Name: 입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 배우세요 iPALM을 사용하여 부착 포유류 세포의 F-액틴 사이토스켈레톤을 나노미터 해상도로 3차원 시각화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 초미세 구조 연구에 필수적인 고해상도 형광 현미경 기술을 제공합니다.

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YW 및 PK는 감사 PK (NRF-NRFF-2011-04 및 NRF2012NRF-CRP001-084)에게 수여 싱가포르 국립 연구 재단에서 자금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 인프라 지원을위한 MBI 개방 실험실과 현미경의 핵심 시설을 주셔서 감사합니다.

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<li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM%2C+iPALM%2C+and+correlative+iPALM-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).</li>
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저자는 공개 아무것도 없어.

도 1a에 도시 된 바와 같이 iPALM의 광학계는, 4 π 이중 대향 대물 설계에 기초한다. 표 1에 이전 (23) 설명 및 나열된 설정은 사용자 정의 가공 및 상업 모두 광학 기계 부품을 사용하여 구성된다. 우리의 설치뿐만 아니라, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI)는 Janelia 연구 캠퍼스에서 고급 이미지 센터에서 과학계에 액세스 할 수있는 시스템을 호스팅합니다. 전체 기계 도면, 제어 회로도 및 소프트웨어의 경우, 독자는 자세한 내용은 HHMI에서 랄드 헤스에 문의하는 것이 좋습니다. F 액틴을 시각화 iPALM뿐만 아니라 다른 단일 분자 파악 현미경 방법을 사용하는 주요 장점은 EM의 일반적 거친 샘플 처리를 필요로 기술 힘들고 준비, 숙련 된 실무자 3,23 비교 샘플 준비의 상대적 용이성 . AdditionallY는 형광 EM 어려운 남아 멀티 채널 영상에 자연스럽게 의무입니다. ...

복잡한 세포 구조의 시각화는 오랫동안 생물 통찰력과 발견을 통합하고있다. 형광 현미경은, 그 해상력이 ~ 200 화상면에 나노 (X, Y, 또는 측 방향 치수) 및&gt; 500 nm의 광학 축 방향 (Z, 또는 축 방향 치수)에 회절 고분자 특이성 화상 세포 제한 할 수 있지만 1, 2. 따라서, 미세 기능 관찰 역사적 전자 현미경 (EM)로 제한되어왔다. 100 nm의 범위 1-6 - 다행히, 슈퍼 해상도 현미경의 최근 발전은 10에서 공간 해상도를 가능하게,이 제한을 회피했다. 특히, 슈퍼 해상도는 같은 PALM (광 활성화 현지화 현미경) 4, FPALM은 (형광 광 활성화 현지화 현미경) 5 (d)에 STORM (직접 확률 광학 재건 현미경) 6, 7, PAINT (같은 약어로 알려진 단일 분자 현지화에 기반 접근 방법 포이미징 나노 지형) 8 INT의 축적은, GSDIM (접지 상태 고갈 현미경 9) 개별 분자 반환 한 다음, 또는 SMACM (단일 분자 액티브 제어 현미경) (10),뿐만 아니라 그들의 3 차원 (3D) 구현, 간섭 PALM (iPALM) 11 3D-STORM (12)는 신경 세포의 축삭을, 다수의 생물학적 구조의 나노 조직에 새로운 통찰력을 드러내는 포함 귀중한되었습니다 및 초점 유착 14, 15, 세포 - 세포 접합 (16), 원자력이 17 모공, 13 시냅스 및 중심체 18 ~ 20 등이 있습니다. 슈퍼 해상도 현미경은 잠재적으로 유용하는 세포의 또 다른 미세 기능은 액틴 세포 골격이다. 셀 피질 필라멘트 (F) 액틴의 복잡한 그물 세공은 세포 형태 및 기계적 특성 (21)의 제어에 중요한 역할을한다. 조직 오F의 F-액틴 적극적 동적 강하게 중합, 가교, 회전율, 안정성 및 네트워크 토폴로지 (22)에 영향을 미치는 수많은 조절 단백질 비록 조절된다. 그러나, F - 굴지 그물 세공 구조의 특성은 세포 과정의 다양한 범위, 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 자신의 관찰을 방해은 F-액틴 필라멘트의 작은 크기 (~ 8 ㎚)에 기계적인 통찰력에 대한 중요하지만, 따라서 액틴 미세 구조의 시각화 종래 독점적 EM에 의해 수행되었다. 여기서는, 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격 F-시각화 3D 11,23에 매우 높은 정밀도 기능을 활용할 iPALM 초 해상 현미경 기술을 사용하는 프로토콜을 기술한다. iPALM 악기는 매우 전문 있지만, 이러한 장비를 설정하는 방법에 대한 지시는 최근 23 설명되어있는 호 주최 iPALM 현미경에 액세스하는 동안구 휴즈 의학 연구소는 또한 최소의 비용으로 연구 커뮤니티에 제공하고있다. 또한, 본원에 기재된 시료 제조 방법은 더 광범위하게 사용할 수있는 등의 점 확산 함수 (PSF)의 난시 디 포커싱 기반으로하는 다른 3D 슈퍼 해상도 방법, (12) 또는 이중면 검출부 (24)에 직접적으로 적용될 수있다. 우리는 일반적으로 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 필요한 성분이 충족되어야 단일 분자 현지화 기반의 초 고해상도 현미경을위한 세 가지 핵심 요구 사항을 수있는 광전 환성 형광 25이므로주의 : ⅰ) 높은 단일 분자 배경 신호의 밝기 및 대비 상대; ⅱ) 소정의 이미지 프레임 내의 단일 분자의 희박한 분포; 또한 나이 퀴 스트 - 샤로 알려진 기본 구조 (의 프로필을 캡처하기에 충분한 라벨 및 ⅲ) 높은 공간 밀도nnon 샘플링 기준) 26. 따라서, 만족스러운 결과를 위해, 형광체의 강조 photoswitching을 최적화하고 기본 미세 구조를 보존 할뿐만 아니라, 실험 기기 및 수집 측면하는 시험편의 적절한 준비를 모두 동등하게 배치되어야한다.

<table><tbody><tr><td>광학 테이블</td><td>Newport, CA</td><td>RS4000</td><td>iPALM, 4 Newport Stabilizer 진동 차단기</td></tr><tr><td>에 설치 광학 테이블</td><td>Newport, CA</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>laser-642</td><td>Newport, CA</td><td>1185055</td><td>출력 = 100 mw</td></tr><tr><td>레이저 -561</td><td>Newport, CA</td><td>1168931</td><td>출력 = 200 mw</td></tr><tr><td>레이저 -488</td><td>Newport, CA</td><td></td><td>1137970 출력 전력 = 200 mw</td></tr><tr><td>레이저 -405</td><td>Newport, CA</td><td>1142279</td><td>출력 전력 = 100 mw</td></tr><tr><td>광대역 유전체 미러</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>BB1-E02</td><td>레이저 결합기</td></tr><tr><td>이색성 빔 스플리터</td><td>Semrock, NY</td><td>LM01-427-25</td><td></td></tr><tr><td>음향 광학 조정 가능 필터</td><td>AA Opto-Electronic, France</td><td>AOTFnC-VIS-TN</td><td></td></tr><tr><td>Linear 편광판</td><td>Newport, CA</td><td>05LP-VIS-B</td><td></td></tr><tr><td>베이스 플레이트</td><td>로컬 워크샵</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>터닝 미러(22.5°C;)</td><td>Reynard Corpporation, CA</td><td>맞춤형</td><td>22.5°; 미러</td></tr><tr><td>전동 광학 마운트</td><td>New Focus, CA</td><td>8816</td><td></td></tr><tr><td>전동 XYZ 변환 스테이지</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>MT3/M-Z6</td><td>샘플 홀더</td></tr><tr><td>T-Cube DC 서보 모터 컨트롤러</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>피에조 위상 시프터</td><td>Physik Instrumente, 독일</td><td>S-303.CD</td><td></td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>니콘, 일본</td><td>MRD01691</td><td>대물렌즈. Apo TIRF 60X / 1.49 오일</td></tr><tr><td>번역 스테이지</td><td>새로운 초점, CA</td><td>9062-COM-M</td><td></td></tr><tr><td>피코 모터 액추에이터</td><td>새로운 초점, CA</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>로터리 솔레노이드 / 셔터</td><td>DACO 기기, CT</td><td>5423-458</td><td></td></tr><tr><td>3 방향 빔 스플리터</td><td>록키 마운틴 기기, CO</td><td>맞춤형</td><td>빔 스플리터</td></tr><tr><td>피에조 Z / 팁 / 틸트 스캐너</td><td>Physik Instrumente, 독일</td><td>S-316.10</td><td></td></tr><tr><td>전동 5축 틸트 얼라이너</td><td>New Focus, CA</td><td>8081</td><td></td></tr><tr><td>Picmotor 이더넷 컨트롤러</td><td>New Focus, CA</td><td>8752</td><td></td></tr><tr><td>피에조 컨트롤러/증폭기/디지털 작동 모듈</td><td>Physik Instrumente, 독일</td><td>E-509/E-503/E-517</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-523/20</td><td>필터</td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-588/21</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-607/30</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Semrock, NY</td><td>FF01-676/37</td><td></td></tr><tr><td>노치 필터</td><td>Semrock, NY</td><td>NF01-405/488/561/635</td><td></td></tr><tr><td>전동 필터 휠(컨트롤러 포함</td>) <td>Thorlabs, NJ</td><td>FW103H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor, UK</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td></td></tr><tr><td>카메라 및 동기화 제어를 위한 3세트 데스크탑 컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Precision T3500</td><td>PC,</td></tr><tr>기준 <td>Hestzig, VA</td><td>600-100AuF</td> 샘플 준비를 사용한 4세트<td>커버슬립</td><td>. 다양한 밀도 및 스펙트럼을 사용할 수 있는 기준 표시</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Millipore, MT</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학, PA</td><td>15710</td><td>고정.16%</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>전자 현미경 과학, PA</td><td>16220</td><td>25%</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC 세포</td><td>생명 과학, CA</td><td>C-015-10C</td><td></td></tr><tr><td>매체 200</td><td>생명 기술, CA</td><td>M-200-500</td><td></td></tr><tr><td>대형 혈관 내피 인자</td><td>Life Technologies, CA</td><td>A14608-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td></td><td>14190367</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td></td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>트립신/EDTA</td><td>Life Technologies, CA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>P1851</td><td>PHEM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>1베이스, 말레이시아</td><td>BIO-1825</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Millipore, MT</td><td>5985</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen, CA</td><td>A22287</td><td>염색</td></tr><tr><td>붕소화붕소나트륨(NaBH4)</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>480886</td><td>담금질</td></tr><tr><td>포도당</td><td>1염기, 말레이시아</td><td>BIO-1101</td><td>이미징 버퍼</td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>시스테아민</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>에폭시</td><td>Thorlabs, NJ</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>바셀린</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>16415</td><td>샘플 밀봉</td></tr><tr><td>라놀린</td><td>시그마 알드리치, MO</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 왁스</td><td>Sigma aldrich, MO</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>침수 오일</td><td>전자 현미경 과학, PA</td><td>16915-04</td><td>이미징. 카질 HF형</td></tr></tbody></table>

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 f-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (ipalm)

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

형광 현미경은 세포 내 특정 생체 분자를 직접 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 종래의 형광 현미경, 공간 해상도는 광축을 따라 결상면과&gt; 내지 500nm에서 ~ 200 nm의 회절에 의해 제한된다. 결과적으로, 형광 현미경은 오랫동안 심각한 세포 내 미세 기능의 관찰에 한정되었다. 초 해상 현미경 방법의 최근 발전은 이러한 한계를 극복하고있다. 특히, 광전 환성 형광체의 출현 분자 길이 스케일에 접근 해상력을 제공하는 기반 지역화 초 해상 현미경을 가능하게한다. 여기서는 간섭계 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM)이라는 단일 분자 파악 현미경 다상 간섭에 기초하여 입체 초 해상 현미경 법의 적용을 설명한다. 이 방법은에 거의 등방성 해상도를 제공세 가지 차원에서 20 나노 미터의 순서. iPALM 악기의 시료 준비 및 운영을 포함하여 사상 액틴 세포 골격을 시각화 프로토콜, 여기에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 세포에서 다른 미세 구조 기능 연구에 쉽게 적응과 교훈입니다.

iPALM 중요 요건은 광학 시스템의 정렬, 등록 및 교정된다. 추출 Z 좌표에 대한 이들 3 방향 빔 스플리터 내에서 필요한 적절한 간섭을 보장하기 위해 필요하다. 지속적인 모니터링을 사용하려면, 형광의 일정 지점 소스가 필요합니다. 이것은 형광 금 또는 그 포토 루미 국소 표면 플라즈몬 공명 (LSPR)에서 발생하는 이중 금속 나노 입자 (23)를 사용하여 달성 될 수있다. 그들은 조명에 따라 안정적인 단일 다이폴 안테나의 역할을 일반적으로 5 지역화 할 수 있습니다 - 10 nm의 정확도. 이들 시판의 나노 입자는 채도가없는 (도 1b)의 형광체와 기점 모두가 EMCCD 카메라의 여진 강도 및 게인 설정 유사한 이미지화 될 수있는 대부분의 단일 분자 형광의 범위 내의 휘도 레벨을 방출한다. 또한,이 기점 크게 FAC도기점의 외관상의 폭은 상기 포커스 조정시에 모니터링 될 수있다 ilitate 포...

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

이 절차의 전반적인 목표는 iPALM이라는 3차원 초고해상도 현미경 방법을 사용하여 부착 포유류 세포의 액틴 세포골격을 초구조 수준에서 시각화하는 것입니다.iPALM 이미징은 3차원 모두에서 하위 추세의 나노미터 공간 해상도를 제공합니다. 이를 통해 형광 프로브를 사용하여 초미세 구조를 시각화할 수 있어 높은 라벨링 특이성을 얻을 수 있습니다.이 비디오에 제시된 절차는 초고해상도 현미경을 기반으로 한 단일 분자 국소화를 통해 세포의 다른 초구조적 특징을 시각화하는 데 빠르게 적응할 수 있고 유익해야 합니다. 6웰 플레이트의 커버 유리에 있는 세포를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 이미징 샘플을 조립하려면 가는 집게를 사용하여 버퍼 웰에서 표본 커버 유리를 부드럽게 제거합니다.그런 다음 접힌 흡수성 종이로 커버 유리의 가장자리를 만져 여분의 버퍼를 빠르고 부드럽게 두드립니다. 덮개 유리 셀 면이 위를 향하도록 깨끗한 렌즈 용지 위에 놓습니다. 30-50마이크로리터의 이미징 버퍼를 샘플에 넣어 샘플을 헹굽니다.접힌 흡수성 종이로 기울이고 두드려 여분의 버퍼를 제거합니다. 헹굼 단계를 몇 번 반복한 후 30-50마이크로리터의 이미징 버퍼를 샘플에 놓습니다. 커버 유리의 가장자리를 닦아내고 건조된 부분에 빠르게 경화되는 에폭시의 매우 작은 점을 여러 개 놓습니다.미리 청소된 다른 숫자 1.5 커버 유리를 22mm 커버 유리가 들어 있는 셀 중앙으로 천천히 내립니다. 이미징 버퍼가 모세관 작용으로 양쪽 커버 유리를 모두 적시게 합니다. 속경화 에폭시의 작은 점들은 두 커버 유리에 모두 부착되어야 합니다.접힌 흡수지를 사용하여 조립된 샘플을 부드럽게 눌러 압력을 고르게 분산시킵니다. 샘플 셀을 얇고 균일하게 만들기 위해 충분한 압력을 사용하되 셀을 부술 정도는 아닙니다. 뉴턴의 고리 패턴을 관찰하여 적절한 두께를 측정합니다.기포를 최소화하기 위해 이 단계를 부드럽게 수행해야 합니다. 필요한 경우 빈 커버 안경으로 미리 여러 번 연습하십시오. 다음으로, 용융된 바셀린 라놀린 파라핀으로 샘플을 밀봉합니다.그런 다음 밀봉된 샘플을 탈이온수로 헹굽니다. 압축 공기로 샘플을 불어 건조시켜 현미경에 장착할 준비를 합니다. 스프링이 장착된 상단 대물 렌즈를 위로 이동하여 샘플 홀더를 제거합니다.밀봉된 표본을 샘플 홀더에 놓고 여러 개의 작은 희토류 자석으로 고정합니다. 이미징 샘플의 양쪽에 이멀젼 오일을 도포합니다. 샘플 홀더를 광학 경로에 다시 놓고 상단 대물 렌즈를 부드럽게 내립니다.여기 레이저를 켭니다. 또한 프레임 전송 모드에서 EMCCD 카메라를 켭니다. 그런 다음 적절한 방출 필터를 회전시킵니다.기계식 셔터를 활성화하여 상단 빔 경로를 차단하고 하단 빔 경로를 엽니다. 아래쪽 대물 렌즈에 초점을 맞추기 위해 piezo actuator를 사용하여 작은 증분으로 평행 이동을 합니다. 기준점에 초점이 맞춰지면 하단 빔 경로를 차단하면서 상단 빔 경로를 열고 유사한 방식으로 상단 대물렌즈에 초점을 맞춥니다.최적의 초점을 위해 컴퓨터 디스플레이에서 기준점의 너비를 모니터링합니다. 적절한 중심을 위해 상단 및 하단 빔 경로를 모두 엽니다. 기준 이미지가 가능한 한 가깝게, 이상적으로는 1픽셀 이내로 겹칠 때까지 한 쌍의 초미세 고정 나사를 사용하여 하단 대물렌즈를 일정하게 유지하는 동안 상단 대물렌즈를 수동으로 조정합니다.그런 다음 기준 이미지가 EMCCD 픽셀의 10분의 1 이내에서 겹치도록 미세 조정을 수행합니다. 제어 소프트웨어를 통해 상단 2축 piezo mounted mirror를 조정하면서 두 대물 렌즈와 하단 반사 미러를 일정하게 유지합니다. 컴퓨터 디스플레이를 통해 상단 및 하단 대물렌즈 보기의 기준점 중심을 비교하여 프로세스를 안내합니다.레이저를 켠 상태에서 카메라는 지속적으로 스트리밍하고 상단 및 하단 빔 경로가 모두 열린 상태에서 제어 소프트웨어에서 생성된 정현파 전압 파형을 사용하여 400나노미터 크기에 걸쳐 연속 Z축 진동을 사용하여 샘플 홀더 Z 피에조를 진동시킵니다. 기준점 진동의 강도가 나타날 때까지 전동 빔 스플리터 어셈블리를 수동으로 위 또는 아래로 이동합니다. 원하는 단일 광자 간섭 효과로 인해 이는 광학 경로 길이가 밀접하게 일치함을 의미합니다.최적의 경우 10 이상의 피크 대 밸리 비율을 달성할 수 있습니다. 각 표면의 진폭과 위상이 시야 전체에 걸쳐 가능한 한 균일하게 유지되도록 하려면 beam splitter assembly의 하단 미러를 작은 단계로 조정하여 갭과 기울기 각도를 미세 조정하십시오. 800나노미터에서 8나노미터 Z 단계로 시료를 변환하여 빔 스플리터 미세 정렬을 수행합니다.카메라 1에서 3까지 카메라 간의 기준 강도를 모니터링합니다. 빔 스플리터 어셈블리 내에서 하단 미러의 높이, 위치 및 기울기를 작은 단계로 조정하여 카메라 2에 대한 카메라 1의 진동 위상이 이상적으로는 120도에서 최대화되도록 합니다. 초기 정렬이 완료되면 샘플을 변환하여 이미지화할 세포와 근처의 여러 기준점을 모두 포함하는 적절한 시야를 스캔합니다.시스템 주위에 인클로저를 배치하여 미광과 주변 섭동을 차단합니다. 이미징 영역이 발견되면 샘플을 다시 변환하고 후속 Z 좌표 추출에 사용할 수 있도록 검량선을 기록합니다. 기본 인터페이스에서 acquire calibration scans versus sample piezo position 명령을 사용합니다.원하는 영역을 찾고 검량선을 얻으면 소프트웨어에 적절한 파일 이름을 입력합니다. 상단 및 하단 빔 경로를 모두 연 다음 642 나노미터 레이저의 여기 파워를 최대로 높입니다. Alexa Fluor 647의 경우 Fluor-4를 끄는 초기 기간이 필요할 수 있습니다.단일 분자 깜박임이 관찰될 때까지 5분 동안 또는 필요한 경우 그 이상 642 나노미터 여기로 계속 노출시킵니다. 이 소프트웨어를 사용하면 획득 과정에서 405나노미터 광활성화가 자동으로 증가할 수 있습니다. 필라멘트 피쳐를 명확하게 볼 수 있도록 일반적으로 많은 수의 획득 프레임이 필요합니다.준비가 되면 기본 인터페이스에서 start iPALM acquisition 명령을 사용하여 원시 이미지 세트 획득을 시작합니다. 획득하는 동안 405 나노미터 레이저의 강도를 조정하여 필요에 따라 적절한 점멸 밀도를 유지하여 광 활성화 수준을 조정합니다. 샘플 커버 슬립이 제대로 조립되면 뉴턴의 고리는 주변광 또는 표준 형광등 아래에서 육안으로 관찰할 수 있습니다.형광 이미터의 축 위치를 추출하려면 iPALM 이미징에서 동시 다상 간섭이 필요하며, 이는 3개의 EMCCD에서 주어진 기준점의 강도 변화에 의해 보정됩니다. 그런 다음 강도를 정규화하고 위상 차이를 결정하기 위해 적합합니다. 다음은 각 국소화 좌표가 2D 가우시안에 의해 렌더링되고 폭이 국소화 불확실성에 해당하는 재구성 iPALM 이미지입니다.Z 좌표는 색상 막대에 따라 색상이 지정됩니다. 조밀하고 희박한 필라멘트 특징이 있는 영역을 볼 수 있습니다. 여기에 표시된 것은 Alexa Fluor 647 phalloidin으로 표지된 HUVEC 세포의 액틴 세포골격의 재구성 iPALM 이미지입니다.이미지 색상은 색상 막대에 따른 Z 좌표를 나타냅니다. 횡단면 히스토그램은 상자 영역의 긴 축을 따라 XY 국소화 좌표에서 생성됩니다. 가우스 피팅은 가로 단면과 관련된 최대 43.88 나노 미터의 절반 너비를 보여줍니다.이 히스토그램은 상자 영역에서 지역화 좌표의 Z 위치에 대한 것입니다. 가우스 피팅은 최대 17.50나노미터의 전체 너비를 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 90분 안에 완료할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 간단한 준비 및 장착, 광학 정렬, 원시 데이터 수집 및 초고해상도 이미지 재구성을 위한 후속 분석을 통해 iPALM을 사용하여 초구조에서 액틴 세포골격을 시각화하는 방법을 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 세포 생물학 분야의 연구에서 액틴 세포골격의 나노 단위 구조와 국소 접착과 같은 세포 접착 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

three-dimensional-super-resolution-microscopy-f-actin-filaments

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

PI (4,5) P (2)는 다양한 세포 기능을 조절하지만, 세포 세포막에서의 나노 조직 잘못 이해된다. 라벨 PI 플렉스 트린 상동 도메인에 융합 된 이중 색상 형광 프로브 (4,5) P (2)에 의해, 우리는 나노 미터 스케일에서 (4,5) P 원형질막 2 공간 분포를 PI를 연구하는 새로운 방법을 기술 .

소설 형광 프로브와 플라즈마 막에서 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트의 단일 분자 슈퍼 해상도 이미징

이 방법론의 전반적인 목표는 게 최적의 실험 조건 샘플 준비에서 이미지 수집 및 재건 고정 셀에서 microtubules 및 중간 필 라 멘 트의 2D 듀얼 컬러 dSTORM 이미지를 수행...

중간 필 라 멘 트와 2 차원 직접 확률적 광학 재건 현미경으로 Microtubules 이미징

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

이 프로토콜은 광학 광자 재할당이 가능한 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 심층 전세포 단일 분자 위치 현미경(SMLM)을 수행하는 절차를 설명하여, 맞춤형 광학 장치나 복잡한 조명 없이 DNA-PAINT 이미징을 가능하게 합니다.

광학 광자 재배치가 포함된 회전 디스크 공초점 디스크에 대한 DNA-PAINT를 통한 전세포 초해상도 영상

배우세요 iPALM을 사용하여 부착 포유류 세포의 F-액틴 사이토스켈레톤을 나노미터 해상도로 3차원 시각화하는 방법을. 이 프로토콜은 세포 초미세 구조 연구에 필수적인 고해상도 형광 현미경 기술을 제공합니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

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