입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

이 절차의 전반적인 목표는 iPALM이라는 3차원 초고해상도 현미경 방법을 사용하여 부착 포유류 세포의 액틴 세포골격을 초구조 수준에서 시각화하는 것입니다.iPALM 이미징은 3차원 모두에서 하위 추세의 나노미터 공간 해상도를 제공합니다. 이를 통해 형광 프로브를 사용하여 초미세 구조를 시각화할 수 있어 높은 라벨링 특이성을 얻을 수 있습니다.

이 비디오에 제시된 절차는 초고해상도 현미경을 기반으로 한 단일 분자 국소화를 통해 세포의 다른 초구조적 특징을 시각화하는 데 빠르게 적응할 수 있고 유익해야 합니다. 6웰 플레이트의 커버 유리에 있는 세포를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 이미징 샘플을 조립하려면 가는 집게를 사용하여 버퍼 웰에서 표본 커버 유리를 부드럽게 제거합니다.

그런 다음 접힌 흡수성 종이로 커버 유리의 가장자리를 만져 여분의 버퍼를 빠르고 부드럽게 두드립니다. 덮개 유리 셀 면이 위를 향하도록 깨끗한 렌즈 용지 위에 놓습니다. 30-50마이크로리터의 이미징 버퍼를 샘플에 넣어 샘플을 헹굽니다.

접힌 흡수성 종이로 기울이고 두드려 여분의 버퍼를 제거합니다. 헹굼 단계를 몇 번 반복한 후 30-50마이크로리터의 이미징 버퍼를 샘플에 놓습니다. 커버 유리의 가장자리를 닦아내고 건조된 부분에 빠르게 경화되는 에폭시의 매우 작은 점을 여러 개 놓습니다.

미리 청소된 다른 숫자 1.5 커버 유리를 22mm 커버 유리가 들어 있는 셀 중앙으로 천천히 내립니다. 이미징 버퍼가 모세관 작용으로 양쪽 커버 유리를 모두 적시게 합니다. 속경화 에폭시의 작은 점들은 두 커버 유리에 모두 부착되어야 합니다.

접힌 흡수지를 사용하여 조립된 샘플을 부드럽게 눌러 압력을 고르게 분산시킵니다. 샘플 셀을 얇고 균일하게 만들기 위해 충분한 압력을 사용하되 셀을 부술 정도는 아닙니다. 뉴턴의 고리 패턴을 관찰하여 적절한 두께를 측정합니다.

기포를 최소화하기 위해 이 단계를 부드럽게 수행해야 합니다. 필요한 경우 빈 커버 안경으로 미리 여러 번 연습하십시오. 다음으로, 용융된 바셀린 라놀린 파라핀으로 샘플을 밀봉합니다.

그런 다음 밀봉된 샘플을 탈이온수로 헹굽니다. 압축 공기로 샘플을 불어 건조시켜 현미경에 장착할 준비를 합니다. 스프링이 장착된 상단 대물 렌즈를 위로 이동하여 샘플 홀더를 제거합니다.

밀봉된 표본을 샘플 홀더에 놓고 여러 개의 작은 희토류 자석으로 고정합니다. 이미징 샘플의 양쪽에 이멀젼 오일을 도포합니다. 샘플 홀더를 광학 경로에 다시 놓고 상단 대물 렌즈를 부드럽게 내립니다.

여기 레이저를 켭니다. 또한 프레임 전송 모드에서 EMCCD 카메라를 켭니다. 그런 다음 적절한 방출 필터를 회전시킵니다.

기계식 셔터를 활성화하여 상단 빔 경로를 차단하고 하단 빔 경로를 엽니다. 아래쪽 대물 렌즈에 초점을 맞추기 위해 piezo actuator를 사용하여 작은 증분으로 평행 이동을 합니다. 기준점에 초점이 맞춰지면 하단 빔 경로를 차단하면서 상단 빔 경로를 열고 유사한 방식으로 상단 대물렌즈에 초점을 맞춥니다.

최적의 초점을 위해 컴퓨터 디스플레이에서 기준점의 너비를 모니터링합니다. 적절한 중심을 위해 상단 및 하단 빔 경로를 모두 엽니다. 기준 이미지가 가능한 한 가깝게, 이상적으로는 1픽셀 이내로 겹칠 때까지 한 쌍의 초미세 고정 나사를 사용하여 하단 대물렌즈를 일정하게 유지하는 동안 상단 대물렌즈를 수동으로 조정합니다.

그런 다음 기준 이미지가 EMCCD 픽셀의 10분의 1 이내에서 겹치도록 미세 조정을 수행합니다. 제어 소프트웨어를 통해 상단 2축 piezo mounted mirror를 조정하면서 두 대물 렌즈와 하단 반사 미러를 일정하게 유지합니다. 컴퓨터 디스플레이를 통해 상단 및 하단 대물렌즈 보기의 기준점 중심을 비교하여 프로세스를 안내합니다.

레이저를 켠 상태에서 카메라는 지속적으로 스트리밍하고 상단 및 하단 빔 경로가 모두 열린 상태에서 제어 소프트웨어에서 생성된 정현파 전압 파형을 사용하여 400나노미터 크기에 걸쳐 연속 Z축 진동을 사용하여 샘플 홀더 Z 피에조를 진동시킵니다. 기준점 진동의 강도가 나타날 때까지 전동 빔 스플리터 어셈블리를 수동으로 위 또는 아래로 이동합니다. 원하는 단일 광자 간섭 효과로 인해 이는 광학 경로 길이가 밀접하게 일치함을 의미합니다.

최적의 경우 10 이상의 피크 대 밸리 비율을 달성할 수 있습니다. 각 표면의 진폭과 위상이 시야 전체에 걸쳐 가능한 한 균일하게 유지되도록 하려면 beam splitter assembly의 하단 미러를 작은 단계로 조정하여 갭과 기울기 각도를 미세 조정하십시오. 800나노미터에서 8나노미터 Z 단계로 시료를 변환하여 빔 스플리터 미세 정렬을 수행합니다.

카메라 1에서 3까지 카메라 간의 기준 강도를 모니터링합니다. 빔 스플리터 어셈블리 내에서 하단 미러의 높이, 위치 및 기울기를 작은 단계로 조정하여 카메라 2에 대한 카메라 1의 진동 위상이 이상적으로는 120도에서 최대화되도록 합니다. 초기 정렬이 완료되면 샘플을 변환하여 이미지화할 세포와 근처의 여러 기준점을 모두 포함하는 적절한 시야를 스캔합니다.

시스템 주위에 인클로저를 배치하여 미광과 주변 섭동을 차단합니다. 이미징 영역이 발견되면 샘플을 다시 변환하고 후속 Z 좌표 추출에 사용할 수 있도록 검량선을 기록합니다. 기본 인터페이스에서 acquire calibration scans versus sample piezo position 명령을 사용합니다.

원하는 영역을 찾고 검량선을 얻으면 소프트웨어에 적절한 파일 이름을 입력합니다. 상단 및 하단 빔 경로를 모두 연 다음 642 나노미터 레이저의 여기 파워를 최대로 높입니다. Alexa Fluor 647의 경우 Fluor-4를 끄는 초기 기간이 필요할 수 있습니다.

단일 분자 깜박임이 관찰될 때까지 5분 동안 또는 필요한 경우 그 이상 642 나노미터 여기로 계속 노출시킵니다. 이 소프트웨어를 사용하면 획득 과정에서 405나노미터 광활성화가 자동으로 증가할 수 있습니다. 필라멘트 피쳐를 명확하게 볼 수 있도록 일반적으로 많은 수의 획득 프레임이 필요합니다.

준비가 되면 기본 인터페이스에서 start iPALM acquisition 명령을 사용하여 원시 이미지 세트 획득을 시작합니다. 획득하는 동안 405 나노미터 레이저의 강도를 조정하여 필요에 따라 적절한 점멸 밀도를 유지하여 광 활성화 수준을 조정합니다. 샘플 커버 슬립이 제대로 조립되면 뉴턴의 고리는 주변광 또는 표준 형광등 아래에서 육안으로 관찰할 수 있습니다.

형광 이미터의 축 위치를 추출하려면 iPALM 이미징에서 동시 다상 간섭이 필요하며, 이는 3개의 EMCCD에서 주어진 기준점의 강도 변화에 의해 보정됩니다. 그런 다음 강도를 정규화하고 위상 차이를 결정하기 위해 적합합니다. 다음은 각 국소화 좌표가 2D 가우시안에 의해 렌더링되고 폭이 국소화 불확실성에 해당하는 재구성 iPALM 이미지입니다.

Z 좌표는 색상 막대에 따라 색상이 지정됩니다. 조밀하고 희박한 필라멘트 특징이 있는 영역을 볼 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 Alexa Fluor 647 phalloidin으로 표지된 HUVEC 세포의 액틴 세포골격의 재구성 iPALM 이미지입니다.

이미지 색상은 색상 막대에 따른 Z 좌표를 나타냅니다. 횡단면 히스토그램은 상자 영역의 긴 축을 따라 XY 국소화 좌표에서 생성됩니다. 가우스 피팅은 가로 단면과 관련된 최대 43.88 나노 미터의 절반 너비를 보여줍니다.

이 히스토그램은 상자 영역에서 지역화 좌표의 Z 위치에 대한 것입니다. 가우스 피팅은 최대 17.50나노미터의 전체 너비를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 90분 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 간단한 준비 및 장착, 광학 정렬, 원시 데이터 수집 및 초고해상도 이미지 재구성을 위한 후속 분석을 통해 iPALM을 사용하여 초구조에서 액틴 세포골격을 시각화하는 방법을 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구에서 액틴 세포골격의 나노 단위 구조와 국소 접착과 같은 세포 접착 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.