생명공학 대학원(GSB)의 지원에 감사드립니다. 이 연구는 독일 연구 재단(DFG)의 SFB Collaborative Research Center 824, "Imaging for Selection, Monitoring, and Individualization of Cancer Therapies"의 지원을 받았습니다.

1. 샘플 원액 준비 <ol><li> 1 밀리몰 / L GadM의 최종 농도를 농축하여 [1- (13) C] 피루브산으로 가도 테 린산의 메 글루 민 (GadM, 0.5 몰 / L)를 추가한다. 틸 라디칼 (8- 카르복시 -2,2,6,6- 테트라 (히드 록시 에틸) -benzo- [1,2-4,5] 비스 (1,3-) -dithiole -4- 일) - 추가 - 이 혼합물에 메틸 나트륨 염 (OX063)는 15 밀리몰 / L의 최종 농도를 얻었다. 완전히 용해 될 때까지 소용돌이. 참고 :이 원액 준비는 3.35-T 임상의 DNP의 분극과 사용을 위해 설계되었습니다. 7 T 임상 분극이 사용될 때 높은 자계에서의 이점을 무시할 수 있기 때문은 가도 테 린산의 메 글루 민은 필요하지 않다. 가돌리늄 계 조영제의 추가도 달성 고체 편광 및 편광 비율을 증가시킨다. 그러나, 액체 상태, 조영제는 T 1 완화 시간을 단축시킨다. </li></ol> 2. 세포 배양 성장 <ol><l>cm이 성장 지역과 문화 플라스크에 PC3 세포를 성장. 10 % 소 태아 혈청 (FCS)을 함유하는 F-12K 배지를 사용하여 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 세포를 유지한다. 용해 단계 전에, 문화 플라스크에서 매체를 제거합니다. 주 : 각 세포주는 세포 증식에 ​​대한 특정 준비 프로토콜을 필요로한다. 세포주 제공자와 요구 사항을 참조하십시오. </l></ol> 실험에 셀의 제조 3 <ol><li> 세포 배지를 제거하고 인산 완충 ~ 식염수 (PBS) 10 mL로 가진 세포를 세척 하였다. </li><li> 플라스크에 트립신의 5 mL를 넣고 3 ~ 5 분 동안 인큐베이터에 세포 배양 플라스크를 반환합니다. </li><li> 트립신을 비활성화 F-12K 매체의 ~ 5 mL를 추가합니다. </li><li> 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 스테인 용액 10 μL와 세포 용액 10 μL를 혼합한다. 피펫과 잘 혼합 번째로 혼합물의 10 μL를 전송는 "카운트 유리"의 전자 챔버. </li><li> 분리 플라스크에 (S)의 세포 수를 계산. 세포의 수를 함유하는 적절한 부피를 전송 (예를 들어, 5 × 106 최대 10 8) 플라스틱 바이알에. </li><li> 5 분 1,200 XG에서 세포를 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. </li><li> 800 μL의 총 부피를 10 % FCS를 함유하는 F-12K 배지에서 세포를 다시 중단하고 반응 컵 (2 mL)에 전송할. 따뜻한 물이 가득 플라스틱 병에 반응 컵을 놓습니다. </li></ol> 4. 해산 에이전트 준비 주 : 용해 에이전트는 분극 샘플을 용해시키기 위해 사용되는 액체이다. 생물학적 응용에서 용해는 일반적으로 1g / L 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 함유하는, H 2 O를 계 또는 산화 중수소 (D 2 O) 등 PBS 또는 트리스 기반 버퍼 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스)로 수행된다. <ol><li> Prepara20 밀리몰 / L PBS 버퍼의 기 <ol><li> (용해 화제, 100㎖를 준비 모노 소듐 포스페이트 36 ㎎을 용해 (의 NaH 2 PO 4), 인산이 나트륨 247 mg의 (나 2 HPO 4), 20 밀리몰 / L 수산화 나트륨 용액에 EDTA 10 mg의 수산화 나트륨) D 2 O. 믹스 제대로 완전히 용해 될 때까지. 주 : EDTA (1 ㎍ / L)를 과분극을 망칠 수있는 가능한 강자성 이온을 제거하기 위해 버퍼에 추가된다. 7.4의 pH에 ​​도달 한 몰비 다음 NaOH를 1에서 피루브산을 중화하기 위해 사용된다. </li></ol></li></ol> 5. 변수 온도를 삽입 (VTI) 재사용 대기 시간 <ol><li> DNP-NMR 편광판 프로그램 메인 창에서 클릭 "재사용 대기 시간." 참고 :이 진공 펌프 스위치를 약 5.0 밀리바에 VTI를 배기한다. 이어서, VTI 액체 헬륨 저장고 사이의 니들 밸브가 완전히 액체 헬륨이 VTI로 흐르게 열리고. 유량은 R이고이 헬륨 비점 온도에 도달 할 때까지 VTI에서 액체 헬륨의 최적의 양을 유지하기 위해 니들 밸브에 의해 egulated. 그리고, VTI 거의 완전 진공으로 배기하고, 온도는 대략 1.4 K이다 VTI 65 %의 액체 헬륨까지 가득 도달한다. 이 시점에서, 악기 샘플 삽입을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 6. 샘플 준비 및 삽입 <ol><li> 마이크로 피펫을 사용하여 플라스틱 컵에 13 C 표지 샘플 원액 ~ 8 μL를 추가한다. </li><li> 삽입 막대에 플라스틱 컵을 부착하고 주 프로그램 창에서 "샘플을 삽입"을 눌러 샘플 삽입 프로세스를 시작합니다. "일반 샘플"를 선택하고 클릭 "계속." 주 :이 프로세스 동안, 니들 밸브가 제 VTI으로 액체 헬륨의 유동을 중단 닫히고 VTI 내의 압력은 증가한다. VTI 내의 샘플 홀더는 액체 헬륨, 유입 밸브로부터 상승VTI 상단에 개구하고, 기체 헬륨 유동 공기 수분 외부 오염을 방지하기 위해 유입 밸브로부터 도입된다. </li><li> 메시지가 표시되면 아래 VTI에 부착 된 플라스틱 컵에 삽입로드를 밀어 넣습니다. VTI의 하단에있는 샘플 홀더에 도달해야합니다. 그렇지 않으면, 헬륨 가스는 VTI에서 샘플을 밀 수있다. </li><li> 분리 및 삽입 막대를 제거합니다. </li><li> 대화 창에서 "다음"을 클릭하여 절차를 마칩니다. 샘플 삽입 과정은 10 초보다 오래 걸릴해서는 안된다. 주 : 유입 밸브는 다음 샘플 컵 샘플 홀더는 액체 헬륨에 침수되어, 가스 헬륨 흐름이 중단 닫히고 니들 밸브는 액체 헬륨이 VTI 내로 유동 할 수 있도록 개방된다. 오 후 - 10 분의 VTI는 자유 전자의 모든 편광 될 수 있도록, 1.4 K 이하로 냉각된다. </li><li> 샘플과 플라스틱 컵이 t를 확인하여 VTI에 제대로 소개 된 것을 확인모자 그것은 삽입 막대에 부착 또는 헬륨 가스에 의해 VTI에서 밀려되지 않습니다. 그런 다음 "마침"을 클릭합니다. </li></ol> 7. 전자 레인지 스윕 (선택 사항) 주 : 마이크로파 소인 대상 화합물의 13 C 핵의 과분극 속도를 최대화하기 위해 최적의 마이크로파 주파수의 결정을 허용한다. <ol><li> 전자 레인지 청소를 측정하기 위해, RINMR 프로그램 유형 "HYPERSENSENMR를,"시작 "을 선택 구성"을 클릭합니다 "마 Microsweep을." </li><li> 프로세스를 시작하려면 주 프로그램 창에서 "조정"탭을 선택합니다. </li><li> 클릭 "생성"시작 및 종료 주파수 (예를 들어, 94.100 GHz의-94.200 GHz의) 주파수 스텝 크기 (예를 들어, 20 메가 헤르츠) 전력 (100 MW), 시간 (60 초)을 선택한다. ""계속 "사용"및 "시작을 클릭합니다." 주 : 이러한 설정으로, 분극 먼저 샘플을 편광94.100 GHz의 마이크로파 주파수에서 100 mW의 전력을 사용하여 60 초 동안. 그리고, 90 ° 무선 주파수 (RF)의 펄스를인가하고, 내장 된 분광계를 사용하여 13 C 분극 신호를 획득한다. 이러한 단계는 특정 주파수 범위의 각 단계를 반복한다. 이후 과분극의 경우, 측정 된 최대 신호 진폭과 마이크로파 주파수를 선택합니다. </li></ol> 8. 편광 <ol><li> 편광 형성을 측정하기 위해, RINMR 프로그램 유형 "HYPERSENSENMR를,"시작 "을 선택 구성"을 클릭합니다 "솔리드 빌드 업을." </li><li> DNP-NMR 편광판 프로그램 메인 창에서 과분극 프로세스를 시작하려면 "양극화"를 클릭합니다. </li><li> (전자 레인지 청소 동안 획득) 최적의 마이크로 웨이브 주파수와 샘플에 대한 힘 (예를 들어, 100 mW의)을 선택하고 '다음'을 클릭합니다. </li><li> "양극화 빌드 업 모니터링"을 활성화하고 클릭 "마침." </li><li> &gt; 95 % (~ 60 분 [1-13 C] 프로피온산)로 샘플을 편광. 참고 : 편광 동안, 전자 레인지는 13 C가 과분극 부대 전자의 스핀과 정렬 회전 원인이되는 VTI에 샘플로 안내된다. 과분극 축적을 측정하기 위해 5 °의 플립 각 (FA)로 RF 펄스 (예를 들어, 매 300 S) 주기적으로인가되고, 결과적인 신호는 편광 축적 곡선으로 도시된다. </li></ol> 9. 해산 <ol><li> 편광은&gt; 95 %에 도달하면, DNP-NMR 편광판 프로그램 메인 창에 "해산"을 클릭하여 용해 과정을 시작합니다. </li><li> 드롭 다운 메뉴에서 용해 과정을 선택하고 '다음'을 클릭합니다. 주 : 편광판 하나 이싱 가스의 타이밍을 선택함으로써 원하는 용해 프로세스를 정의 할 수있다. </li><li> t에서 가열 된 용기에 가기 밸브를 통해 용해 에이전트의로드 ~ 5 ㎖편광판의 그 용해 부분입니다. 다음 식을 이용하여 필요한 용출 제제의 정확한 양을 계산한다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq1.jpg"> V DA가 용해 화제, m PA, m의 OX063의 원하는 부피이고, m 가드는 피루브산 질량 어디, OX063 및 가도 테 린산의 메 글루 민은 각각 샘플 원액에 첨가 하였다. </li><li> 입구 밸브 위의 활성 위치에 용해 스틱을 놓습니다. 참고 :이 장비가 VTI의 샘플 컵의 용해 장비를 연결할 수 있습니다. </li><li> 용해 과정을 시작합니다 "마침"을 클릭합니다. 주 : 용해 에이전트 헬륨 가스가 3 기압으로 가압되고,이어서 압력의 증가를 초래 200 ° C까지 가열된다. 압력은 10 기압에 도달하면, 니들 밸브는 VTI으로 액체 헬륨의 유동을 중단 닫는다. 샘플 홀더 컵을 제기액체 헬륨에서. 용해 스틱 VTI로 하강 샘플 컵에 접속된다. 조절 된 용해 화제 샘플의 신속한 용해를 일으키는 컵 용해 스틱 통해 용출 완충액 및 헬륨 가스를 포함하는 가열 용기의 결과 압력에 의해 추진된다. 용액을 플라스틱 배관을 통해 수집 플라스크에 유출된다. 첨부 컵 용해 스틱은 다음 VTI에서 발생합니다. </li><li> 은 "청소"위치에 부착 된 컵 용해 스틱을 이동하고 클릭하여 프로세스를 완료 "마침." </li></ol> 13 C 분극 신호 10. 검출 <ol><li> 시험 관내에서 13 C 대사 자기 공명 분광법 <ol><li> 셀 솔루션의 800 μL와 컬렉션 플라스크에서 20 밀리몰 / L 용해 과분극 샘플의 200 μL를 섞는다. 참고 : 결과 최종 농도의 [1- (13) C]는 피루브산 4 밀리몰 / L이다. </li><li> 도 5 mm의 NMR 튜브에 마이크로 피펫 및 전송 ~ 600 μL를 사용하여, 현탁액을 혼합한다. </li><li> 1-T의 NMR 분광계로 5 mm의 NMR 튜브를 삽입합니다. 소프트웨어의 기본 창에서, 백 10 ° RF 펄스 매 3의 시리즈를 적용, 측정을 시작합니다 "실행"을 클릭합니다. 주 : 셀과 분극 샘플의 초기 혼합 분광 획득의 시작 사이의 시간을 측정한다. 혼합 과정은 분극 손실을 최소화하기 위해 30 초를 초과하지 않는 것을 보장한다. </li></ol></li><li> 13 C 대사 자기 공명 영상 <ol><li> 자기 공명 영상 분석기를 사용하여 시험 관내 실험을위한 컨테이너를 작성하기 위해, 5 mL를 주사기를 타고의 접근 가능 영역에 분광계의 이소 중심으로부터 도달 할 정도로 긴 카테터 (d = 1.2 mm)에 연결 분광계. </li><li> 차와 함께 체외 컨테이너 채우기실험을위한 목적하는 농도 즉 세포 용액 (예를 들어, 108) 또는 효소 용액. </li><li> 자기 공명 영상 자석의 등각에서 체외 용기를 놓습니다. 컨테이너에 13 C-조정 무선 주파수 수신기 코일을 배치합니다. 인근에 집중 (13) C 표지 교정 팬텀 (예를 들어, 10 몰 / L (13) C-요소)를 놓습니다. </li><li> 핵 자기 공명 스캐너의 이소 - 센터 근처 "체외 용기"를 삽입합니다. </li><li> 스캐너의 표준 3면 현지화 시퀀스를 실행하고 필요에 따라 이소 - 센터로 체외 컨테이너의 위치를 조정합니다. </li><li> 체외 컨테이너 현지화를 커버하는 1 H의 T2 강조 "해부학"순서를 실행합니다. 축 방향, 반복 시간 (TR) = 2000 MS, 에코 시간 (TE) = 20 밀리, 슬라이스 두께 = 1mm, 시험 관내 컨테이너를 포함하는보기의 필드 2D 스핀 에코을하고 다음 설정을 사용하여여기 당 16 에코. 해당 필드의 shimming이 단계에서 양성자에서 수행되어 있는지 확인합니다. </li><li> 해부학 적 영상에서 관심 영역을 중심으로 5 연속 슬라이스를 선택합니다. 선택된 해부학 조각을 덮는 13 C 분광 교정 취득 처방. 다음 설정을 사용하여 축 방향으로 2D 블록 Siegert 보정 시퀀스를 12 × 12 중심의 인코딩, TR = 1000 MS, 슬라이스 두께 = 5mm, 해부학 적 이미지, 스캔 (NS) = 64, 대역폭의 수를 일치 시야 = 5000 Hz에서, 그리고 FA는 = 90 °. </li><li> 13 C 분광 보정 시퀀스를 선택 펄스 시퀀스 라이브러리에서 75 (자세한 내용은 슐트 등. 2011 참조). 클릭하여 컴퓨터에서 스캐너에 펄스 시퀀스를 다운로드 "다운로드." 분광 프리 스캔을 실행하는 "스펙트럼 사전 스캔"을 클릭합니다. 스펙트럼 크기 플롯에서 cente에 13 C 교정 팬텀에서 피크를 조정스캐너 주파수 R. 최대로 수신기의 이득을 설정합니다. 13 C 분광 보정 시퀀스를 실행하려면 "시작"을 클릭합니다. 보고 된 송신 이득과 중심 주파수를합니다. </li><li> 선택한 해부학 조각을 커버하는 13 C 화학적 이동 영상 (CSI) 인수를 설정합니다. 다음 설정을 사용하여 축 방향으로 12 × 12 중심의 인코딩, TR = 400 밀리, 슬라이스 두께 = 5mm,보기 일치하는 해부학 적 이미지의 필드, NS = 300, 및 대역폭 = 5,000 Hz에서와 2D 에코 평면 분광 영상 (EPSI) . 참고 : EPSI 샘플을 반복 한 RF 여기 후 K-공간에서 하나의 라인이 동시에 공간 및 스펙트럼 정보를 취득합니다. 취득 방법에 대한 자세한 내용은, 더스트 등의 알에 의해 문서를 참조하십시오. 2015 76. </li><li> 13 C CSI 시퀀스를 다운로드하고 분광 프리 스캔을 실행합니다. 스캐너의 주파수를 조정하고 조정 시퀀스에 의해 지정된 게인 송신산출. </li><li> 과분극 용액을 수집 플라스크에 퇴적 한 후, 주사기에 ~ 3 ㎖를 작성하고 시험관 용기에 연결된 도관에 주입. 인수를 시작합니다. 취득이 완료되면, 후속 재구성을위한 미가공 데이터 파일을 저장한다. </li></ol></li></ol> 11. 데이터 재구성 <ol><li> 수집 된 데이터를 분석하기 위해 두 바와 동역학 모델 중 하나를 적용한다. <ol><li> LDH 동력학을 설명하기위한 첫 번째 방법에서, 운동 값 (k)는 모든 분자 분극의 신호 (M의 X)로 21,77 락트산 신호 (M LAC)의 합을 비교한다. <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq2.jpg"></li><li> 다른 방법에서, 시간에 따라 락 테이트 및 피루 베이트의 신호를 측정하고 운동 모델 17,25,71 이러한 맞. 대사 환율을 해결하기 위해, PA → LAC 및 유효 케이락 테이트, (R)의 LAC의 신호 감쇠율, 젖산염 수득 두 사이트 교환 차동 모델을 사용하여, 다음의 선형 미분 방정식을 사용 <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq3.jpg"></li></ol></li></ol> 참고 : 유효 락 테이트 신호 감쇄율 r에 LAC는 (T 1, LAC), 피루브산 K LAC → PA,인가 FA와 TR에 젖산에서 반대 대사 환율 젖산 세로 완화 시간에 따라 달라집니다 및 신호 강도의 피루 베이트 (M PA) 및 계정에 각각의 연속적인 자극 후 돌이킬 수없는 신호 감소를 복용 락 테이트 (M LAC) : <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/54751/54751eq4.jpg"> 따라서, R LAC는 신호 감쇠의 하나의 분리라는 용어가 발생합니다. 이는 t를 보정 할 수 있기 때문에그 각도와 반복 횟수를 뒤집은 플럭스 LAC → PA있을지라도, 우리는 피루브산 (K LAC → PA)로 락트산으로부터 환율의 결과에 기초하여, 계산에 포함 할 필요가 없다고 생각 해리슨 등. 2012 78. 그들의 결과는 K LAC → PA 한 가정 할만큼 중요한 역할을하지 않는 것으로 나타났다. 이 모드는 젖산의 T 1 휴식 시간을 정량화 할 수 있습니다. 이 모델은 시험 관내 실험의 경우, 중요하지 않으며 무시 될 수 있으며, 측정에 피루브산 투여 독립적이다. 이것은, 그러나, 생체 측정 (79)의 중요한 역할을 않는다.

Rolf F. Schulte와 Marion I. Menzel은 GE Global Research에 고용되어 있습니다.

과분극 프로브 13 CMRSI 시험 관내 및 생체 내 대사를 실시간으로 모니터링하는 유망한 방법이다. 하나의 매우 중요한 측면이 실험 방법을 사용하는 것이 특히 생체 외 실험에 대해 적절한 표준화이다. 먼저, 시료의 준비 각 실험에서 분극 물질의 동일한 농도를 달성하기 위해 적절하고 일관성있게 수행되어야한다. 이 과분극 버퍼로 샘플 모두의 무게 정확한을 필요로한다. 농도가 정확하지 않으면, 용액의 최종 pH는 T 1에의 영향 및 세포의 반응을 가질 수있는 정확하지 않다. 또한 가능한 한 균일 셀을 처리하는 것이 중요하다. 세포는 항상 세포가 매우 높은 진한로 유지되는 시간의 기간을 최소화하기 위하여 세포 수확 및 후속 실험 사이에 최소한의 지연이되는 방식으로 제조되어야entration과 낮은 볼륨. 같은 다른 준비 시간이나 온도 등의 세포 준비 프로토콜의 변화는, 얻어진 데이터에 상당한 변화가 발생할 수 있습니다. 세포 시료의 혼합은 표준화...

현재, 암의 다양한 종양 스테이징 restaging, 치료 반응 모니터링, 반복 검출을위한 가장 널리 사용되는 방법은 임상 [18 F] -FDG PET이다. (1) 그러나, 최근 여러 소설과 다른 접근 방법이 등장했다. 그 방법 중 하나는 13 CMRSI입니다. 이 방법은 시험 관내에서 또는 실시간으로 생체 내에서 신진 대사를 평가하는 최소 침습 MRI 따르는 생물학적 샘플에 13 C 분자의 도입을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 예컨대 [18 F] -FDG PET 또는 컴퓨터 단층 촬영 등의 다른 방법에 비해 13 CMRSI의 가장 큰 문제는, 낮은 신호 대 잡음비이다. 핵 자기 공명 신호는 분극 레벨 총인구 두 에너지 상태에서 스핀 ½ 핵 인구 차의 비 (도 1a)에 정비례한다. 편광은 일의 제품입니다핵의 전자 회전 자기 비 (γ) 및 온도에 대한인가 자계 강도. 1 H 핵의 일반적인 편광은 상대적으로 열악한 신호 대 잡음비를 제공한다 (3) T에서 0.001 % ~ 0.005 %의 순서이다. 오늘날의 최첨단 MRI는 인해 생물학적 시료에서 1 H의 높은 풍부 1 H의 높은 회전 자기 비율 성공적인 이미징 방법이었다 (γ 1H = 42.576 MHz의 / T). 그러나, 카본과 같은 다른 핵을 관찰하는 것이 더 요구된다. 유일한 안정 자기 활성 탄소 동위 원소, C (13)는 모두 탄소수 단지 1.1 %를 차지한다. 또한, 13 C (γ = 10.705 MHz의 13C / T)의 회전 자기 비는 낮은 검출 효율을 초래 한 H의 4 배 이하이다. 요약하면, 낮은 13 C 풍부 낮은 γ의 13C 열 13 C 측정은 하나의 감도 0.0176 %를 달성시킬생체 내에서 H-NMR 측정. 동적 핵 분극 13 C 측정의 비교적 불량한 감도를 극복하는 방법은 DNP이다. 그것은 원래 앨버트 W. 오버 하우저 (Overhauser)에 의해 1953 년에 금속에 대해 설명했다. 그 논문에서, 그 명시된 "전도 전자의 전자 스핀 공명이 포화되면, 핵 그들의 회전 자기 비는 전자 스핀의이라면 그들이 것 같은 정도 편파 될 것 같다."이 나중에 그 해는 조각가와 Slichter 실험적으로 오버 하우저 (Overhauser)의 가설 3을 확인했다. 1958 년, 아브라 감 및 프록터는 액체에서 전자이 효과를 설명하고 그 이름 "고체 효과." 4 K 이하의 온도에서, 전자의 스핀 분극은 거의 100 %에 도달하고 핵 스핀 분극 (도 1b) 4보다 크기보다 3 명령이다. 티전자의 회전 자기 비 (γ = 28024.944 MHz의 E / T)는 회전 자기 핵 비율보다 3 자릿수 때문에 자신이 발생한다. 전자가 해당 전자에 가까운 주파수를 갖는 마이크로파 방사선을 이용하여 핵 스핀으로 회전에서 같은 오버 하우저 (Overhauser) 효과, 고체 효과 가교 효과 및 열적 혼합 효과로서, 전자와 원자핵 사이의 약한 상호 작용은 편광의 전송을 허용 상자성 공명 (EPR) 주파수 5,6-. DNP의 이론은 더 이상 전자 및 열 혼합을 포함하기 위해 개발되었습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, DNP의 더 통합 된 양적 이론적 인 설명은 7, 8을 발표 없습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> 그림 1 : 동적 핵 분극과 과분극 이해. 스핀 인구 A) 개략적 비교열 평형의 편광 상태와 분극 상태이다. B) 편광은 온도에 따라 달라집니다. 전자의 분극의 (e -) 1.4 K이다 DNP 이하 100 % 105 -fold까지 자신의 편광을 증가 C 13 핵에 전자로부터 편광 전송할 수에 도달한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 13 C NMR을 이용하여 생물학적 시스템의 연구에서 DNP을 소개하고, 이후 빠른 샘플 용해 개발했다. 오십년 오버 하우저 (Overhauser)의 가설, 월 H. Ardenkjaer - 라센 등 후. 최소한의 과분극 손실 6 액체 상태로 분극 냉동 샘플을 가져 오는 기술적으로 어려운 문제를 해결했다. 해산 DNP는 연구의 새로운 분야가 13 CMRS라는 오픈나는, 조사 및 각종 질병 상태 9,10의 특성을 할 수있는 새로운 방법을 제공한다. 부대 전자, 트리 틸 라디칼 (8- 카르복시 -2,2,6,6- 테트라 (히드 록시 에틸) -benzo- [1,2-4,5] 비스 - (1,3)의 안정된 운반 -dithiole -4- 일) - 메틸 나트륨 염 (OX063) 또는 (2,2,6,6- 테트라 메틸 피 페리 딘 -1- 일) 옥실 (TEMPO)는 일반적으로 사용된다. 이러한 목적 13 C 표지 분자와 혼합하고, 해당 EPR 주파수에 가까운 주파수를 갖는 마이크로파 방사선에 노출된다. 이 기술을 사용하여, 13 C 핵의 편광을 37 내지 11 %까지 증가 될 수있다. 이는 열 평형 편광 (11, 12)에 비해 105 -fold 분극 향상을 초래한다. 그러나, 마이크로파의 조사를 중지 및 / 또는 13 C-분자가 액체 상태로 전송하자마자, 편광은 편광 된 13 C 핵의 종 완화 시간 (T 1)와 붕괴. 따라서,빠른 용해 기술의 발명 또는 생물학적 응용 프로그램 (13)에 대한 중요 실험 측정 (즉, 주사)하기 전에 시간을 단축 후속 기술. 후보 분자가 성공적으로 13 CMRSI 연구를 위해 수행해야하는 세 가지 주요 요구 사항이 있습니다. 첫째, 관심있는 13 C 핵은 충분히 긴 T 1 (&gt; 10 초)을 가지고있다. 13 C-라벨의 선택은 매우 중요하다. 가장 좋은 후보 핵 결합을 통해 1 H-핵와 직접적인 접촉 탄소입니다. 본래 물질로부터 상당히 상이한 화학 시프트 하류 대사 산물의 생성, T (3) 1 회 - 또한 급속이 내 대사되어야한다. 공간 분포가 전자 13 C 사이의 거리를 감소되도록 샘플 혼합물은 트랜스 있도록, 비정질 유리 때 고체 상태를 형성해야편광 남았다. 후보 분자는 자연적으로 비정질 유리를 형성하지 않는 경우, 글리세롤이나 디메틸 설폭 사이드 (14)를 고하는 유리처럼 제에 가용성 인 필요가있다. 이러한 요구 사항은 후보 분자의 상대적으로 적은 수의 결과. 그러나, 적합한 분자의 성공적인 검색 후에, 과분극하는 작용 프로토콜을 개발하는 것은 9,14,15 기술적으로 어려울 수있다. 36 [2- (13) C] 프로피온산 (37), [1- (13) C] 에틸 피루 베이트 38, [1-13 C - 최근, 여러 기판은 [1-13 C] 프로피온산 (12, 16)로 성공적으로 편광왔다 ] 락트 39 [1- (13) C] 푸마 40-43, 13 C-중탄산 36,44,45 [1-13 C] 아세트산 나트륨 43,46 - 49 13 C - 우레아 6,36,50,51 , [5- (13) C] glutamiNE 15,52,53 [1-13 C] 글루타메이트 (53, 54), [1- (13) C] 2- 옥소 글 루타 레이트 (55), [1- (13) C] 알라닌 등 14,56. 과분극을 위해 특히 재미 있고 일반적으로 사용되는 기판은 [1- (13) C] 피루브산이다. 널리 각종 질병 14,17,22에서 세포의 에너지 대사를 조사하기 위해 전임상 연구에 사용된다. [1-13 C]는 피루브산은 대사되고이어서 전에 세포막 비교적 긴 T 1 및 신속한 전송을 포함 성공적인 과분극의 모든 요건을 만족한다. [1- (13) C] 피루 베이트와 전임상 연구는 현재 병원 57로 번역되고있다. 피루브산의 대사 또한 암 세포의 DNA 및 대사 경로의 변화 변이 사이에 직접 링크가 존재하는 것으로 알려져있다. 이미 1920 년대에, 오토 바르 부르크의 discov60 - 건강한 조직 (58)에 비해 종양에서 포도당과 젖산의 생산의 증가 신진 대사를가 있음을 겹으로. 이어서, 같은 오탄당 포스페이트 경로의 트리 카르 복실 산 사이클 산화 적 인산화 및 뉴클레오타이드 및 지질의 합성 등의 다른 대사 경로에서 다양한 교대가 설명되었다. 피루브산은 해당 작용의 최종 제품입니다. 종양에서, LDH (61)에 의해 촉매 무산소을 겪게하고 보효소 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 환원 형의 반응 (NADH), 락트산 및 조효소 (NAD +)의 산화 된 형태의 결과. 선택적으로, 피루 베이트는 알라닌 트랜스 아미나 제 (ALT)에 의해 촉매를 형성하는 알라닌 글루타메이트와 아미노기 전이 반응을 겪는다. 두 반응은 쉽게 되돌릴 수 있습니다. 피루브산은 이산화탄소 및 아세틸 -CoA, R로 피루 베이트 탈수소 효소 (PDH) 촉매로 탈 카르 복 실화를 겪는이 단계에서의 비가역 반응을 epresenting. 이 반응 속도에 교대 종양 대사 17,21,22,25,62 연결될 수있다. 대사 경로는 그림 2에 요약되어있다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54751/54751fig1.jpg"> 그림 2 : 피루브산의 주요 대사 반응의 다이어그램. 피루 베이트 / 락 테이트 변환 LDH에 의해 촉진되고, 피루브산 / 알라닌 변환 ALT 의해 촉매된다. 피루브산은 비가 역적 및 PDH에 의한 CO 2, 닐 -CoA 아세틸 변환 및 CO 2는 수소 나트륨 (80)의 pH에 의존 평형에 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54751/54751fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 과분극 [1- (13) C] 피루브산과 그 대사 산물의 검출은 이전에 쥐에서 증명되었다 그는예술 37,63 - (65), 간 (66), 근육, 신장 62,67. 한 연구는 정상 및 금식 쥐의 간 (66) 사이의 락 테이트 - 투 - 알라닌 비율에 유의 한 차이를 보여 간암 68,69에서 매우 높은 및 과분극 [1- (13) C] 젖산 수준을 보여 주었다. 종양 등급이 절제된 종양의 조직 학적 등급과 높은 상관 관계를 나타내는 분극 젖산 수준, 과분극 [1-13 C] 프로피온산 (22)을 사용하여 마우스 전립선 (TRAMP)의 형질 선암에서 식별 될 수 있다는 증거가있다. ALT에 의해 피루브산에서 촉매 알라닌은 쥐의 간세포 암 (23)에 유용한 지표로 제안되었다. 피루 베이트 락 테이트 대사 플럭스를 측정하는 모니터링 허혈 63,65,70과 세포 독성 화학 요법 17,40 타겟 약물 치료에 대한 응답으로서 사용되고 &lt;SUP&gt; 24,25,41, 또는 동물 모델에서 방사선 치료 26. 또한 교 모세포종 및 유방암의 마우스 모델 (25)의 포스파티딜 이노시톨 3- 키나제 (PI3K)의 억제제 LY294002 응답의 검출을 위해 사용되었다. 뇌에 피루브산 대사의 변화는 26 전립선 암 24,71 또한 치료 후 관찰되었다 종양이. 전립선 암 전립선 암은 전 세계적으로 72 남성의 죽음과 관련된 노인 남성과 두 번째 주요 암의 주된 암이다. 현재까지 신뢰성있는 비 침습적 방법은 엄격한 탐지 및 환자의 준비를 가능하게하는 새로운 대사 이미징 기술에 대한 긴급한 필요성을 강조, 전립선 암 73, 74의 조기 진단 및 특성에 사용할 수 없습니다. 전립선 암 환자 13 CMRSI 결합 용출 DNP의 가능성을 입증하는 모델로 사용 된57이야. 이 연구는 전립선 암의 촬상하는 제 이용한 임상 시험 [1-13 C] 프로피온산 13 CMRSI에서 계속하고, 이는 최근 (NCT01229618)을 완료 하였다. 이 작품 뒤에 동기는 세포와 임상 설정에서 13 CMRSI 방법의 응용 프로그램을보다 상세하고 광범위한 청중에 대해 설명했다. PC3 전립선 암 세포주에서의 시험 관내 [1-13 C] 락트산 내지 [1-13 C] 프로피온산의 LDH - 촉매 대사를 측정 우리는 시험 관내 연구에서 용해 DNP의 가능한 응용을 설명하고 결정적인 단계를 처리하고 실험 기간 동안 도전.

<table><tbody><tr><td>HyperSense DNP 편광판</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td>3.35 T 전임상 DNP 과편광기</td></tr><tr><td>GE / Agilent MR901</td><td>GE Healthcare / Agilent Technologies</td><td></td><td>7 T 전임상 MRI 스캐너, 실험 용으로 설계된 작은 구멍 포함</td></tr><tr><td>Spinsolve Carbon</td><td>Magritek</td><td></td><td>1 T NMR 분광계 영구 자석</td></tr><tr><td>중수소 산화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 몬염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>에데테이트이나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 - 13C1</td><td>Cambridge Isotopes Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Dotarem (0.5 mmol/L)</td><td>Guerbet</td><td></td><td>gadoterate meglumine&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>트리스 (8-카르복시-2,2,6,6-테트라-(하이드록시에틸)-벤조-[1,2&ndash; 4,5] -bis-(1,3) - dithiole -4- yl) - 메틸 나트륨 염 (OX063)</td> <td>GE Healthcare</td><td></td><td>trityl radical 자유 전자</td></tr><tr><td>PC3 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL1435</td><td></td></tr><tr><td>F-12K 매체의 소스로 사용&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션, 1x</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>샘플 플라스틱 컵</td><td>옥스포드 악기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>바이오 라드</td><td>145-0013-MSDS</td><td></td></tr></tbody></table>

과분극 (13) c 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

Hyperpolarized 13C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

지난 수십 년 동안, 종양의 병기, restaging, 치료 반응 모니터링 및 암의 다양한 재발 검출을위한 새로운 방법 (18) F-fluorodeoxyglucose ([(18) F와 최첨단 양전자 방출 단층 촬영과 함께 등장 ] -FDG PET). 13 C 자기 공명 분광 영상 (13 CMRSI)은 생체 내에서 실시간으로 대사의 모니터링을 가능하게하는 최소 침습 촬상 방법이다. 13 C 핵 자기 공명 (NMR)에 기초하여 임의의 다른 방법으로 인한 13 C 및 낮은 자연 존재비의 비교적 낮은 회전 자기 비에 저열 분극 후속 낮은 신호대 잡음비의 도전에 직면 생물학적 시료. 이러한 한계를 극복하고, 이후 시료 용해 동적 핵 분극 (DNP)는 최근에 일반적으로 사용할 NMR 측정하는 자기 공명 영상 (MRI) 시스템을 사용한다양한 생물학적 시스템의 연구 및 이미지 주요 대사 경로. 13 CMRSI에서 사용되는 특히 흥미롭고 유망한 분자는 지난 10 년 동안 널리 최근 시험 관내, 비 임상 및 위해 사용되어왔다 [1-13 C] 프로피온산, 세포 에너지 대사를 조사하는 임상 연구이다 암과 다른 질병이다. 이 글에서, 우리는 3.35 T 전임상 DNP의 분극을 사용하여 용해 DNP의 기술 개요 및 시험관 연구에서의 사용을 보여줍니다. 과분극 대해 유사한 프로토콜뿐만 아니라 생체 내 연구의 대부분에 적용될 수있다. 이를 위해, 우리는 락 테이트 탈수소 효소 (LDH)를 사용하고 13 CMRSI를 사용하여 전립선 암 세포주 [1-13 C] 락트산 PC3, 시험관 내에서 [1-13 C] 피루브산 대사 반응을 촉매.

은 "마이크로파 소인"의 결과는도 3에 도시되어있다. 이는 [1-13 C] 프로피온산 샘플에 대한 최적의 마이크로파 주파수가 로컬 3.35-T의 분극 대 94.156 GHz의 것을 나타낸다. 모든 다음의 실험은 과분극 (N = 14)의 100 mW의 전력이 마이크로파의 주파수를 사용하여 수행 하였다. 마이크로파 조사에 90 %보다 높은 고체 과분극 선도, 60 내지 80 분 동안 적용 하였다. 결과는 그림 4에 제시되어있다. 과분극 [13 C] 프로피온산 5 × 106 (N = 2), 107 (N = 2), 2 × 107 (N = 1), 3 × 107 (N = 2), 4 × 혼합하고 107 (N = 1), 6 × 107 (N = 2), 8 × 107 (N = 2) 및 108...

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

In the past decades, new methods for tumor staging, restaging, treatment response monitoring, and recurrence detection of a variety of cancers have ...

이 절차의 전반적인 목표는 동적 핵 분극을 사용하여 탄소 13 표지 분자를 과분극화하고 탄소 13 자기 공명, 역시경 이미징을 사용하여 체외에서 enyzmatic 변환을 측정하는 것입니다. 이 방법은 탄소의 공명 신호를 10, 000에서 100, 000 겹에 의하여 증가해, 층을 이룬 화합물이 그들의 변화 산물에서 구별되는 것을 허용하고, 화상 진찰에 의해 몸에서 국지화되는 것을 허용하. VR 기법과 비교했을 때 이 방법의 가장 큰 장점은 살아있는 유기체에서 자연적으로 발생하는 물질의 신진대사를 실시간으로 볼 수 있다는 것입니다.또한 이 방법은 암의 대사에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 체외(in vitro)로 확인할 수 있습니다. 또한 동물 모델 및 인간 환자에게도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 적용은 종양 국소화를 능가합니다.대사성 종양 아형을 찾아 구별하고 최첨단 기술과 함께 치료를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 먼저 gadoterate meglumine의 1 밀리 몰 용액과 농축 된 1 탄소 13 피루브 산을 준비하십시오. 혼합물에 트리틸 라디칼 OX063을 첨가하여 15 밀리몰 최종 농도를 달성하고 완전히 용해시킵니다.DNP 편광판 소프트웨어에서 Cool Down'을 클릭하여 가변 온도 인서트(VTI)의 온도를 1.4켈빈 미만으로 낮춥니다. VTI가 냉각되면 약 8마이크로리터의 탄소 13 라벨 샘플 용액을 플라스틱 샘플 컵에 넣습니다. 컵을 샘플 삽입 로드에 부착합니다.소프트웨어에서 Insert Sample(샘플 삽입)'Select Normal Sample(일반 샘플 선택)'을 클릭한 후 Next(다음)'를 클릭하면 샘플 홀더가 올라가고 VTI에 대한 주입 밸브가 열려 샘플 삽입이 가능합니다. 프롬프트에서 삽입 로드를 사용하여 샘플 컵을 VTI에 밀어 넣습니다. 샘플 컵을 분리하고 삽입 로드를 조심스럽게 빼냅니다.샘플이 로드에서 분리되었고 폐쇄 절차 중에 VTI 밖으로 밀려나지 않았는지 확인합니다. 다음'을 클릭하여 밸브를 닫고 sample cup을 액체 헬륨으로 내린 다음 Finish'를 클릭하여 최적의 분극 주파수를 찾으려면 먼저 RINMR 소프트웨어를 시작하십시오. 구성 화면에서 Select Sample'을 클릭하고 Micro Sweep 수행'데이터를 저장할 파일을 만듭니다.DNP 편광판 소프트웨어로 다시 전환합니다. Calibrate' 탭을 선택하고 마이크로파 스윕 매개변수를 설정한 다음 마이크로파 스윕 프로세스를 시작합니다. 마이크로파 스윕이 완료되면 최대 측정 신호 진폭으로 주파수를 기록하십시오.RINMR 소프트웨어로 돌아가서 Solid Build Up'을 선택한 다음 DNP Polarizer 소프트웨어에서 Polarization'을 클릭하여 최적의 마이크로파 주파수와 전력을 입력합니다. Next(다음)를 클릭하고 'Enable Polarization Buildup Monitoring(편광 축적 모니터링 활성화)'을 클릭하고 Finish(마침)를 클릭합니다.95% 이상의 편광을 달성하기에 충분한 시간 동안 샘플을 편광합니다. 편광 중에는 수집 플라스크를 과편광 샘플 배기 튜브에 연결하고 분광계 근처에 놓습니다.3초 간격으로 110도 RF 펄스의 13개 탄소 스캔 시리즈가 있는 1개의 테슬라 NMR 분광계를 설정합니다. 피루브산 분극 중에 세포 배양 준비를 시작합니다. 세포 배양 플라스크에서 세포 배지를 제거합니다.약 10ml의 인산염 완충 식염수로 세포를 세척합니다. 배양 플라스크에 트립신 5ml를 추가합니다. 섭씨 37도에서 3-5분 동안 배양물을 배양한 다음 10% 태아 송아지 혈청을 부피 기준으로 함유한 약 5ml의 F12K 배지로 트립신을 비활성화합니다.그런 다음, 원하는 수의 세포를 포함하는 세포 현탁액의 부피를 플라스틱 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포 샘플을 1200G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10% FCS로 충분한 F12K 매체에 팔레트를 다시 매달아 최종 부피 800마이크로리터를 달성합니다.서스펜션을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 따뜻한 물을 채운 플라스틱 용기에 튜브를 넣습니다. 탄소 13 자기 공명 분광법을 통한 데이터 수집을 시작하려면 세포 샘플이 준비되고 피루브산 분광이 95% 이상일 때 DNP 편광판 소프트웨어에서 Run Dissolution'을 클릭합니다. 용해 챔버의 상단 밸브를 통해 용해제의 측정 부피를 로드합니다.용해 스틱을 활성 위치로 이동합니다. DNP 편광자 소프트웨어에서 '세포 샘플이 실험을 위해 준비되면 Finish'를 클릭하여 용출 프로세스를 초기화합니다. 용해 과정이 완료될 때까지 기다리십시오.200마이크로리터의 과분극 피루브산 용액을 800마이크로리터의 세포 샘플에 추가합니다. 피펫으로 잘 섞은 다음 약 600 마이크로 리터의 혼합물을 5mm NMR 튜브에 넣습니다. NMR 튜브를 분광계에 로드하고 실행'을 클릭하여 측정을 시작합니다.그런 다음 s가 부착된 용해 스틱을 이동합니다.ample cup을 세척 위치로 이동하고 DNP 편광판 소프트웨어에서 Finish'를 클릭합니다. 탄소 13 자기 공명 이미징을 시작하려면 과분극 과정을 시작한 후 세포 수가 10에서 8번째 사이인 800마이크로리터의 재현탁 세포 샘플을 3ml 주사기로 옮깁니다. 주사기를 긴 카테터에 연결하고 MRI 스캔 베드에 주사기를 놓습니다.카테터가 MRI 스캐너 외부에 닿을 수 있을 만큼 충분히 긴지 확인하십시오. 주사기 옆에 10% 가도테레이트 메글루민과 함께 10개의 몰 탄소 13 요소가 포함된 보정 팬텀을 놓습니다. 주사기에 탄소 13 튜닝 RF 수신기 코일을 놓습니다.관심 물체가 MRI 스캐너의 등심원에 있도록 스캐닝 베드를 스캐너에 삽입합니다. 연결 플라스크를 과편광 샘플 배기 튜브에 연결하고 카테터 끝 부분에 가깝게 놓습니다. 표준 3면 현지화 시퀀스를 실행하고 필요한 경우 주사기 위치를 조정합니다.그런 다음 주사기 국소화를 포함하는 양성자 T2 가중 해부학적 시퀀스를 설정하고 실행합니다. 결과 해부학적 이미지에서 탄소 13 팬텀을 포함하여 관심 영역의 연속 슬라이스 5개를 선택합니다. carbon 13 spectroscopic calibration acquisition을 설정하고 pulse sequence 라이브러리에서 2D block siert calibration sequence를 선택합니다.펄스 시퀀스를 스캐너에 다운로드하고 분광 사전 스캔을 실행합니다. 스펙트럼 크기 플롯에서 carbon 13 calibration phantom peak를 스캐너 주파수의 중심으로 설정합니다. 수신기 게인을 최대로 설정하고 Scan'을 클릭하여 보정 시퀀스를 실행합니다.보고된 전송 게인 및 중심 주파수를 기록합니다. 그런 다음 선택한 해부학적 슬라이스에 대한 탄소 13 화학적 이동 이미징 획득을 설정합니다. 2D echo-planar spectroscopic imaging sequence를 선택하고 pulse sequence를 스캐너에 다운로드합니다.분광 사전 스캔을 실행하고 보정 값을 기반으로 중심 주파수와 전송 게인을 조정하여 MRI 분광계 설정을 마칩니다. 피루브산이 95% 분극에 도달하면 DNP 편광판 소프트웨어에서 '용해 실행'을 클릭하고 용출제를 로드합니다. 용해 스틱을 활성 위치로 이동합니다.다음'을 클릭한 다음 마침'을 클릭합니다.용해된 과분극 샘플이 수집 플라스크에 도달하면 약 1ml의 과분극 용액을 주사기에 주입하고 200마이크로리터가 세포 샘플에 도달하도록 카테터에 주입합니다. Scan'을 클릭하여 실험 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 수집이 완료되면 s가 부착된 용해 스틱을 이동합니다.ample cup을 세척 위치로 이동하고 DNP NMR 소프트웨어에서 Finish'를 클릭합니다.피루브산과 젖산의 대사 교환율은 빈도와 시간에 대한 과분극 젖산염과 피루브산의 탄소 13 NMR 분광법 신호 강도를 모니터링하여 전립선 암종 PC3 세포에서 연구되었습니다. 젖산 동역학 값은 단순 비율 모델과 2-부위 교환 차이 모델에 의해 평가되었으며 세포 수로 정규화되었습니다. 두 모델 모두에서 세포 수가 증가함에 따라 젖산 생산이 감소하는 추세가 관찰되었습니다.이는 시료의 세포 농도와 점도가 더 높기 때문입니다. 세포 수가 2 곱하기 10에서 7 미만인 샘플은 매우 작은 젖산 신호 대 잡음비를 보여주므로 표준 편차 값이 크므로 샘플에 정보 데이터를 얻기 위해 최소한 해당 수의 세포가 포함되어야 함을 나타냅니다. 우수한 스펙트럼 해상도의 MRI를 통해 공간 국소화를 달성하여 특정 주파수 영역에 대한 탄소 13 이미지를 획득할 수 있었습니다.공간 분포는 원시 데이터에서 결정되었습니다. 탄소 13 이미지는 이전에 획득한 양성자 이미지와 함께 정합될 수도 있습니다. 이 실험을 마스터하고 적절하게 수행하면 60분 이내에 완료할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 동적 핵 분극 기술을 사용하여 원하는 분자의 과분극을 수행하는 방법과 간단한 NMR 분광학 및 세포 이미징 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 매우 빠른 것이 중요합니다. 과분극 샘플이 편광판을 떠난 후에는 2분 이내에 얻은 모든 NMR 신호가 손실된다는 점을 기억하십시오.결론적으로, 용출 DNP는 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에는 당뇨병과 같은 질병에 대한 연구 또는 다양한 유형의 암의 대사 변화를 관찰하는 것뿐만 아니라 조직의 pH를 측정하는 것도 포함됩니다.

hyperpolarized-13c-metabolic-magnetic-resonance-spectroscopy

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

광학 스핀 교환 (SEOP) 펌프에 의해 hyperpolarized 크세논의 생산 설명되어 있습니다. 이 방법은 XE-129의 핵 스핀 분극의 ~ 10,000 배 향상을 산출하고 핵 자기 공명 분광법 및 이미징에 응용 프로그램이 있습니다. 기상 및 솔루션 상태 실험의 예는 주어집니다.

NMR과 MRI 응용 프로그램 용 Hyperpolarized 지논

이 기사는 양측 자극이 1차 운동 피질 대사에 미치는 영향을 조사하기 위해 경두개 직류 자극(tDCS)과 양성자 자기 공명 분광법(1H-MRS) 측정을 결합하기 위한 기본 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 합니다.

일차 운동 피질 대사에 양성 반구 경 두개 전기 자극 효과의 측정을위한 도구로 자기 공명 분광학의 사용

신경 근육 질환은 종종 다양한 시간적, 공간적으로 불균일하고, 다방면 병변을 나타낸다. 이 프로토콜의 목적은 비 침습 자기 공명 영상 법을 이용하여이 병변을 특성화한다.

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다중 구획 동적 팬텀은 hyperpolarized magnet resonance agents를 사용하여 대사 연구를 위한 일부 관심 생물학을 시뮬레이션하는 데 사용됩니다.

과분극 자기 공명 에이전트의 연구 다중 구획 동적 단일 효소 팬텀의 사용

새로운 전자 상자성 공명 (EPR) 방법, 빠른 스캔 EPR (RS-EPR)는, 기존의 연속파 (CW) 기술보다 우수하고 생체 내 이미징을위한 새로운 장소를 엽니 다 2D 스펙트럼 공간 영상에 대한 설명된다. 결과 250 MHz에서 입증되지만, 기술은 주파수에서 적용 가능하다.

빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다<em&gt; 생체</em

우리는 빠른 필드 사이클 이완을 사용하여 동적 핵 편광에 의해 과분극 13C 농축 화합물의 스핀 격자 이완 시간의 자기장 의존성을 측정하는 프로토콜을 제시한다. 구체적으로, 우리는[1-13C] pyruvate로 이것을 입증했습니다, 그러나 프로토콜은 그밖 과극화한 기판으로 확장될 수 있었습니다.

과분극[1-13C] 피루바테의 스핀 격자 이완 자기장 의존도 측정

우리는 연속 관류 모드에서 과분극된 13C표지 대사산물을 분리된 관류된 마우스 심장에 투여하기 위한 실험 설정을 설명합니다. 전용 13C-NMR 획득 접근법을 통해 대사 효소 활성을 실시간으로 정량화할 수 있었고, 다중모수 31P-NMR 분석을 통해 조직 ATP 함량 및 pH를 측정할 수 있었습니다.

과분극 [1-13C] 피루브산 및 13C / 31P NMR 분광법을 사용하여 분리 된 관류 마우스 심장에서 심장 대사 조사

이 원고는 과분극 Xenon-129 화학적 이동 포화 회복(CSSR)을 사용하여 폐 가스 교환을 추적하고, 겉보기 폐포 중격 벽 두께를 평가하고, 표면 대 부피 비율을 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 폐 질환을 진단하고 모니터링할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Quantitative Measure of Lung Structure and Function Obtained from Hyperpolarized Xenon Spectroscopy(과분극 크세논 분광법에서 얻은 폐 구조 및 기능의 정량적 측정)

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

학습하세요 동적 핵분극을 이용한 과분극(13)C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징 방법으로 전립선암 세포에서 젖산 탈수소효소 활성을 실시간 측정하는 기술입니다. 이 방법은 암 대사 연구에 활용됩니다.

과분극⁽¹³⁾ C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

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