간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 : 체외 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

이 간접 공동 배양 분석의 전반적인 목표는 성상세포가 뉴런 발달에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 우리 연구실은 뉴런-아교세포 상호작용의 역할에 관심이 있습니다. 성상세포는 중추신경계의 연결 구조인 시냅스의 형성에 기여하는 것으로 여겨집니다.

이들의 역할을 연구하기 위해 우리는 1차 성상세포와 1차 배아 뉴런을 별도의 구획에 결합할 수 있는 시험관 내 모델을 설계했습니다. 구획은 투과성 멤브레인으로 연결되어 있어 두 세포 유형 간의 교환을 분석할 수 있습니다. 이 접근 방식을 사용하여 최대 4주 동안 시냅스 형성을 모니터링할 수 있었습니다.

또한, 이 분석을 사용하여 한편으로는 성상세포의 개별 역할을, 다른 한편으로는 뉴런의 개별 역할을 조사할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 또한 우리 세포 구획의 분비체를 더 자세히 조사할 수 있는데, 여기에는 해당 시스템에서 두 세포 구획의 상호 영향을 매개하는 분자가 포함되어 있습니다. 이 방법은 뉴런과 성상세포 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 쥐의 세포와 같은 다른 모델 유기체에 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 해마 조직의 최적 성숙 수술을 얻기 위해 경험이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 피질을 절개하려면 목에서 시작하여 눈높이까지 정중선을 따라 두개골의 피부를 제거합니다.

그런 다음 한 쌍의 집게로 머리를 상부 끝으로 잡고 두개골의 정중선을 따라 절개합니다. 그런 다음 두개골의 왼쪽과 오른쪽 절반을 잘라내어 뇌를 노출시킵니다. 그런 다음 두개골에서 뇌를 들어 올려 HBSS로 채워진 10cm 페트리 접시로 옮깁니다.

모든 뇌가 접시에 모일 때까지 나머지 표본에 대해서도 같은 방식으로 진행하십시오. 피질을 분리하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 뒷다리를 꼬집습니다. 두 반구 사이의 정중선을 절개합니다.

조심스럽게 뇌를 고정하고 두 번째 집게를 사용하여 중뇌와 후각구를 잘라내면 두 개의 피질 반쪽이 생깁니다. 그런 다음 한 쌍의 집게로 한쪽 피질 반쪽을 고정하고 측면 가장자리에서 분리하여 수막을 벗겨냅니다. 그런 다음 두 번째 쌍의 집게를 사용하여 피질 표면에서 당깁니다.

표면이 아래를 향하도록 피질 절반의 방향을 지정합니다. 초승달 모양의 해마를 조심스럽게 해부하고 제거합니다. 그런 다음 피질을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

2ml 반응 튜브에 데넴 1ml와 0.1%wv 파파인을 추가합니다. 용액이 투명해질 때까지 섭씨 37도의 수조에서 현탁액을 배양합니다. 혼합물에 L-시스테인과 DNAse를 넣고 부드럽게 흔듭니다.

그 후 혼합물을 여과하여 1ml의 멸균 용액을 얻은 다음 피질 조직에 첨가하고 섭씨 37도에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 소화 반응을 종료하려면 성상교세포 배지 1ml를 추가하고 분해된 조직을 조심스럽게 적정합니다. 그 후, 세포 현탁액에 성상교세포 배지 5ml를 추가합니다.

조직이 단일 세포 현탁액으로 해리되면 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 생성된 펠릿에서 상등액을 조심스럽게 흡인하고 1ml의 성상교세포 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 9ml의 성상교세포 배지로 보충된 T75 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다.

7일간의 배양 후 세포가 confluent monolayer를 형성했는지 확인합니다. 온도가 섭씨 37도로 조정되고 플라스크의 필터가 이산화탄소의 증발을 방지하기 위해 실험실 필름으로 밀봉되어 있는지 확인하십시오. 전구 세포를 제거하고 순수한 성상세포 배양을 얻기 위해 T75 플라스크를 안와 쉐이커에 놓고 분당 250회 회전으로 밤새 배양물을 흔듭니다.

다음 날 배지를 흡인하고 20마이크로몰 RSE가 보충된 10ml의 신선한 배양 배지를 추가하여 잔류 분열 세포를 제거합니다. 이 절차에서는 24웰 플레이트에 필요한 만큼 인서트를 배치합니다. 각 삽입체에 ml당 10마이크로그램의 폴리글리신을 코팅하고 1시간 동안 배양합니다.

1시간 후 PBS로 인서트를 두 번 세척합니다. 그 동안, 성상교세포 배지를 흡인하고 PBS 10ml로 배양액을 한 번 세척하여 잔류 혈청이 제거되었는지 확인합니다. 다음으로, 플라스크에 0.05%트립신 edta 3ml를 첨가하고 약 10분 동안 트립신화를 위해 세포를 배양합니다.

그 후, 7ml의 성상교세포 배지에 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 216 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 조심스럽게 흡인하고 세포 펠렛을 성상세포 배지 1ml에 다시 현탁시킵니다.

계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 그런 다음 24웰 플레이트에 웰당 500마이크로리터의 성상교세포 배지를 채웁니다. PBS를 흡인하고 25, 000개의 세포와 500마이크로리터의 성상교세포 배지를 각 개별 삽입물에 전달하고 섭씨 37도에서 배양을 배양합니다.

해마를 해부하려면 준비 배지로 채워진 10cm 접시 3개와 준비 배지 1ml가 있는 2ml 튜브 1개를 준비합니다. 피질 noyadees에서 해마를 해부하고 준비 배지로 채워진 2ml 튜브에 수집합니다. 해마는 CNS의 다른 영역으로부터 인접한 조직 없이 격리되는 것이 중요합니다.

따라서 해마를 제거한 후에는 이물질을 오염시키는 이물질을 추가로 제거해야 합니다. 해부 후 튜브를 멸균 층류 벤치로 옮깁니다. 제제 매체를 조심스럽게 제거하고 파파인이 함유된 소화 용액 1ml의 해마 조직을 소화합니다.

15분 동안 소화한 후 피펫으로 부드럽게 흡입하여 소화 용액을 조심스럽게 빼냅니다. 뉴런의 민감도가 높기 때문에 기포를 피하고 최적의 적정 강도를 얻기 위해 해마를 조심스럽게 적정하는 것이 중요합니다. 세척 주기당 1ml의 신선한 배양 배지를 추가하고 조심스럽게 흡인하여 뉴런 배지로 해마를 세 번 세척합니다.

마지막 세척 단계 후, 1ml의 뉴런 배지에서 조직을 조심스럽게 적정합니다. 그런 다음 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다. 플레이트 35, 24 웰 플레이트의 웰 당 500 마이크로 리터의 뉴런 매체에 000 개의 세포를 플레이트하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 뉴런을 배양합니다.

이제 confluent astrocyte monolayer로 파종된 준비된 삽입물을 인큐베이터에서 꺼냅니다. 성상교세포 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 새로운 뉴런 배지로 교체하여 배지를 교환합니다. 그런 다음 멸균 집게를 사용하여 성상세포가 있는 삽입물을 뉴런 배양이 포함된 웰에 조심스럽게 넣습니다.

그 후, 실험이 진행될 때까지 생성된 간접 뉴런 성상세포 공동 배양을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 이 이미지는 세포 배양 삽입막에서 성상세포에 의해 형성된 단층을 보여줍니다. 성상세포는 GFAP와 MMP2에 대해 면역염색됩니다.

여기의 체계는 간접 공동 배양 설정을 보여줍니다. 두 문화는 물리적으로 분리되어 있지만 동일한 매체를 공유합니다. 뉴런 신경교세포 상호작용의 두 가지 분비된 분자 매개체는 노골적인 성장 조절자인 TNC와 여분의 세포 기질 변형자인 MMP2의 여러 동형이 있는 웨스턴 블롯을 사용하여 공동 배양 배지에서 밝혀졌습니다.

이 이미지는 1차 뉴런이 재배 14일째까지 고도로 상호 연결된 네트워크를 발달시키는 것을 보여줍니다. 시냅스전 마커 바순과 시냅스후 PSD95 골격의 공동 국소화는 구조적으로 완료된 시냅스 형성을 문서화합니다. 결론적으로, 우리의 분석 시스템을 사용하여 우리는 coculture 모델에서 1차 성상세포와 1차 뉴런을 결합할 수 있음을 보여주었습니다.

두 서타입은 분리되어 있지만 동일한 매체를 공유합니다. 따라서 우리는 모델에서 두 surtype의 분비체를 조사할 수도 있습니다. 이 모델에서는 시냅스가 발달하고 성숙합니다.

또한 주위 그물과 같은 추가적인 특정 구조의 출현을 보여줄 수도 있습니다. 따라서 우리의 모델 시스템은 시냅스 형성, 가소성 및 기능에 대한 성상세포의 영향을 조사하는 데 매우 적합합니다.