Name: 마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 학습하세요 마우스 심방결절의 고해상도 광학 매핑 방법을 Langendorff 관류 심장을 이용하여 전기생리학적 이상과 부정맥 메커니즘을 연구하는 기술입니다.

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모든 실험은 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소 (NIH 출판. 번호 80-23)에 따라 실시 하였다. 이 연구에 사용 된 모든 방법과 프로토콜 NIH에 의해 출판 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침은 다음 위스콘신 동물 관리 및 사용 프로토콜위원회의 대학에 의해 승인 된 (발행 번호 85-23를, 1996 년 개정). 본 연구에 사용 된 모든 동물 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수 인도적인 치료를 받았다. 1. 심장 제거 및 랑겐 돌프 관류 <ol><li> 심장 차단, 수조와 물 재킷을 사용하여 37 ° C 따뜻한 타이로드 용액에 앞서. </li><li> 5 % 이소 플루 란 / 95 % O 2 마우스를 마취. </li><li> 고통 반사의 손실을 확인하여 마취의 적절한 수준을 확인합니다. </li><li> 개흉술을 수행합니다. 곡선 5.5 &quot;메이요 가위 5.5&quot;켈리 지혈 용을 사용하여 가슴을 열고CEPS는 흉부의 전면에 잘라 1cm를 확인합니다. <ol><li> 신속하게 (30 초 이내) 가슴에서 심장의 압축을 풉니 다. &quot;폐 조직을 잡아 4.3 사용하여 심낭과 함께 폐, 흉선, 심장을 잘라 곡선 아이리스 집게 &#39;아이리스 가위 (4)를 사용합니다. 직접 마음을 잡아하지 마십시오. </li><li> 산소 (95 % O 2 / 5 % CO 2)에 씻어, 일정한 온도 (36.8 ± 0.4 ° C)의 타이로드의 솔루션을 수정했습니다. (MM)에서 다음과 용액 조성물을 사용하여 128.2 염화나트륨 4.7의 KCl을 1.19의 NaH 2 PO 4, 1.05의 MgCl 2 1.3 CaCl2를 20.0의 NaHCO3 및 글루코오스 11.1 (pH를 7.35 ± 0.05). </li></ol></li><li> 동일한 솔루션에 목욕하는 동안, 폐, 흉선, 지방 조직을 식별합니다. 조심스럽게 마음을 해부하다. 3 &quot;Vannas - 튀빙겐 가위 4.3&quot;# 5 집게 곡선 사용합니다. </li><li> 그런 다음 대동맥을 확인하고 주문 제작 21 G 정맥에 그것을 cannulate. 이 곡선 4.3 &quot;#의 5B의 힘을 사용하여추신. </li><li> 삽관 한 후 동시에 관류 (~ 50 ml / 분의 유속으로 목욕) (~ 5 ㎖ / 분의 유량에서의 캐뉼라를 통해가 대동맥 압력에 기초하여 조정되어야하며, 아래 참조) superfuse 전체 실험을 통해 예열 여과 타이로드 용액으로 마음입니다. 관상 동맥의 폐색을 방지하기 위해 인 - 라인 11 ㎛의 나일론 필터를 통해 관류 액이 통과한다. </li><li> 관류 라인에 3 방향 스톱 콕 루어 잠금 장치를 통해 연결된 압력 변환기 (또는 압력 게이지)를 사용하여 동맥압을 모니터 (60) 및 80 mmHg의 사이에 유지한다. 이 범위 내에서 대동맥 압력을 유지하기 위해 필요한 경우 관류 속도를 조정합니다. </li></ol> 랑겐 돌프 - 관류 항목의 심장에서 SAN 2. 광학 매핑 <ol><li> 수단 <ol><li> 수평으로 중심을두고 P 0.1 mm 직경의 핀을 이용하여 상기 챔버의 실리콘 코팅 아래쪽 심실 에이펙스 핀하지 못하 스트림에 의한 실험 기간 동안 운동을. (12) </li><li> 폐정맥을 통해 좌심실 (LV)에 작은 (0.012 &quot;(내경) x 0.005&quot;) 실리콘 튜브를 삽입, 왼쪽 심방 (LA)과 승모판 막 (MV). 사운 딩 결합 조직에 실크 봉합사 (4-0)에 의해 튜브를 고정합니다. </li><li> 그 후방 측 (그림 1A, 왼쪽 패널)를 향하도록 마음을 놓습니다. </li><li> 0.1 mm 직경 minutien 핀을 이용하여 상기 챔버의 실리콘 바닥까지 RA 부속기 (RAA)의 가장자리에 핀. 적경 평면의 후방 표면을하고 카메라의 초점면에 위치 할 수 있도록하기 위해 자사의 레벨을 조정합니다. 이는 심방의 최대 표면적 광학 측정을 가능하게 할 것이다. </li><li> 실크 봉합사 (4-0)에 의해 올가미 우수 (SVC) 및 하부 (IVC) 대정맥, 스트레칭과 실리콘 코팅 챔버 (그림 3A 참조)의 바닥에 봉합사의 다른 쪽 끝을 고정. 봉합사는 차단하지 않습니다 확인보기의 광학 분야. </li><li> RAA의 가장자리에 맞춤 페이싱 전극을 배치합니다. 전극하려면 사용 실리콘 0.5 mm 전극 간 거리, 0.25 mm 직경은 와이어를 코팅하고 조율 끝에 1mm의 길이에 대한 실리콘의 결여. 그런 다음 두 개의 ECG 12mm 바늘 (29 게이지) 좌우 심실의 기지 근처 모노 폴라 전극을 배치합니다. 심실의 정점 근처의 땅 ECG 전극을 배치합니다. </li></ol></li><li> 더럽히는 것 <ol><li> 형광 염료 및 전기 기계 uncoupler의 blebbistatin 모두 빛에 민감한 때문에, 어두운 방에서 아래에 설명 된 모든 절차를 수행합니다. 먼저 디메틸 설폭 시드 (2.5 mM)을 분액으로의 스톡 용액, 1.25 ㎎ / ㎖로 (30 μL를 각각) 전압 감응 염료 RH-237 또는 디 -4- ANNEPS을 준비하고 -20 ℃에서 분취 량을 저장한다. </li><li> 가온 (37 ° C) 타이로드 용액 1 ml의 염료 원액 5-10 μL 희석하고 관상 동맥 관류 라인에 주입인라인 루어 주입 포트를 사용하여 5-7 분에 걸쳐. </li><li> 사전에 원액 (디메틸 설폭 사이드 2 ㎎ / ㎖, 6.8 밀리미터)로 blebbistatin 준비하고 4 ℃에서 보관합니다. </li><li> 안정화의 20 분 후, 관류 액의 가온 0.5 ㎖ (37 ° C)를 추가하고 blebbistatin 가온 (37 ° C) 타이로드 용액 1 ㎖에 blebbistatin 0.1 mL로 희석. 이어서 인라인 루어 주입 포트를 사용하여 5-7 분에 걸쳐 관상 동맥 관류 라인에 주입. </li></ol></li></ol> 격리 된 심방 준비에서 SAN 3. 광학 매핑 <ol><li> 수단 <ol><li> 격리 된 심방 준비, 분리 및 전체 심장 준비 단계 1.1-1.5에서 상술 한 바와 같이 마음을 cannulate. </li><li> 멀리 전방 측면에서 심실을 해부하다. 그림 1A, 오른쪽 패널을 참조, 자세한 내용은 # 1를 잘라. </li><li> 삼첨판 버지니아 통해 절단하여 RA를 엽니 다TV를-SVC 축을 따라 LVE (TV). 그림 1A, 오른쪽 패널을 참조, 자세한 내용은 # 2를 잘라. </li><li> RAA를 엽니 다 crista의 terminalis의 중간 다리를 잘라. 그림 1A, 오른쪽 패널을 참조하십시오, # 3를 잘라. </li><li> 상기 RAA의 오른쪽 하단의 가장자리 위 컷 # 3의 중간 선에서 절단을 수행하여 전방 심방 자유 벽을 열고 평평 실리콘 피복 실의 바닥 심방 자유 벽에 핀. # 4 잘라도 1a에 중공의 화살표 방향 참조. 심방의 손상을 방지하기 위해 제조 피닝 심실 조직의 림 보존. </li><li> 마찬가지로, LA의 부속물 (LAA)의 MV-상단 모서리를 따라 MV 통해 절단에 의해 열린 LA. </li><li> LAA의 중간 림 근처까지 전방 심방 자유 벽을 통해 열린 LAA의 중간에서 잘라 LAA를, 엽니 다. </li><li> 전방 심방 자유 벽 ALO를 엽니 다동일한 방향 겨 후 평탄화 및 실 가드 코팅 챔버의 바닥에 고정. </li><li> 부분적으로 심방 중격 조직을 제거합니다. 이 초점에없는 조직에서 광 신호의 산란을 줄일 수 있습니다. 따라서, LA 및 RA뿐만 아니라 SAN 및 아트 리오 - 심실 접합 (AVJ)는 모두이 준비 (그림 1B)에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 외막과 내막 양면에서 superfusion을 허용하기 위해, 실리콘 코팅 챔버의 바닥으로부터 약 0.5 mm로 최종 제제 올려. </li><li> SVC를 근처에 집중 유량 12 ㎖ / 분 ~ 일정한 속도로 가온 함께 제제 (37 ° C) 타이로드 용액 및 Superfuse ~ 목욕 superfusion 30 ㎖ / 분. </li><li> 해부 RAA의 가장자리에 맞춤 간격의 Ag / AgCl을 2 전극 (0.25 mm 직경)을 놓습니다. 그런 다음 각각 두 개의 ECG 12mm 바늘 (29G)를 RAA 및 LAA 근처 전극 (극성)을 배치합니다. 지상 ECG 차기를 배치AVJ 근처에 탔다. </li></ol></li><li> 더럽히는 것 <ol><li> 전압에 민감한 염료 (RH-237 또는 디 - 4 ANNEPS)의 직접적인 응용 프로그램을 수행합니다. 이를 위해, 가온 (37 ° C) 타이로드 용액 1mm에서 염료 원액 1-2 μL 희석 천천히 1mm 피펫을 사용하여 제제의 표면에 희석 된 염료를 방출. </li><li> 또는, 전체 심장 준비 (단계 2.2.1-2.2.2)에 대한 전술 한 것과 유사한 랑겐 돌프 - 관류 심장의 관상 동맥 재관류를 통해 전압에 민감한 염료와 심방 염색을 수행합니다. <ol><li> 한 바와 같이 관상 동맥 관류 염색 후에 심방 준비 격리. 양호한 형광 레벨에 도달하는 데 필요한 경우 추가적인면 염색을 수행한다. 빠른 심방 분리 염료 표백하지 않고 염색 품질에 영향을 미치지 않는다. </li></ol></li><li> 전기 기계 uncoupler, blebbistatin으로 제조 고정시킨다. 상상력 3-5 μl를 희석가온 (37 ° C) 타이로드 용액 원액 bbistatin 천천히하면 준비의 표면 및 주변 솔루션을 희석 blebbistatin를 놓습니다. blebbistatin는 준비와 염색 동안 빛에 빛에 민감, 13, 14 피할 긴 노출로 표시되어 있기 때문에. </li><li> 수축을 억제하는 데 필요한만큼 추가 blebbistatin 응용 프로그램을 수행합니다. 일반적으로 3 추가 애플리케이션 (각 어플리케이션마다 3-5 μL)까지 정확하게 SAN 심방 활성화를 재구성하기 위해 충분히 동 잡음을 억제 할 수있다. </li><li> 관류에 따뜻하게 blebbistatin의 추가 0.5 ML을 추가합니다. 이 절차를 수행하는 동안, 염료 / blebbistatin는 심방 조직을 염색 할 수 있도록 30 초 동안 superfusion을 일시 중지합니다. </li></ol></li></ol> 4. 광학 매핑 설정 주 :. 광학적 맵핑 시스템의 상세한 설명은 다른 곳에서 제공된다 (12) <ol><li> 투과 전자 현미경과 카메라를 사용하여2000 프레임 / 초 이상, 집광 렌즈의 시리즈의 poral 해상도는 100 μm의 / 화소 이상의 공간 해상도를 달성한다. 이는 SAN 활성화 및 intranodal 전파를 재구성 할 필요가있다. </li><li> 진동 용액으로부터 동 잡음을 감소시키기 위해, 심장 / 절연 심방 제조 위에 상기 용액의 표면에있는 작은 커버 글라스를 고정한다. </li><li> 정전류, 저잡음 할로겐 램프에 의해 제공되는 여기 광 (520 ± 45 nm 파장)를 사용합니다. 가요 갈래 광 가이드를 사용하여 제조 상 여과 광속을 지시. </li><li> 긴 패스 필터 (&gt; 715 ㎚)에 의해 방출 된 형광 필터. 수집, 디지털화 및 카메라 제조업체에서 제공하는 컴퓨터 사용하여 소프트웨어를 획득 한 형광 신호를 저장합니다. </li></ol> 5. 데이터 처리 주 : 광 맵핑 데이터 수집 및 상이한 시점에서의 형광 강도의 행렬로 저장됩니다. 화소 represe특정 시점에서, 티슈 제조의 특정 위치에서 수집 된 형광 강도의 측정치를 NTS. 배경 형광이 자동으로 막 전압 변화에 의해 생성 및 미세 전극 시스템에 의해 측정 된 활동 전위 (APS)에 해당하는 반전 형광 변화를보다 효율적으로 시각화 할 수 있도록 픽셀 당을 제거한다. 영상 분할, 공간 필터링, 시간적 필터링하고, 기준 편차 제거를 포함한 광학 영상 데이터를 처리에서 여러 단계의 상세 포커스 리뷰가 제공된다. (15) <ol><li> 수동 또는 조직의 경계를 결정하기 위해 특정 알고리즘 (예를 들어, 임계 또는 에지 검출) (15)를 이용하여 1 (포함 화소) 0 (제외 픽셀)의 바이너리 마스크를 생성하고 시퀀스의 각 프레임에 마스크를 적용한다. 이 과정은 추가 처리를 위해 관심 영역을 강조 바이너리 이미지를 만듭니다. </li><li> 선택 해제의 신호 대 잡음비를 향상시키기iCal의 데이터는, 상기 선택된 관심 영역 내에서 신호를 필터링. 이를 위해, 예를 들어, 버터 워스, 체비 셰프 유형 및 / 또는 시간 필터링 ((잡음 데이터, × 5 5 예 3 × 3, 원하는 회선 빈 또는 커널에 의해 정의 된 이웃 형광 픽셀, 즉 평균 이상) 공간을 사용 1, 체비 세프 2 형, 타원 등) (그림 2). 데이터를 해석 할 때 염두에 여과에 의한 유물의 가능성을 유지합니다. 자세한 내용은 리뷰를 참조하십시오. (15) </li><li> 필요한 경우 (원래의 신호에 하이 패스 필터링 또는 다항식 피팅을 사용하여) 광 기록에서 기준선의 드리프트를 제거하고 0 (최소 형광) (1) (형광 극대)로부터 화소 신호를 정규화. </li><li> 단일 AP의 전파에 대한 모든 픽셀의 활성화 시간을 포함 시간 윈도우를 선택한다. F는 fluorescen입니다 최대 상향 행정 유도체의 시간 (DF / DT 최대, 각 픽셀에게 그것의 활성화 시간을 할당가전 ​​강도). 모든 화소의 활성화 시간을 사용하여, 활성화 등시 맵을 재구성. 각 아이소 크론 따라서 동시에 활성화 픽셀을 표시합니다. </li><li> 각 픽셀 (재분극, APD (80)의 80 %, 예를 들면) 재분극 특정 레벨에서 동작 시간과 시간 사이의 기간을 계산 들면 AP 기간 (APD) 분산 맵을 재구성한다. 모든 화소 APD 값을 사용하여, APD 분포 등시 맵을 재구성. 각 아이소 크론 따라서 같은 APD와 픽셀을 표시합니다. </li><li> AP의 전파에 대한 전도 속도를 계산하는 5.4에서 계산 된 활성화 시간 데이터에 제제의 표면에 장착한다. 이를 위해, 다항식 피팅 표면 또는 로컬 커널 표면 평활화를 사용하고 장착 표면의 기울기로부터 로컬 전도 속도 벡터를 구한다. </li><li> 재분극 맵을 만들려면 각 픽셀에게 그것의 재분극 시간을 할당, 최대 초 미분으로 정의 (D 2 F / DT2) OAP 또는 90 % 재분극시의 끝에서 광 신호. </li></ol>

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<li>Hansen, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+driven+by+micro-anatomic+intramural+re-entry+revealed+by+simultaneous+sub-epicardial+and+sub-endocardial+optical+mapping+in+explanted+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation driven by micro-anatomic intramural re-entry revealed by simultaneous sub-epicardial and sub-endocardial optical mapping in explanted human hearts.</a> Eur Heart J. 36 (35), 2390-2401 (2015).</li>
<li>Lang, D., Petrov, V., Lou, Q., Osipov, G., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+heart+rate+in+a+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of heart rate in a rabbit heart.</a> J Electrocardiol. 44 (6), 626-634 (2011).</li>
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<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

이해 상충은 선언되지 않습니다.

랑겐 돌프 - 관류 온 마음 1) 그대로 SAN, 2) SAN은 고립에, 심방 준비를 개설 : 여기, 우리는 마우스 SAN 준비의 두 가지 유형을 제시했다. 준비의이 두 종류의 서로 다른 실험 목적을 제공합니다. 랑겐 돌프 - 관류 온 마음 준비에서 그대로 심방 구조는 가능한 재진입 빈맥 성 부정맥 동안 SAN과 심방 사이의 복잡한 심방의 이러한 심방 세동과 같은 부정맥뿐만 아니라 상호 작용을 연구 할 수있는 보존됩니다. 6 대조적으로, 고립 된 심방 준비 아트리움은 세 가지 차원 해부학 번들을 방해하는 의사 두 차원 구조로 열어 평평하게됩니다. 이 심방 arrhythmogenesis 공부에 적합하지 격리 된 심방 준비를하게 재진입 경로의 해부학에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나,이 제제의 종류, 선도적 인 페이스 메이커 (들) 사이트, intranodal 전도의 위치 및 AP 전파 페이지를 사용하여attern 정확하게 시각 상세하게 조사 될 수있다. 분리 된 제제에서, 전체 심방 표면 광 맵핑 할 수있을...

인간 생리학에 대한 이해의 도약으로 이끄는 새로운 과학적 돌파구는 종종 기술 발전에 선행됩니다. 예를 들어, 형광 광학 매핑을 통해 세포와 조직 모두에서 여러 생리학적 매개변수를 조사할 수 있습니다. 1,2 해부학적 구조가 전기생리학적 기능 및 기능 장애와 어떻게 연관되어 있는지에 대한 이해를 크게 향상시켰습니다. 심장에서 자연 심박 조율기와 동방 결절(SAN) 및 방실 접합부와 같은 전도 시스템은 주변 심방 근세포에 의해 절연된 결절 근세포로 구성됩니다. 3-5 이러한 조직은 특수한 전기적 특성을 가진 복잡한 3차원 구조를 만듭니다. 이러한 심박 조율기 구조의 구조적 및 기능적 리모델링은 모두 상당한 전기생리학적 이질성을 형성하는 것으로 인식되었습니다. 6,7 이러한 이질성이 SAN 기능 장애와 심방 부정맥을 초래하는 기전을 이해하는 것은 이러한 질병의 임상 치료에 큰 도움이 될 것입니다. 이를 위해서는 광학 매핑과 같은 조직 수준에서 전기 신호의 전파를 시각화하는 기술이 필요합니다. 
최근에는 축적된 증거가 심방 전기 생리학 및 병리학 연구에서 광학 매핑의 발전을 입증했습니다. 2 그러나 새롭고 엄격한 연구는 실험 데이터의 정확한 해석에 의존하며, 그 타당성과 안정성은 신중한 실험 프로토콜에 의존합니다. 유전자 변형 마우스는 아픈 동 증후군, 심박 조율기 이상 및 심방 부정맥을 포함한 인간 질병의 동물 모델로 연구에 광범위하게 사용됩니다. 6,8-11 따라서, 형광 광학 매핑과 형질전환 마우스 모델의 조합은 다양한 병리학과 관련된 심장 전기적 이상을 연구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다. 이 백서에서는 마우스 SAN과 아트리움의 고해상도 광학 매핑을 위한 프로토콜을 제시합니다. 구체적으로, 실험 중에 다양한 염료 로딩 접근 방식, 염료 표백에 대한 시간 효과 및 심박수 안정성에 대해 논의하고 비교합니다.

<table><tbody><tr><td>물 재킷</td><td>Radnoti</td><td>1660 시리즈 조직 목욕 대형 장기 또는 단일 세포 격리 절차</td><td></td></tr><tr><td>물 목욕 / 순환기</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>압력 증폭기</td><td>AD 기기</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore 나일론 그물 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>압력 변환기</td><td>AD 스테인레스</td><td></td> 스틸 Minutien 핀MLT0670 <td></td>악기</tr><tr><td>- 0.1 mm 지름</td>의 <td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Superfusion 펌프</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tubingen 가위&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>켈리 지혈 겸자</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 집게</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG 12mm 바늘(29게이지) 전극(단극)&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>인라인 루어 주입 포트</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS 카메라&nbsp;</td><td>사이미디어</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>할로겐 램프</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

중심방결절(SAN) 기능 장애 및 관련 합병증은 심장 질환 환자의 이환율의 중요한 원인입니다. 이러한 환자를 치료하기 위한 새로운 약리학적 치료법의 개발은 SAN의 정상 생리학과 병태 생리학에 대한 철저한 이해에 달려 있습니다. 심장 박동 측정에 대한 연구 중, 마우스 SAN은 SAN 이온 채널 또는 칼슘 처리 단백질을 암호화하는 다른 유전자의 발현에 대한 변형에 대한 가능성으로 인해 널리 사용됩니다. 전기생리학 및 조직학 연구에서 나온 새로운 증거는 SAN에서 아트리움까지 특수 전도 경로의 존재와 SAN 내의 복잡한 심박 조율기의 계층 구조를 포함하여 마우스 SAN 구조 및 기능의 대표성과 유사성을 더 큰 포유류와 입증했습니다. 최근에는 광학 매핑 기술이 마우스 SAN 내부 및 마우스 SAN에서 발생하는 여기 및 전도의 기원에 대한 탐색 및 조사를 크게 촉진했으며, 이를 통해 SAN에 대한 이해를 확장하고 SAN 기능 장애 관련 질병의 임상 치료에 도움이 되었습니다. 이 원고에서는 온전한 Langendorff 관류 심장과 분리된 심방 제제에서 마우스 SAN의 광학 매핑을 수행하는 방법을 자세히 설명했습니다. 이 프로토콜은 마우스 SAN 생리학 및 병태생리학에 대한 이해를 향상시키는 데 유용한 도구입니다.

랑겐 돌프 - 관류 심장에서 그대로 SAN의 광학 매핑 자연 동 율동에 대한 재구성 RA 활성화 등고선의 전형적인 예는 랑겐 돌프 - 관류 마우스 심장 그림 3에 표시됩니다. 초기 활성 점은 SAN 해부학 정의 SVC 근처 intercaval 영역 내에 위치한다. 1.0 및 0.5 msec의 샘플링 레이트에서 취득 3,16 개의 RA 활성화 등고선지도는도 3b에 도시된다. SAN의 기능을 평가하기 위해, 우리는 10 ~ 12 Hz에서 적어도 1 분 동안 RAA 페이싱 후 SAN 회복 시간 (SANRT). (9) 측정, 전기 자극을 중단하고 SANRT이 이전 촬영 AP와 사이의 시간 간격으로서 계산 하였다 먼저 자연 AP...

여기에, 우리는 높은 공간 및 시간 해상도, 마우스 우심방 특히 중국 - 심방 노드에서 전기 활동의 광학 매핑을위한 프로토콜을 제시한다.

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

본 실험 프로토콜의 전체적인 목표는 온전한 Langendorff 관류 심장 또는 분리된 심방 표본으로부터 생쥐의 동방결절에 대한 광학 매핑을 수행하는 것입니다. 이 방법은 페이스메이커 이상, 동결절 기능부전 증후군 및 이와 관련된 다양한 질환성 심방 부정맥의 메커니즘에 관한 동방결절의 전기생리학 및 병태생리학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 높은 공간 및 시간 해상도로 온전한 조직 내의 여러 매개변수를 조사할 수 있다는 점입니다.발가락 꼬집기 시험을 통해 적절한 마취 수준을 확인한 후, 5.5 inch 곡선형 Mayo 가위와 5.5 inch Kelly 지혈 집게를 사용하여 흉부 앞면에 1 cm 절개를 가합니다. 4 inch 곡선형 Iris 집게를 사용하여 폐 조직을 빠르게 잡고, 4/3 inch Iris 가위로 폐, 흉선, 심장을 심낭과 함께 함께 절제합니다. 산소화된 37 °C 변형 Tyrode 용액으로 조직을 세척합니다.그 후, 곡선형 3인치 Vannas Tubingen 가위와 4/3인치 5번 포셉을 사용하여 심장에서 폐, 흉선 및 지방 조직을 제거합니다. 다음으로, 맞춤 제작된 21 gauge 캐뉼라와 두 개의 곡선형 4.3인치 5번 B 포셉을 사용하여 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고, 관상동맥 순환의 폐쇄를 방지하기 위해 관내 11 µm 나일론 필터를 통해 37 °C Tyrode 용액을 심장에 동시에 관류 및 표면 세척합니다. 그런 다음, 3방향 스톱콕을 통해 관류 라인의 Luer lock에 압력 트랜스듀서를 연결하여 대동맥압을 모니터링하며, 필요에 따라 대동맥압이 60 내지 80 mmHg로 유지되도록 관류 속도를 조절합니다.Langendorff 관류 심장의 동방결절 광학 매핑을 위해, 장기를 유리 조직 기관 배양 챔버에 후면이 위를 향하도록 수평으로 배치하고, 실험 중 흐름으로 인한 움직임을 방지하기 위해 0.1 millimeter 직경의 핀을 사용하여 심실 정점을 챔버의 실리콘 코팅 바닥에 고정합니다. 폐정맥, 좌심방 및 승모판을 통해 좌심실로 작은 실리콘 튜브를 삽입하고, 40 silk 봉합사를 사용하여 튜브를 주변 결합 조직에 고정합니다. 다음으로, 다른 40 silk 봉합사를 사용하여 상대정맥과 하대정맥을 올가미 형태로 묶고, 우심방이의 가장자리를 챔버 바닥에 핀으로 고정합니다.봉합사의 반대쪽 끝을 당겨 챔버 바닥에 고정하고, 맞춤 제작된 페이싱 전극을 우심방이 가장자리에 배치합니다. 그런 다음, 우심실과 좌심실의 기저부 근처에 두 개의 12 millimeter 바늘 단극 심전도 전극을 배치하고, 심실 첨단 근처에 접지 심전도 전극을 배치합니다. 조직을 염색하려면, 희석된 염료를 관상동맥 관류 라인의 인라인 관류 포트에 주입하여 5분에서 7분 동안 전달합니다.20분간의 안정화 후, 37 °C의 blebbistatin 0.5 mL를 관류액에 첨가하고, 이어서 인라인 Luer lock 주입 포트를 사용하여 37 °C Tyrode 용액 1 mL에 희석한 blebbistatin 0.1 mL를 관상동맥 관류 라인에 5~7분에 걸쳐 주입합니다. Blebbistatin은 주의해서 사용해야 합니다. 억제제의 침전을 방지하려면, 먼저 blebbistatin을 37 °C로 가온하여 투명해진 배지에 용해시킨 후 혼합물을 격렬하게 교반하십시오.샘플을 광학적으로 매핑하려면, 먼저 진동하는 용액으로 인한 움직임 아티팩트를 줄이기 위해 조직 위의 용액 표면에 작은 커버 글라스를 고정합니다. 그런 다음 정전류, 저소음 할로겐 램프에서 제공되는 들뜸 광원이 연결된 유연한 분기 광섬유 가이드를 사용하여 필터링된 광선을 조직에 조사하고, 결과로 나타나는 형광 신호를 이미징합니다. 앞서 시연한 대로 심장에 캐뉼라를 삽입한 후, 심실을 앞쪽에서 분리하고, 삼첨판 상대정맥 축을 따라 삼첨판을 통해 우심방을 연 뒤, crista terminalis의 내측 분지를 통해 절개합니다.전심방 자유벽을 개방하려면 내측 지절 절개선의 중앙선부터 우심방이의 우측 하단 모서리까지 절개한 후, 평평하게 편 심방 자유벽을 실리콘 코팅 챔버 바닥에 핀으로 고정합니다. 좌심방이를 개방하려면 좌심방이의 승모판 상단 모서리를 따라 승모판을 절개합니다. 그 다음, 앞서 우심방에 수행한 것과 동일한 방식으로 개방된 좌심방을 핀으로 고정합니다.그 다음 심실 조직의 일부를 제거합니다. 심방의 손상을 방지하기 위해 표본을 고정할 수 있는 심실 조직의 테두리를 남겨두고, 조직을 Sylgard 코팅된 챔버 바닥에 핀으로 고정합니다. 이제 실리콘 코팅된 챔버 바닥에서 최종 표본을 약 0.5 millimeters 정도 들어 올려 심외막과 심내막 표면 모두에서 관류가 가능하게 한 후, 37 degree Celsius Tyrode 용액으로 시료를 관류합니다.그런 다음 맞춤 제작된 페이싱 염화은 전극을 절개된 우심방 부속기의 가장자리에 배치합니다. 우심방 및 좌심방 부속기 근처에 각각 12 millimeter 바늘 단극 심전도 전극을 하나씩 배치하고, 심방-심실 접합부 근처에 접지 심전도 전극을 배치합니다. 심장 조직을 염색하려면 1 millimeter 피펫을 사용하여 37 °C Tyrode 용액에 희석된 전압 민감성 염료를 조직 위에 직접 천천히 분사합니다.그 다음, 희석된 blebbistatin을 조직에 직접 도포하여 샘플을 고정시킨 후, 관류액을 통해 blebbistatin 0.5 mL를 추가로 투여하고 앞서 시연한 것과 같이 샘플의 광학 매핑을 수행합니다. 조직 염색 및 blebbistatin 억제 단계는 정확한 구현과 정밀한 염색 절차가 요구되는 매우 중요한 과정이며, 이는 심박수, 주 페이스메이커(leading pacemaker)의 위치, 심방 전도와 같은 심방 생리학적 파라미터에 영향을 주지 않기 위함입니다. 여기 Langendorff 관류를 거친 마우스 심장의 자발적 동결절 리듬(spontaneous sinus rhythm)에 대해 재구성된 전형적인 우심방 활성화 윤곽 지도와, 각각 1 및 0.5 ms 샘플링 속도로 획득한 두 개의 해당 우심방 윤곽 지도가 제시되어 있습니다.초기 활성화 지점은 동방결절이 해부학적으로 정의되는 상대정맥 인근의 정맥간 영역 내에 위치합니다. 본 실험에서는 우심방 부속기를 10 내지 12 Hertz로 최소 1분 동안 페이싱한 후 전기 자극을 중단하였으며, 마지막으로 포착된 활동 전위와 첫 번째 자발적 활동 전위 사이의 시간 간격으로 동방결절 회복 시간을 계산하였습니다. 자발적 동리듬 동안 분리된 심방 표본의 활성화를 통해 주 페이스메이커 위치의 정확한 영역을 식별할 수 있습니다.수술 및 염료 로딩 절차를 적절히 수행한다면, 심방의 생리학적 특성에는 유의미한 변화가 관찰되지 않아야 합니다. 동맥 염색은 더 많은 양의 염료가 필요할 수 있지만, 관상동맥 염색 후의 신호 강도 감쇠 시간이 표면 염색 후보다 거의 두 배 더 길기 때문에 이 로딩 방법을 통한 동방결절 영역 조직의 형광 신호가 더 안정적인 것으로 나타납니다. 이 기술에 숙달되면, 적절히 수행했을 때 30~40분 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때는 심방 조직과 동결절의 손상을 방지하기 위해 절개 전 심방의 해부학적 구조를 정확히 확인하십시오. 본 절차 이후에는 전위차 막전위 특성에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위해 기존의 유리 승모판 전극 기록과 같은 다른 측정 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 신경생리학 분야의 연구자들은 심장의 동방결절 기능 부전을 포함한 심방 부정맥을 탐구할 수 있는 길이 열렸습니다.이 영상을 시청한 후, 마우스 동결절 준비물의 고해상도 광학 매핑을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

연구

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Biology

생물학

이 문서 potentiometric 염료 (DI - 8 - ANEPPS)를 사용 Langendorff - perfused 쥐 심장의 표면에 광학 이미지 조치 가능성이 운동에 높은 시간적 및 공간적 해상도 기법을 설명합니다.

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이 문서는 파노라마 영상 시스템을 사용 Langendorff - perfused 토끼 마음에 광학 매핑 실험을 실시하기위한 기본 절차 및 듀얼 (전압과 칼슘) 이미징 양상을 설명합니다.

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마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

이 비디오는 쥐의 심장에서 동방결절 또는 SAN을 분리하는 절차를 보여줍니다. SAN은 자발적인 활동 전위를 생성하여 심장 박동을 시작하는 동방 세포를 수용합니다.

마우스 모델에서 동방결절 분리: 쥐 심장에서 SA 결절을 채취하는 절차

이 프로토콜 설명 electrophysiological murine atria는 높은 시간적, 공간적 해상도, 막 전압의 듀얼 녹음을 포함 한 광학 매핑 시스템을 활용 하 여 평가 하 고 캘리포니아2 + 에서 과도 프로그램 특수 전극 카 테 터를 통해 자극입니다.

고해상도 광학 매핑 Murine Atria electrophysiological 평가

우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성

이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

학습하세요 마우스 심방결절의 고해상도 광학 매핑 방법을 Langendorff 관류 심장을 이용하여 전기생리학적 이상과 부정맥 메커니즘을 연구하는 기술입니다.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

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