Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과

본 연구의 전반적인 목표는 지카 바이러스의 복제를 연구하고, 약물 개발을 위한 인비트로(in vitro) 플랫폼으로 활용하기 위해 포유류 세포 기반의 인비트로 지카 바이러스 감염 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 지카 바이러스 감염 세포 배양 시스템에 관한 이 단계별 상세 프로토콜은 지카 바이러스가 매개하는 질병의 발병 기전과 바이러스 병원성의 진화를 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약물 및 백신 개발을 위해 지카 바이러스를 대량으로 생산할 수 있다는 점입니다.

T75 배양 플라스크에서 세포 밀도가 80%에 도달한 Vero 세포를 수확하는 것으로 시작합니다. 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거하고 2 mL의 인산염 완충 식염수로 세포를 헹굽니다. 0.25% trypsin 2 mL를 첨가하고 플라스크를 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 혈청이 포함된 성장 배지 8 mL를 첨가하여 trypsin을 불활성화합니다. 그런 다음, 세포를 15 mL 튜브로 옮깁니다. 이어서, 세포 10 µL를 취해 동일한 양의 0.4% trypan blue와 혼합합니다. 준비된 혼합물을 세포 계수 챔버 슬라이드에 로딩하고 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정합니다. 총 7,000,000개의 세포를 30 mL 부피의 T160 플라스크에 분주합니다. 다음 날, 플라스크당 10 mL의 무혈청 배지에 적절한 감염 다중도(MOI)의 Zika virus 접종액을 준비합니다.

감염 확산을 방지하기 위해 바이러스를 안전하게 취급하는 것이 매우 중요합니다.

T160 플라스크에서 사용한 배지를 제거한 후, 새로 조제한 바이러스 접종액 10 milliliters를 모두 첨가합니다. 접종된 플라스크를 37 degrees Celsius, 5%CO2 조건에서 4~6시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 매시간 플라스크를 옆으로 부드럽게 기울여 접종액을 도포합니다. 배양이 완료되면 접종액을 따뜻한 혈청 보충 성장 배지 30 milliliters로 교체합니다. 그 후, 바이러스 배양을 향후 96시간 동안 계속합니다. 4일 후, 위상차 현미경을 사용하여 세포 단층에 형성된 바이러스 플라크의 외형을 관찰함으로써 감염 진행 상태를 확인합니다. 필요에 따라 40x 및 200x 배율로 이미지를 촬영합니다.

96시간 시점에서 세포 배양 상층액을 수집하고, 4°C에서 300 ×g로 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 원심분리 후, 침전된 파편이 섞이지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하여 15 mL 튜브로 옮깁니다.

바이러스 배양 상층액을 여러 개의 분주액으로 나누어 -80 °C에서 보관하십시오.

바이러스 역가를 측정하려면, 먼저 나이브 Vero 세포를 12-웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁵ cells의 밀도로 2 mL 부피로 분주합니다. 다음 날, 무혈청 배지를 사용하여 T160 플라스크에서 수집한 바이러스 배양 상층액의 10배 단계 희석액을 준비합니다.

역가 측정을 위한 바이러스 배양 상층액의 단계 희석액을 준비할 때, 감염을 방지하기 위해 바이러스를 안전하게 취급하십시오.

다음으로, Vero 세포가 포함된 12-well 플레이트의 각 웰에서 배양액을 제거하고, 희석된 접종액 400 µL를 Vero 세포에 3반복으로 첨가합니다. 접종된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 4~6시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면, 웰당 2 mL의 혈청 보충 배지로 접종물을 교체합니다. 접종 48시간 후, 위상차 현미경을 사용하여 적절한 희석 배수에서 바이러스 포커스를 계수합니다. 바이러스 역가를 mL당 플라크 형성 단위(plaque-forming units per milliliter)로 계산합니다.

12-웰 플레이트에 Vero 세포를 고농도 및 저농도의 지카 바이러스로 접종하고 48시간 및 96시간 동안 배양한 후, 지카 바이러스 게놈의 발현에 대한 정량적 PCR과 이중 가닥 RNA에 대한 면역세포화학법을 통해 게놈 복제를 평가합니다.

면역세포화학 염색을 위해, 12-well 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 각 웰에 methanol 1 mL를 추가합니다. 세포를 4 °C에서 30분 동안 고정합니다. 그다음, 고정된 세포를 1x PBS로 3회 세척합니다. 그런 다음 blocking buffer를 추가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. mouse monoclonal anti-double-stranded RNA antibody J2를 blocking buffer에 1:100으로 희석하여 세포에 추가하고, 이 용액에서 세포를 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, goat anti-mouse IgG-594 secondary antibody를 blocking buffer에 1:1,000으로 희석하고, 세포를 1x PBS로 세척한 후 이를 세포에 추가하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포를 1x PBS로 세척한 후 Hoechst 염료를 사용하여 핵을 염색하고, 형광 현미경의 100배 배율로 세포를 관찰합니다.

이전과 동일하게 naive Vero 세포를 12-well 플레이트에 분주한 후 6시간이 지나면, 지시된 농도의 표적 사이토카인을 생물학적 반복구(biological duplicates)로 첨가합니다. 처리 12시간 후에 지카 바이러스를 감염시키며, 감염시키지 않은 음성 대조군 well을 포함합니다. 감염 4시간 후, 바이러스 접종액을 사이토카인 처리된 배지로 교체한 다음 세포를 37 °C에서 44시간 동안 추가로 배양합니다. 감염 48시간 후에 위상차 현미경을 사용하여 바이러스 플라크 수를 측정하고, 감염된 세포의 대표 이미지를 40배 배율로 획득합니다.

이 그래프는 RT-qPCR로 측정한 지카 바이러스(Zika virus)의 게놈 함량을 보여줍니다. Pan 유전형 프라이머와 PRVABC-59 균주 프라이머 모두 동일한 민감도와 특이도를 나타냈습니다. 예상대로, C형 간염 바이러스 프라이머에서는 어떠한 산물도 증폭되지 않았습니다.

비감염 모의 대조군과 비교하여, 저농도 및 고농도로 감염된 세포에서 표시된 시간대별 Zika 바이러스의 성장 역학이 여기에 나타나 있습니다. 면역세포화학 분석 결과, 감염 후 48시간에는 감염된 세포가 소수의 클러스터를 형성하고 있는 반면, 감염 후 96시간에는 대부분의 세포가 감염되었음을 보여줍니다. 이 그래프는 용매 대조군과 비교하여 다양한 사이토카인에 의한 Zika 바이러스 성장 조절을 보여줍니다.

이 위상차 현미경 이미지들은 사이토카인 처리 여부에 따른 지카 바이러스 감염 세포들을 보여줍니다. 감염된 세포들에 의해 형성된 바이러스 플라크는 초점으로 관찰할 수 있습니다. 인터페론을 처리한 웰에는 바이러스 플라크가 생성되지 않았음에 유의하십시오.

본 절차 이후에는 모기 및 인간 세포 내 바이러스 단백질의 위치와 복제를 위한 지카 바이러스 고해상도 도메인 매핑과 같은 다른 방법들을 수행하여, 질병 발병 기전의 규명 및 바이러스 독성의 진화와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 지카 바이러스 복제를 연구하기 위한 포유류 세포 기반의 인 비트로(in vitro) 지카 바이러스 감염 배양 시스템을 구축하는 방법과, 약물 및 백신 개발을 위한 인 비트로 플랫폼의 활용 방안에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.