하이브리드 컷 : 난 분해성 식물 조직 샘플에 대한 개선 단면 방법

하이브리드 절단 조직 절편 방법의 전반적인 목표는 단단한 섬유와 실리카 결정이 있는 절편화된 난치성 식물 조직의 무결성을 개선하여 해부학 및 생물학 연구에 적합한 조직 샘플을 만드는 것입니다. 높은 수준의 결정과 실리카를 함유 한 식물은 절단 중에 심각한 파라핀 파열과 문제를 겪을 수 있습니다. 이 방법은 조직의 무결성을 크게 향상시킵니다.

이 기술의 주요 장점은 저온 유지 장치에서 초저온 하에서 절편화하면 파라핀 블록이 경화되어 결정 전단 문제가 크게 줄어든다는 것입니다. 이 기술의 적용은 현장 혼성화, FISH 및 내부 평가로 확장될 수 있습니다. 파라핀 블록이 스테이지에 단단히 부착되었는지 확인하는 단계가 어려울 수 있으므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

시작하려면 다섯 잎 단계에서 성숙한 호접란 난초 식물을 선택하십시오. 중간 갈비뼈를 따라 잎을 찢어 조심스럽게 제거합니다. 날카로운 메스를 사용하여 단골계의 세 번째 또는 네 번째 잎 기저부에서 겨드랑이 새싹을 조심스럽게 제거합니다.

즉시 샘플을 15ml의 얼음처럼 차가운 PFA 고정제가 들어 있는 유리 섬광 바이알에 넣습니다. 정착액의 시료를 섭씨 4도에서 15-20분 동안 진공 청소기로 청소합니다. 샘플에서 작은 기포가 방출됩니다.

진공 해제 후 대부분의 샘플이 가라앉을 때까지 이 단계를 반복합니다. 마지막으로, 진공 청소기를 밤새 유지하고 다음 날 천천히 해제하십시오. 다음으로, 고정된 샘플을 15ml의 PBS에 담그고 얼음 위에 15분 동안 놓습니다.

농도 증가로 15 밀리리터의 에탄올로 샘플을 탈수합니다. 30%50%70%85%95%및 마지막으로 100%실온에서 2:1 부피의 에탄올과 크실렌 대체 혼합물 15밀리리터로 샘플을 침투시킵니다. 샘플을 다음 각 15ml에 순차적으로 배치하여 침투를 계속합니다.

에탄올과 크실렌 대체물의 1 대 1 부피 대 부피 혼합물, 에탄올과 크실렌 대체물의 1 대 2 부피 혼합물, 그리고 마지막으로 순수한 자일렌 대체물. 그런 다음 섭씨 60도의 오븐에서 조직을 배양합니다. 섭씨 60도에서 15밀리리터의 자일렌 대체물과 파라핀 혼합물을 샘플에 침투시킵니다.

마지막으로, 섭씨 60도에서 각각 12시간 동안 두 번씩 15mm의 순수 파라핀에 파라핀을 침투시킵니다. 다음 날에도 이 단계를 반복합니다. 임베딩을 시작하려면 먼저 금속 주형을 섭씨 62도로 예열한 다음 약 13ml의 용융 왁스를 금형 베이스에 붓습니다.

따뜻하게 데운 집게를 사용하여 조직 샘플을 금형에 옮기고 원하는 위치로 방향을 잡습니다. 금형을 냉각판으로 조심스럽게 옮기고 왁스가 응고될 때까지 그대로 두십시오. 다음으로, 면도날을 사용하여 파라핀 샘플 블록을 상단에 사다리꼴 표면이 있는 적절한 크기의 컬럼으로 자릅니다.

800마이크로리터의 광학 절단 온도 화합물(OCT)을 저온 유지 장치 스테이지의 중앙에 추가합니다. 파라핀 블록을 스테이지에 놓고 조직 블록을 원하는 위치로 빠르게 향하게 합니다. 파라핀 블록과 스테이지를 crystat 챔버로 옮깁니다.

OCT를 섭씨 영하 42도에서 10분 동안 급속 동결합니다. 다음으로, 크라이스탯 어댑터와 챔버 온도를 각각 섭씨 음의 20도와 섭씨 음의 16도로 냉각합니다. 블록과 스테이지를 crystat 어댑터에 연결합니다.

이제 조직을 10마이크로미터 두께로 절단합니다. 겸자를 사용하여 조직 부분을 집어 폴리-l-라이신 코팅된 슬라이드에서 800마이크로리터의 DEPC 처리수에 뜨도록 놓습니다. 슬라이드를 섭씨 42도로 설정된 핫 플레이트로 옮깁니다.

단면이 평평해지도록 하고 여과지를 사용하여 가장자리의 물을 흡수합니다. 조직이 슬라이드에 장착될 수 있도록 샘플을 섭씨 42도의 핫 플레이트에 밤새 그대로 두십시오. 샘플을 파라핀화하려면 먼저 장착된 조직 슬라이드를 염색 랙에 놓습니다.

염색 용기에 자일렌 150ml를 넣고 슬라이드 랙을 5분 동안 담그십시오. 다음으로, 실온에서 한 번에 3분 동안 각각 150밀리리터씩 감소하는 에탄올 농도에 샘플을 배치하여 샘플을 재수화합니다. 마지막으로 표본을 이중 증류수에 3분 동안 담그십시오.

슬라이드를 150ml의 헤마톡실린 용액에 1.5분 동안 넣어 샘플을 염색합니다. N 염산 1-2방울이 포함된 이중 증류수 150ml에서 몇 초 동안 헹군 다음 이중 증류수로 슬라이드를 잠시 세척합니다. 실온에서 3분 동안 에탄올 농도를 증가시키는 150ml를 사용하여 샘플을 한 번 더 탈수합니다.

표본을 150ml의 자일렌에 5분 동안 담급니다. 마지막으로, 600마이크로리터의 자일렌 기반 장착 매체를 각 슬라이드에 부드럽게 첨가한 다음 표본 위에 커버 슬립을 놓아 샘플을 장착합니다. 이 방법을 사용하여 팔레놉시스 난초의 조직 절편이 생성되었으며, 여기에는 일반적으로 절단하기 어려운 겨드랑이 새싹이 포함되며, 이는 높은 수준의 결정을 포함하고 있습니다.

상세한 구조가 보존되어 단백질 몸체를 시각화할 수 있었습니다. 하이브리드 절단은 또한 발아된 씨앗의 싹 정점 분열체를 시각화하기 위한 명확한 단면을 생성했습니다. 이 이미지는 전통적인 파라핀 대 하이브리드 절단 절단 기술을 사용하여 벼와 밀 식물의 가로 잎 부분을 준비하는 방법을 보여줍니다.

이러한 작물에는 일반적으로 높은 수준의 실리카가 포함되어 있어 절단하기가 어렵습니다. 하이브리드 절단 절편의 조직 무결성이 크게 개선되었으며, 파라핀 샘플에서 종종 왜곡되거나 찾기 어려운 주요 구조가 하이브리드 절단 조직에서 전체적으로 보존되었습니다. 또한, 찢어짐은 파라핀 절편 샘플에서만 관찰되었습니다.

또한 해부학적 구조가 강력하게 유지되기 때문에 하이브리드 절단 조직은 공간 유전자 발현 패턴 연구에 유용합니다. 여기서, Actin 및 Cyclin B1:1을 사용한 현장 교잡은 호접란의 두 번째 및 세 번째 겨드랑이 새싹의 하이브리드 절단 섹션에서 수행되었습니다. 개선된 해부학적 보존을 통해 세 번째 겨드랑이 새싹의 발달 중인 분열 세포에서 표적 유전자의 더 높은 발현 수준을 검출할 수 있었습니다.

이 절차를 시도하는 동안 파라핀 블록을 경화시키기 위해 온도를 섭씨 영하 16도로 유지하는 것이 중요합니다. 이것은 좋은 품질의 조직 절편을 가져와야 합니다. 우리는 전통적인 파라핀 또는 냉동 절편 방법을 사용하여 난초에서 성공적인 절편을 수행하는 데 여러 번 실패한 후 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다.

이 절차에 따라 유전자 공간 국소화 및 기능 조사를 포함한 추가 질문에 답하기 위해 현장 교잡 및 FISH와 같은 모든 실험을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 난치성 식물 샘플에서 고품질 조직 절편을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.