마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

본 실험 프로토콜의 전체적인 목표는 온전한 Langendorff 관류 심장 또는 분리된 심방 표본으로부터 생쥐의 동방결절에 대한 광학 매핑을 수행하는 것입니다. 이 방법은 페이스메이커 이상, 동결절 기능부전 증후군 및 이와 관련된 다양한 질환성 심방 부정맥의 메커니즘에 관한 동방결절의 전기생리학 및 병태생리학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 높은 공간 및 시간 해상도로 온전한 조직 내의 여러 매개변수를 조사할 수 있다는 점입니다.

발가락 꼬집기 시험을 통해 적절한 마취 수준을 확인한 후, 5.5 inch 곡선형 Mayo 가위와 5.5 inch Kelly 지혈 집게를 사용하여 흉부 앞면에 1 cm 절개를 가합니다. 4 inch 곡선형 Iris 집게를 사용하여 폐 조직을 빠르게 잡고, 4/3 inch Iris 가위로 폐, 흉선, 심장을 심낭과 함께 함께 절제합니다. 산소화된 37 °C 변형 Tyrode 용액으로 조직을 세척합니다.

그 후, 곡선형 3인치 Vannas Tubingen 가위와 4/3인치 5번 포셉을 사용하여 심장에서 폐, 흉선 및 지방 조직을 제거합니다. 다음으로, 맞춤 제작된 21 gauge 캐뉼라와 두 개의 곡선형 4.3인치 5번 B 포셉을 사용하여 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고, 관상동맥 순환의 폐쇄를 방지하기 위해 관내 11 µm 나일론 필터를 통해 37 °C Tyrode 용액을 심장에 동시에 관류 및 표면 세척합니다. 그런 다음, 3방향 스톱콕을 통해 관류 라인의 Luer lock에 압력 트랜스듀서를 연결하여 대동맥압을 모니터링하며, 필요에 따라 대동맥압이 60 내지 80 mmHg로 유지되도록 관류 속도를 조절합니다.

Langendorff 관류 심장의 동방결절 광학 매핑을 위해, 장기를 유리 조직 기관 배양 챔버에 후면이 위를 향하도록 수평으로 배치하고, 실험 중 흐름으로 인한 움직임을 방지하기 위해 0.1 millimeter 직경의 핀을 사용하여 심실 정점을 챔버의 실리콘 코팅 바닥에 고정합니다. 폐정맥, 좌심방 및 승모판을 통해 좌심실로 작은 실리콘 튜브를 삽입하고, 40 silk 봉합사를 사용하여 튜브를 주변 결합 조직에 고정합니다. 다음으로, 다른 40 silk 봉합사를 사용하여 상대정맥과 하대정맥을 올가미 형태로 묶고, 우심방이의 가장자리를 챔버 바닥에 핀으로 고정합니다.

봉합사의 반대쪽 끝을 당겨 챔버 바닥에 고정하고, 맞춤 제작된 페이싱 전극을 우심방이 가장자리에 배치합니다. 그런 다음, 우심실과 좌심실의 기저부 근처에 두 개의 12 millimeter 바늘 단극 심전도 전극을 배치하고, 심실 첨단 근처에 접지 심전도 전극을 배치합니다. 조직을 염색하려면, 희석된 염료를 관상동맥 관류 라인의 인라인 관류 포트에 주입하여 5분에서 7분 동안 전달합니다.

20분간의 안정화 후, 37 °C의 blebbistatin 0.5 mL를 관류액에 첨가하고, 이어서 인라인 Luer lock 주입 포트를 사용하여 37 °C Tyrode 용액 1 mL에 희석한 blebbistatin 0.1 mL를 관상동맥 관류 라인에 5~7분에 걸쳐 주입합니다. Blebbistatin은 주의해서 사용해야 합니다. 억제제의 침전을 방지하려면, 먼저 blebbistatin을 37 °C로 가온하여 투명해진 배지에 용해시킨 후 혼합물을 격렬하게 교반하십시오.

샘플을 광학적으로 매핑하려면, 먼저 진동하는 용액으로 인한 움직임 아티팩트를 줄이기 위해 조직 위의 용액 표면에 작은 커버 글라스를 고정합니다. 그런 다음 정전류, 저소음 할로겐 램프에서 제공되는 들뜸 광원이 연결된 유연한 분기 광섬유 가이드를 사용하여 필터링된 광선을 조직에 조사하고, 결과로 나타나는 형광 신호를 이미징합니다. 앞서 시연한 대로 심장에 캐뉼라를 삽입한 후, 심실을 앞쪽에서 분리하고, 삼첨판 상대정맥 축을 따라 삼첨판을 통해 우심방을 연 뒤, crista terminalis의 내측 분지를 통해 절개합니다.

전심방 자유벽을 개방하려면 내측 지절 절개선의 중앙선부터 우심방이의 우측 하단 모서리까지 절개한 후, 평평하게 편 심방 자유벽을 실리콘 코팅 챔버 바닥에 핀으로 고정합니다. 좌심방이를 개방하려면 좌심방이의 승모판 상단 모서리를 따라 승모판을 절개합니다. 그 다음, 앞서 우심방에 수행한 것과 동일한 방식으로 개방된 좌심방을 핀으로 고정합니다.

그 다음 심실 조직의 일부를 제거합니다. 심방의 손상을 방지하기 위해 표본을 고정할 수 있는 심실 조직의 테두리를 남겨두고, 조직을 Sylgard 코팅된 챔버 바닥에 핀으로 고정합니다. 이제 실리콘 코팅된 챔버 바닥에서 최종 표본을 약 0.5 millimeters 정도 들어 올려 심외막과 심내막 표면 모두에서 관류가 가능하게 한 후, 37 degree Celsius Tyrode 용액으로 시료를 관류합니다.

그런 다음 맞춤 제작된 페이싱 염화은 전극을 절개된 우심방 부속기의 가장자리에 배치합니다. 우심방 및 좌심방 부속기 근처에 각각 12 millimeter 바늘 단극 심전도 전극을 하나씩 배치하고, 심방-심실 접합부 근처에 접지 심전도 전극을 배치합니다. 심장 조직을 염색하려면 1 millimeter 피펫을 사용하여 37 °C Tyrode 용액에 희석된 전압 민감성 염료를 조직 위에 직접 천천히 분사합니다.

그 다음, 희석된 blebbistatin을 조직에 직접 도포하여 샘플을 고정시킨 후, 관류액을 통해 blebbistatin 0.5 mL를 추가로 투여하고 앞서 시연한 것과 같이 샘플의 광학 매핑을 수행합니다. 조직 염색 및 blebbistatin 억제 단계는 정확한 구현과 정밀한 염색 절차가 요구되는 매우 중요한 과정이며, 이는 심박수, 주 페이스메이커(leading pacemaker)의 위치, 심방 전도와 같은 심방 생리학적 파라미터에 영향을 주지 않기 위함입니다. 여기 Langendorff 관류를 거친 마우스 심장의 자발적 동결절 리듬(spontaneous sinus rhythm)에 대해 재구성된 전형적인 우심방 활성화 윤곽 지도와, 각각 1 및 0.5 ms 샘플링 속도로 획득한 두 개의 해당 우심방 윤곽 지도가 제시되어 있습니다.

초기 활성화 지점은 동방결절이 해부학적으로 정의되는 상대정맥 인근의 정맥간 영역 내에 위치합니다. 본 실험에서는 우심방 부속기를 10 내지 12 Hertz로 최소 1분 동안 페이싱한 후 전기 자극을 중단하였으며, 마지막으로 포착된 활동 전위와 첫 번째 자발적 활동 전위 사이의 시간 간격으로 동방결절 회복 시간을 계산하였습니다. 자발적 동리듬 동안 분리된 심방 표본의 활성화를 통해 주 페이스메이커 위치의 정확한 영역을 식별할 수 있습니다.

수술 및 염료 로딩 절차를 적절히 수행한다면, 심방의 생리학적 특성에는 유의미한 변화가 관찰되지 않아야 합니다. 동맥 염색은 더 많은 양의 염료가 필요할 수 있지만, 관상동맥 염색 후의 신호 강도 감쇠 시간이 표면 염색 후보다 거의 두 배 더 길기 때문에 이 로딩 방법을 통한 동방결절 영역 조직의 형광 신호가 더 안정적인 것으로 나타납니다. 이 기술에 숙달되면, 적절히 수행했을 때 30~40분 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 심방 조직과 동결절의 손상을 방지하기 위해 절개 전 심방의 해부학적 구조를 정확히 확인하십시오. 본 절차 이후에는 전위차 막전위 특성에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 기존의 유리 승모판 전극 기록과 같은 다른 측정 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경생리학 분야의 연구자들은 심장의 동방결절 기능 부전을 포함한 심방 부정맥을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.

이 영상을 시청한 후, 마우스 동결절 준비물의 고해상도 광학 매핑을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.