Name: Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과 체외 예방 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 배우세요 Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템을 Vero 세포를 사용하여 체외에서 바이러스 복제와 병원성 메커니즘을 연구하는 방법. 이 기술은 대규모 바이러스 생산과 백신 및 치료제 개발에 필수적인 도구입니다.

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지카 바이러스 균주 PRVABC59 제공해 주신 미국 질병통제예방센터(CDC)의 Aaron Brault 박사와 Brandy Russell 박사에게 감사드립니다. 이 원고를 카피 에디팅해 준 예일 대학교의 니콜라스 텐(Nicholas Ten)에게 감사한다. 이 연구는 V.A.에 수여하는 Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award의 지원을 받았습니다.

주 : 작업 흐름의 개략적 개요는도 1에 제시된다. 1. 세포 <ol><li> Zika 바이러스 생산 및 바이러스 성 복제주기의 분석을위한 베로 세포를 사용합니다. </li><li> 전체 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM의 L- 글루타민, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신을 함유하는 성장 배지 (100 단위 / ml), 및 10 mM의 HEPES를 준비한다. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 특정 완료 성장 배지 베로 세포 배양. </li></ol> 2. Zika 바이러스 생산 <ol><li> T-75 플라스크에 0.25 % 트립신을 사용하여 80 %의 세포 밀도의 베로 세포를 수확하고, 세포 수를 계산. <ol><li> T-75 배양 플라스크에서 미디어를 대기음 2 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 세포를 씻어. </li><li> 0.25 % 트립신 2 ML을 추가하고 5 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li><li> 트립신을 불 활성화하는 성장 매체를 포함하는 혈청의 8 ML을 추가합니다. 피펫 위 SUS 아래로PEND 세포를 15 ㎖의 튜브에 세포를 전송하고. </li><li> 세포의 10 μl를 제거하고 0.4 % 트리 판 블루의 동일한 양으로 혼합한다. 셀 카운팅 챔버 슬라이드에 준비된 믹스를 넣고 자동 세포 계수기를 사용하여 카운트하여 생존 세포를 얻을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 은 T-160 플라스크에 30 mL의 부피로 세포 7,000,000 개의 종자. </li><li> 다음 날, 플라스크 당 10 ml의 무 혈청 배지에서 Zika 바이러스 접종의 (0.1 MOI 0.01) 감염의 적절한 다수를 준비합니다. </li><li> T-160 플라스크에서 소비 된 용지를 제거하고 새로 제조 된 바이러스 접종 물 (10 ㎖)를 추가합니다. </li><li> 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접종 플라스크를 품어. 부드럽게 모든 시간에 옆으로 플라스크를 기울여 접종을 확산. </li><li> 배양 완료시, 각 플라스크 따뜻한 혈청 보충 성장 미디어 (30 ㎖)으로 접종을 교체합니다. 그런 다음 96 시간 동안 바이러스 문화를 계속합니다. </li><li> 에서의 진행을 확인위상차 현미경을 이용하여 40 배 및 200 배 배율 필요한 이미지 (도 2)를 가지고 세포 단층에 바이러스 플라크의 외관을 관찰하여 fection. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> 그림 2 :. 다양한 배율의 베로 세포의 단층에 Zika 바이러스에 의해 형성된 플라크 밝은 필드 이미지는 48 HPI에서 Zika 바이러스 플라크를 보여줍니다. 단일 층에 둥근 세포 병소의 존재를합니다. (스케일 바 = 50 μm의)는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="8"><li> 96 시간 시점에서 원심 분리 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG의 상등액에서 수확 세포 배양 상청 균체 잔사를 제거했다. </li><li> 조심스럽게 방해 펠렛 파편과 전송 t없이 뜨는을 제거15 ml의 튜브 오. 24,000 XG에 초 원심 분리 (옵션) 바이러스 입자를 집중 수행 할 수 있습니다. </li><li> -80 ° C에서 여러 분취에서 바이러스 배양 상층 액을 저장합니다. </li></ol> 플라크 분석 3. 측정 Zika 바이러스 역가 <ol><li> 12 웰 플레이트를 사용하여 2 ml의 볼륨에 웰 당 1 × 10 5 세포에서 종자 순진 베로 세포. </li><li> 다음날, 혈청이없는 배지를 사용하여 T-160 플라스크에서 수집 바이러스 배양 상청액의 연속 희석 1/10 제조. 각에서 소비 된 미디어를 잘 제거하고 중으로 베로 세포에 준비 접종의 400 μl를 추가합니다. </li><li> (37)에 접종 플라스크를 품어 4 ~ 6 시간 동안 5 % CO 2와 C를 °. 조심스럽게 하나 하나 시간에 옆으로 판을 기울여 접종을 확산. </li><li> 인큐베이션의 끝에, 세럼이 보충 미디어 접종 (웰 당 2 ml)로 교체한다. </li><li> 48 시간 포스트 접종에서, 위상 제어 방식을 사용하여 바이러스 초점을 계산AST 현미경. ml의 당 플라크 형성 단위 (PFU)와 같은 바이러스 역가를 계산합니다. 플라크 분석 그림 3을 참조하십시오. </li><li> 수정하고 플라크 명확한 시각화 20 % 에탄올 중에서 제조 된 4 % 포름 알데히드 셀 0.1 % 크리스탈 바이올렛 용액을 착색. </li></ol> 4. Zika 바이러스 성 게놈 복제 분석 <ol><li> 12 웰 플레이트를 사용하여 2 ml의 볼륨에 웰 당 1 × 10 5 세포에서 종자 순진 베로 세포. 세중에서 혈청 무료 매체를 사용하여 낮은 및 높은 역가의, 그 다음날은 바이러스 접종 (400 μL / 웰 0.01 및 0.1의 MOI)를 준비합니다. 모의 감염, 혈청이없는 배지 (400 μL / 웰) 만 사용합니다. </li><li> 3.4 단계 3.2를 반복합니다. </li><li> 48 및 96 시간 시점에서, RNA 및 면역 세포 화학 (ICC)에 샘플을 수집한다. <ol><li> 수확 RNA 샘플의 경우, 미디어를 제거한 다음 해물을 잘 직접 각 용해 액 400 μl를 추가하고 수집합니다. </li><li> ICC를 들어, 미디어 및 t 제거암탉 각 웰에 1 ml의 메탄올을 첨가하여 세포를 고정시키고, 30 분 동안 4 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 세포 파쇄물, 제조자의 지시 당 RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 분리. 분광 광도계를 사용하여 RNA를 정량화. </li></ol></li><li> 수확 된 RNA로부터 ZIKV 게놈 콘텐츠를 결정하기 위해 두 단계의 정량적 역전사 PCR (RT-qPCR에)을 수행한다. <ol><li> RNA의를 전사 바꾸려면, 먼저 0.2 ML 튜브에서 격리 RNA의 5 μg의,의 dNTPs (10 mM)을 1 μL, 1 μL 무작위 헥사 (250 NG)로 구성된 13 μL 반응 믹스를 설정합니다. 5 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품어 다음 일분 얼음에 놓습니다. 그 후, 역전사 효소 1 ㎕를, 5 배 가닥 합성 완충액 4 ㎕를 0.1 M 디티 오 트레이 톨 1 μL, 반응 혼합물에의 RNase 억제제 1 μL를 추가한다. 50 ° C 및 inactiv 60 분이어서 25 ℃에서 추가로 5 분 동안 튜브를 부화15 분 동안 70 ° C로 가열하여 반응을 먹었다. </li><li> qPCR에가 2 배 녹색 염료 슈퍼 믹스의 12.5 μl를 포함하는 DNA 중합 효소와 Zika 바이러스 [용 Zika 바이러스 범 유전자형 프라이머 (특정 10 mM의 각각의 프라이머 1 μL와 결과의 cDNA 1 μl를 사용하여 수행 : 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; ; 반전 : 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), Zika 바이러스 아시아 유전자형 PRVABC59 균주 프라이머 (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; 반전 : 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], 또는 C 형 간염 바이러스 (JFH RTQ F : 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3, JFH RTQ R : 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;), 또는를 들어 휴대 하우스 키핑 유전자 GAPDH (: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; 계 : 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;) 25 μL 반응 볼륨입니다. </li><li> 실행 조건 15 초 동안 95 ° C 및 실시간 PCR 시스템에서 30 초 (40 회) 60 ° C를 사용하여 PCR을 수행합니다. </li><li> 는 Z 정상화 사이클 임계 값에 기초하여 (CT)의 값을 GAPDH의 발현 수준을 사용IKA 바이러스 게놈 측정. GAPDH에 비해 Zika 게놈 델타 코네티컷 (ΔCT) 값을 계산하고이 값을 ΔCT 얻었다. 그리고, 표시된 시점에서 감염과 감염되지 않은 세포 사이의 정규화 Zika 게놈 내용물의 비율을 고려하여 스크롤 변화를 계산한다. ZIKV 게놈 복제 결과를 그림 4를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 메탄올 고정 된 세포를 사용하여 ICC를 수행합니다. <ol><li> (PBS에서 0.1 % 트리톤-× 100, 3 % 염소 혈청, 3 % BSA) 1X PBS로 고정 셀을 세 번 씻고 ICC 차단 버퍼 차단합니다. </li><li> 버퍼를 차단 100 4 ℃에서 밤새 품어 : 1의 희석에 마우스 단일 클론 항 dsRNA를 항체 J2 (1 μg의 / ㎖)를 사용합니다. </li><li> 1X PBS로 세포를 세척하고, 1 차 항체를 염소 항 - 마우스 IgG-594 (1 μg의 / ㎖)을 추가 블로킹 완충액 1000 희석하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 훽스트 (Hoechst) 염료를 사용하여 핵에 대한 1X PBS와 얼룩 세포를 씻고100X 배율 형광 현미경 (도 4)를 사용하여 세포를 관찰한다. </li></ol></li></ol> Zika 바이러스 감염에 대해 사이토 카인 라이브러리를 스크리닝 (5) <ol><li> 웰 12 웰 플레이트를 사용하는 당 1 × 105 세포에서 순 베로 세포 종자. 세포가 (6 시간 후 - 시드)에 부착되면, 생물 중복에 표시된 농도 (2 ml의 볼륨 / 웰)에서 각각의 사이토 카인을 추가합니다. 차량 (PBS) 혼자 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 12 시간 후 처리에서, Zika 바이러스 감염 (물론 당 0.1 400 μL의 MOI)를 수행합니다. 감염 (모의)없이 부정적인 제어 우물을 포함합니다. </li><li> 4 시간 게시물 감염에서, 사이토 카인 처리 된 미디어 (2 ㎖)와 함께 바이러스 접종을 교체합니다. 추가로 44 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 48 시간 게시물 감염에서, 위상차 현미경을 사용하여 바이러스 성 플라크를 계산하고 40X 배율 (그림 5)에 감염된 세포의 대표 이미지를 수집. </li></ol>

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여기에, 시험 관내에서 Zika 바이러스를 배양하기위한 간소화 된 프로토콜이 제공됩니다. 바이러스 배양을 확장 역가를 측정하고, 제공 한 게놈 복제를 정량화하기위한 최적의 엔드 포인트를 식별하는 단계를 포함하여 긴급. Zika 바이러스 감염 인자를 처리하는 동안, 바이오 안전성 절차를 엄격하게 따라야한다, 인간 병원체이기 때문에. 원숭이 신장 세포주 베로은 다양한 바이러스 학적 분석을 보여주는 사용 하였다. Zika 바이러스 복제의 반응 속도는 다양한 조직과 종의 세포에서 다를 수 있습니다. 이전 15 바와 같이 추가의 세포주가 사용될 수있다. Zika 바이러스 감염된 태아 (3)의 뇌 조직에서 분리 된 피질 신경 전구 세포를 감염 14 밝혀졌다. 따라서, 신경 세포 ZIKV 감염 병리학을 평가하는 추가 셀 고유 통찰력을 제공 할 수있다. 아프리카와 아시아 유전자형의 neurovirulent 표현형의 차이를 조사 할 수있다이 감염 배...

Zika 바이러스 (ZIKV)는 소두증와 가난한 임신 1,4를 성과와 관련된 중요한 인간 병원체이다. ZIKV는 같은 뎅기열, 웨스트 나일, 세인트 루이스 뇌염 바이러스와 같은 신경 학적 결함을 일으킬 수 의학적으로 관련 플라 비 바이러스의 집합에 속한다. 바이러스 전송의 주요 모드뿐만 아니라, 성적 전송은 5,6를보고되었습니다, 모기 벡터 Aedes aegypti에 의해, 그리고. ZIKV 인해 모기 벡터의 확대 지리적 분포 및 출생 결함과의 강한 상관 관계에 주요 글로벌 건강 문제가되고있다. ZIKV 먼저 Zika 숲에서 감시 붉은 털 원숭이에서 1947 년 고립 된, 우간다 및 제 인간의 경우는 1952 7,8보고되었다. 발열, 발진, 두통, 결막염, 근육 / 관절 통증 등의 가벼운 증상에 존재 ZIKV에 감염 될 개인. 감염된 임산부는 태아 1 ZIKV를 전송할 수 있습니다. 지IKV 감염은 길랑 바레 증후군, 말초 신경의자가 면역 탈수 초 질환 (9)에 연결되어있다. Zika 바이러스 게놈의 길이는 약 10.8 킬로베이스이고 긍정적 인 의미, 단일 가닥 RNA 분자로 구성되어 있습니다. 게놈의 구조는 단백질 코딩 영역을 측면 비 코딩 영역 (NCR)와, 5&#39;NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A - NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3&#39;NCR로 구성되어 있습니다 6. 하나의 폴리 프로테인 (3419 AA)는 그 공동 및 사후 병진 (10) 작은 펩타이드로 분해입니다 번역됩니다. 5&#39;NCR 및 3&#39;NCR RNA 줄기 루프 구조는 모두 바이러스 게놈 번역 및 복제의 개시에 중요한 역할을한다. 게놈의 구조적 성분은 캡시드, 막 및 외피 단백질로 구성된다. 비 구조 단백질은 게놈 복제를 위해 중요하다. 현재 Zika 바이러스 균주는 세 가지 주요 유전자형으로 분류된다 : 서 아프리카, 동 아프리카, 아시아 6,10-13. 그것은이 제안되어있다가 나중에 추가로 12 진화 서부 아프리카와 아시아에 확산 동부 아프리카 혈통. 아시아 유전자형은 미국에서 현재 발생에 대한 책임이 있습니다. Zika 바이러스는 모기와 포유 동물 세포 모두에서 배양 할 수있다. 기본 피부 섬유 아세포, 미성숙 수지상 세포, 대뇌 피질의 신경 전구 세포와 베로 세포 Zika 10,14,15 바이러스 감염에 취약하다. 모두 유형 I 및 유형 II 인터페론 피부 섬유 아세포 (15) ZIKV 성장을 제한하는 것으로 나타났다. 이 연구의 목적은 포유 동물 세포 배양 시스템에서 생산 및 아시아 유전자형 ZIKA 바이러스 스트레인 PRVABC59의 시금위한 단계별 상세한 프로토콜을 제공하고 약물 개발 플랫폼으로 이러한 감염 배양 시스템의 유용성을 입증한다. 이 자원은 크게 더 난을 규명 할 수있는 Zika 바이러스 및 신경 학적 연구 커뮤니티에 혜택을 가능성이있다바이러스의 발병 기전과 바이러스 독성의 진화의 TS 메커니즘.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 변형 된 독수리' s 매체 (DMEM)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 스테인 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>백작 부인 &ndash; 자동 세포 계수기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>백작 세포 계수&nbsp; 챔버 슬라이드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항dsRNA 항체 J2&nbsp;</td><td>영어 & 과학 컨설팅 Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>염소 안티-토끼 IgG Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td><td>Life Technologies</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Real-Time PCR 시스템</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Cell Line&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>지카 바이러스 균주 PRVABC59</td><td>Centers for Disease Control and Prevention (CDC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 알파&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>페프로텍</td><td>200-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-알파</td><td>페프로텍</td><td>300-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>인터페론 알파 A&nbsp; &nbsp;</td><td>R & D Systems</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>인터페론 베타</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>인터페론 감마</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti 면역형광 현미경 Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>Nikon</td><td>방문 Nikon 요청</td><td></td></tr></tbody></table>

zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika 바이러스 (ZIKV)는 같은 소두증, 눈 결함 및 손상 성장으로 태아의 발달 이상에 연결되어 신흥 병원균이다. ZIKV는 플라 비비 리다 가족의 RNA 바이러스이다. ZIKV 주로 모기 전송뿐만 아니라 태아 수직 전송뿐만 아니라 성적 접촉을 모체로 확산 될 수있다. 현재까지 바이러스에 감염된 사람들을 보호하기 위해 가능한 신뢰할 수있는 치료 또는 예방 접종 옵션이 없습니다. 재현 효과 Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템의 개발 ZIKV 복제뿐만 아니라 약물과 백신 개발의 분자 메커니즘을 연구하는데 중요하다. 이와 관련하여, 바이러스의 생산 및 성장 분석을 위해 포유 동물 세포 기반 체외 Zika 바이러스 배양 시스템을 설명하기위한 프로토콜은 여기에보고된다. 바이러스 역가를 측정하는 세포 단층과 상패 분석​​에 Zika 바이러스에 의한 플라크의 형성에 대한 세부 사항이 표시됩니다. 바이러스 게놈 복제 속도론및 이중 가닥 RNA 게놈 replicatory 중간체가 결정된다. 이 문화 플랫폼은 인터페론 α (IFN-α)의 식별 결과 사이토 카인의 작은 세트의 라이브러리에 대해 화면으로 사용하고, IFN-β와 Zika 바이러스 성장의 강력한 억제제로 IFN-γ. 요약하면, 시험 관내 감염 Zika 바이러스 배양 시스템 및 각종 바이러스 학적 분석은 크게 더 바이러스 발병의 메커니즘과 바이러스 독성의 진화를 해명의 연구 커뮤니티에 도움이 할 수있는 잠재력을 가지고 본 연구에서 입증된다. 바이러스 IFN 알파는 또한 감염된 임산부 포함 고위험 인구 Zika 바이러스 감염에 대한 예방제, 노광 후 예방 및 치료 방법으로 평가 될 수있다.

Zika 바이러스 변형, 아시아 유전자형 (PRVABC59 GenBank 액 번호 KU501215)은이 연구 (12)에 이용되었다. 80 % 컨 플루 언시 베로 세포는 새로이 Zika 바이러스 감염을 연구에 사용 하였다. 바이러스 생산과 바이러스 학적 특성화 이후, 초기 통로 (P3) Zika 바이러스를 사용 하였다. 바이러스 플라크를 감염 둘째 날에 관찰되었다. 초기에 감염된 세포로부터 방출 Zika 바이러스 자손은 단층 배양 (도 2)에 보이는 플라크의 형성을 초래할 인접 세포로 확산 할 수있다. Zika 바이러스 감염의 세포 변성 효과 (CPE)는 같은 라운딩 및 분리 세포뿐만 아니라 용균 세포 사멸 등의 형태 학적 변화에 의해 특징입니다. 바이러스 역가를 측정하기 위해, T-160 플라스...

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

본 연구의 전반적인 목표는 지카 바이러스의 복제를 연구하고, 약물 개발을 위한 인비트로(in vitro) 플랫폼으로 활용하기 위해 포유류 세포 기반의 인비트로 지카 바이러스 감염 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 지카 바이러스 감염 세포 배양 시스템에 관한 이 단계별 상세 프로토콜은 지카 바이러스가 매개하는 질병의 발병 기전과 바이러스 병원성의 진화를 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 약물 및 백신 개발을 위해 지카 바이러스를 대량으로 생산할 수 있다는 점입니다.T75 배양 플라스크에서 세포 밀도가 80%에 도달한 Vero 세포를 수확하는 것으로 시작합니다. 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거하고 2 mL의 인산염 완충 식염수로 세포를 헹굽니다. 0.25% trypsin 2 mL를 첨가하고 플라스크를 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 후, 혈청이 포함된 성장 배지 8 mL를 첨가하여 trypsin을 불활성화합니다. 그런 다음, 세포를 15 mL 튜브로 옮깁니다. 이어서, 세포 10 µL를 취해 동일한 양의 0.4% trypan blue와 혼합합니다. 준비된 혼합물을 세포 계수 챔버 슬라이드에 로딩하고 자동 세포 계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정합니다. 총 7,000,000개의 세포를 30 mL 부피의 T160 플라스크에 분주합니다. 다음 날, 플라스크당 10 mL의 무혈청 배지에 적절한 감염 다중도(MOI)의 Zika virus 접종액을 준비합니다.감염 확산을 방지하기 위해 바이러스를 안전하게 취급하는 것이 매우 중요합니다.T160 플라스크에서 사용한 배지를 제거한 후, 새로 조제한 바이러스 접종액 10 milliliters를 모두 첨가합니다. 접종된 플라스크를 37 degrees Celsius, 5%CO2 조건에서 4~6시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 매시간 플라스크를 옆으로 부드럽게 기울여 접종액을 도포합니다. 배양이 완료되면 접종액을 따뜻한 혈청 보충 성장 배지 30 milliliters로 교체합니다. 그 후, 바이러스 배양을 향후 96시간 동안 계속합니다. 4일 후, 위상차 현미경을 사용하여 세포 단층에 형성된 바이러스 플라크의 외형을 관찰함으로써 감염 진행 상태를 확인합니다. 필요에 따라 40x 및 200x 배율로 이미지를 촬영합니다.96시간 시점에서 세포 배양 상층액을 수집하고, 4°C에서 300 ×g로 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 원심분리 후, 침전된 파편이 섞이지 않도록 상층액을 조심스럽게 제거하여 15 mL 튜브로 옮깁니다.바이러스 배양 상층액을 여러 개의 분주액으로 나누어 -80 °C에서 보관하십시오.바이러스 역가를 측정하려면, 먼저 나이브 Vero 세포를 12-웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁵ cells의 밀도로 2 mL 부피로 분주합니다. 다음 날, 무혈청 배지를 사용하여 T160 플라스크에서 수집한 바이러스 배양 상층액의 10배 단계 희석액을 준비합니다.역가 측정을 위한 바이러스 배양 상층액의 단계 희석액을 준비할 때, 감염을 방지하기 위해 바이러스를 안전하게 취급하십시오.다음으로, Vero 세포가 포함된 12-well 플레이트의 각 웰에서 배양액을 제거하고, 희석된 접종액 400 µL를 Vero 세포에 3반복으로 첨가합니다. 접종된 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 4~6시간 동안 배양합니다.배양이 끝나면, 웰당 2 mL의 혈청 보충 배지로 접종물을 교체합니다. 접종 48시간 후, 위상차 현미경을 사용하여 적절한 희석 배수에서 바이러스 포커스를 계수합니다. 바이러스 역가를 mL당 플라크 형성 단위(plaque-forming units per milliliter)로 계산합니다.12-웰 플레이트에 Vero 세포를 고농도 및 저농도의 지카 바이러스로 접종하고 48시간 및 96시간 동안 배양한 후, 지카 바이러스 게놈의 발현에 대한 정량적 PCR과 이중 가닥 RNA에 대한 면역세포화학법을 통해 게놈 복제를 평가합니다.면역세포화학 염색을 위해, 12-well 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 각 웰에 methanol 1 mL를 추가합니다. 세포를 4 °C에서 30분 동안 고정합니다. 그다음, 고정된 세포를 1x PBS로 3회 세척합니다. 그런 다음 blocking buffer를 추가하고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. mouse monoclonal anti-double-stranded RNA antibody J2를 blocking buffer에 1:100으로 희석하여 세포에 추가하고, 이 용액에서 세포를 4 °C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, goat anti-mouse IgG-594 secondary antibody를 blocking buffer에 1:1,000으로 희석하고, 세포를 1x PBS로 세척한 후 이를 세포에 추가하여 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 세포를 1x PBS로 세척한 후 Hoechst 염료를 사용하여 핵을 염색하고, 형광 현미경의 100배 배율로 세포를 관찰합니다.이전과 동일하게 naive Vero 세포를 12-well 플레이트에 분주한 후 6시간이 지나면, 지시된 농도의 표적 사이토카인을 생물학적 반복구(biological duplicates)로 첨가합니다. 처리 12시간 후에 지카 바이러스를 감염시키며, 감염시키지 않은 음성 대조군 well을 포함합니다. 감염 4시간 후, 바이러스 접종액을 사이토카인 처리된 배지로 교체한 다음 세포를 37 °C에서 44시간 동안 추가로 배양합니다. 감염 48시간 후에 위상차 현미경을 사용하여 바이러스 플라크 수를 측정하고, 감염된 세포의 대표 이미지를 40배 배율로 획득합니다.이 그래프는 RT-qPCR로 측정한 지카 바이러스(Zika virus)의 게놈 함량을 보여줍니다. Pan 유전형 프라이머와 PRVABC-59 균주 프라이머 모두 동일한 민감도와 특이도를 나타냈습니다. 예상대로, C형 간염 바이러스 프라이머에서는 어떠한 산물도 증폭되지 않았습니다.비감염 모의 대조군과 비교하여, 저농도 및 고농도로 감염된 세포에서 표시된 시간대별 Zika 바이러스의 성장 역학이 여기에 나타나 있습니다. 면역세포화학 분석 결과, 감염 후 48시간에는 감염된 세포가 소수의 클러스터를 형성하고 있는 반면, 감염 후 96시간에는 대부분의 세포가 감염되었음을 보여줍니다. 이 그래프는 용매 대조군과 비교하여 다양한 사이토카인에 의한 Zika 바이러스 성장 조절을 보여줍니다.이 위상차 현미경 이미지들은 사이토카인 처리 여부에 따른 지카 바이러스 감염 세포들을 보여줍니다. 감염된 세포들에 의해 형성된 바이러스 플라크는 초점으로 관찰할 수 있습니다. 인터페론을 처리한 웰에는 바이러스 플라크가 생성되지 않았음에 유의하십시오.본 절차 이후에는 모기 및 인간 세포 내 바이러스 단백질의 위치와 복제를 위한 지카 바이러스 고해상도 도메인 매핑과 같은 다른 방법들을 수행하여, 질병 발병 기전의 규명 및 바이러스 독성의 진화와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 지카 바이러스 복제를 연구하기 위한 포유류 세포 기반의 인 비트로(in vitro) 지카 바이러스 감염 배양 시스템을 구축하는 방법과, 약물 및 백신 개발을 위한 인 비트로 플랫폼의 활용 방안에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 지카 바이러스 회복기 혈청을 사용하여 뎅기열 바이러스 감염의 항체 의존성 향상(ADE)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 뎅기열 리포터 바이러스 입자(RVP)를 사용합니다. 지카 바이러스에 대한 혈청 항체는 RVP와 교차 반응하여 복합체를 형성합니다. 결합된 항체는 Fc 수용체를 발현하는 세포의 RVP 흡수를 향상시키며, 이는 유세포 분석을 사용하여 검출됩니다.

바이러스 감염의 항체 의존성 증진을 조사하기 위한 In vitro assay

이 비디오는 인간 병원체인 지카 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 숙주 세포 내에서 지카 바이러스는 내재화 시 증식을 거쳐 주변 세포를 감염시키고 뚜렷한 영역 또는 바이러스 플라크를 생성합니다. 항바이러스제 역할을 하는 I형 인터페론은 바이러스 증식을 방해하여 숙주 세포 단층에서 바이러스 플라크의 형성을 방지합니다.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

이 비디오는 인간 태아의 신경 줄기 세포를 지카 바이러스에 감염시키는 절차를 보여줍니다. 감염된 세포는 추가 연구에 사용할 수 있습니다.

태아 신경 줄기 세포의 지카 바이러스 감염

이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

Zika 바이러스 유도 신경 장애 Intracerebral 주입 전략을 사용 하 여 마우스 모델을 수립: 배아, 신생아, 및 성인

이 문서는 문화, 다양 한 신경 하위와 이다, Zika 바이러스 감염 연구 신경 줄기 세포의 사용에 대 한 강조와 함께 그들을 차별화 하는 방법에 있는 인간적 인 태아 두뇌 신경 줄기 세포를 확장 하는 데 사용 되는 방법을 자세히 설명 합니다.

Immunocytochemical 분석에 대 한 교양된 인간 태아 뇌 신경 줄기 세포의 Zika 바이러스 감염

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

이 작품에서, 우리는 높은 처리량 선별 형식으로 Zika 바이러스 복제의 억제제를 선별하기 위하여 보충 기지를 둔 바이러스성 효소 기지를 둔 분석에서 이용된 프로토콜을 기술합니다.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

여기에서는 인간 세포에서 지카 바이러스 감염 및 복제를 실시간으로 연구하는 매우 쉽고 간단한 방법으로 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, CEI 분석은 항 바이러스 화합물의 평가에 유용합니다.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

배우세요 Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템을 Vero 세포를 사용하여 체외에서 바이러스 복제와 병원성 메커니즘을 연구하는 방법. 이 기술은 대규모 바이러스 생산과 백신 및 치료제 개발에 필수적인 도구입니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과

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