준비 및 체외 자기 공명 영상에 대한 덴드리머 기반 대조 대리인의 특성

이 절차의 전반적인 목표는 자기 공명 이미징을 위한 조영제로 사용할 수 있는 수지상 상자성 킬레이트의 준비 및 특성화를 보여주고 이미징 실험에서 그 성능을 입증하는 것입니다. 이 방법은 수지상 조영제의 특성 및 효능과 같은 MRI 조영제 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고단백의 효율적인 MRI 조영제를 편리하게 준비할 수 있어 특성화가 용이하다는 것입니다.

이 방법은 수지상 MRI 조영제의 추가 구조 수정 및 기능 최적화로 확장될 수 있으며, 이는 잠재적인 생체 내 응용 분야와 매우 관련이 있습니다. 이러한 영향은 생물의학 연구 및 진단 영상으로 확장되는데, 이는 수상이합체 조영제의 높은 분자 비율로 인해 조직 보유 시간이 길어지고 MRI 신호가 크게 향상되기 때문입니다. 먼저, 거대고리 전구체인 DO3A 트리부틸 에스테르 1g을 DMF 5밀리리터에 용해시킵니다.

탄산칼륨 0.67g을 넣고 실온에서 45분 동안 저어줍니다. 0.87g의 tert-butyl-2-bromo-4 4-nitrophenyl butatnoate를 1시간 이상 조금씩 첨가하고 18시간 동안 반응 혼합물을 계속 교반합니다. 그런 다음 섭씨 40-60도에서 벌브 간 진공 증류로 DMF를 제거합니다.

실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 둥근 고체를 얻습니다. 10 밀리리터 에탄올과 150 마이크로 리터의 7 일반 암모니아 용액을 메탄올에 혼합하여 고체를 1g을 용해시킵니다. 활성탄에 팔라듐 150mg을 첨가하고 수소 첨가기에 병 반응기를 설정합니다.

2.5bar 수소 분위기에서 16시간 동안 혼합물을 흔듭니다. 에탄올에 담긴 규조토의 현탁액을 소결 유리 깔때기에 붓고 규조토를 통해 반응 혼합물을 여과하여 팔라듐 탄소 촉매를 제거합니다. 회전 증발기의 여과액에서 용매를 제거합니다.

생성된 고체를 15밀리리터의 디클로로메탄과 4개의 등가물인 트리에틸아민에 용해시킵니다. 여기에 티오포스겐 1.3당량을 첨가하고 실온에서 16시간 동안 교반한다. 회전 증발기의 반응 혼합물에서 용매를 제거하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 잔류물을 정제하여 DOTA 유형 단량체를 연한 갈색 고체로 얻습니다.

섭씨 40도의 회전 증발기에서 용매를 증발시켜 메탄올의 10% 용액에서 66.7mg의 G4 PAMAM 덴드리머를 준비합니다. 덴드리머를 4ml의 DMF에 용해시킵니다. 0.105 밀리리터의 트리에틸아민을 수상기 용액에 넣고 섭씨 60도에서 45분 동안 저어줍니다.

그런 다음 354mg의 단량체를 한 시간에 걸쳐 조금씩 첨가합니다. 섭씨 45도에서 48시간 동안 계속 저어줍니다. bulb-to-bulb 진공 증류로 용매를 제거합니다.

친유성 겔 여과 매체를 메탄올에 넣고 실온에서 3시간 동안 소용돌이치며 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 포장합니다. 메탄올을 용리액으로 사용하여 1밀리리터 분획을 수집합니다. TLC로 분수를 분석합니다.

회전 증발기에서 보호된 수지상 킬레이터를 포함하는 분획에서 용매를 제거합니다. 화합물의 양성자 NMR 스펙트럼을 획득하고 방향족 및 지방족 영역을 통합합니다. 이 값을 사용하여 G4 PAMAM 덴드리머에 결합된 보호된 DOTA 유형 매크로사이클의 수를 결정합니다.

제품의 보호를 해제하려면 고체를 5 밀리리터의 포름산에 용해시키고 혼합물을 섭씨 60도에서 36 시간 동안 저어줍니다. 회전 증발기로 포름산을 제거하십시오. 회전 증발기에서 제거된 잔류물을 동결 건조하여 수지상 킬레이터를 얻습니다.

양성자 NMR을 사용하여 덴드리머에 결합된 거대고리 단위의 수를 결정합니다. 동결 건조 킬레이터를 물에 녹입니다. 0.1몰 수산화나트륨을 사용하여 용액 pH를 7.0으로 조정합니다.

1ml에 113mg의 염화가돌리늄 III 용액을 4시간에 걸쳐 킬레이터 용액에 적방울 떨어뜨립니다. 0.05몰 수산화나트륨으로 pH를 주기적으로 7.0으로 조정합니다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 저어줍니다.

그런 다음 4시간 동안 158mg의 EDTA를 조금씩 첨가하여 필요에 따라 pH를 다시 7.0으로 수정합니다. 실온에서 24시간 더 저어줍니다. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 물에 부풀어 오른 친수성 겔 여과 매체를 포장합니다.

반응 혼합물을 농축하고 혼합물을 컬럼에 로드한 다음 탈이온수로 용리합니다. 3 kilodalton 분리기 여과기 장치에 있는 순화된 표본을 1, 800 시간 g에 30 분 동안 원심분리기. 여과를 약 5회 반복하여 과도한 가돌리늄과 EDTA를 제거합니다.

자일레놀 오렌지 테스트로 여과액에 유리 가돌리늄 이온이 없는지 확인합니다. 여과된 샘플에서 휘발성 물질을 제거하고 잔류물을 동결 건조하여 수지상합체 조영제를 얻습니다. 5에서 10 밀리몰 사이의 농도로 물에 DCA의 원액을 준비합니다.

정확한 DCA 농도를 측정하려면 먼저 360마이크로리터의 원액을 60마이크로리터의 D2O 및 tert-부탄올 표준물질과 결합합니다. 400마이크로리터의 샘플을 외부 NMR 튜브에 넣습니다. tert-부탄올과 물 기준 용액이 들어 있는 동축 NMR 삽입 튜브를 샘플 튜브에 놓습니다.

양성자 NMR 스펙트럼을 획득하고 기준 용액과 샘플 용액의 tert-부탄올 신호 간의 주파수 이동을 측정합니다. 표시된 공식을 사용하여 DCA 농도를 계산하고 샘플에 첨가된 tert-부탄올을 보정합니다. 동일한 방식으로 시판되는 GdDOTA 용액의 농도를 측정합니다.

DCA 및 GdDOTA 용액을 HEPES 완충액에 넣고 물 제어 장치를 두 세트의 플라스틱 바이알에 넣습니다. 기포가 없는지 확인하기 위해 캡이 있는 바이알을 닫습니다. 60 밀리리터 주사기에 0.01 및 0.02 밀리몰 DCA 샘플, 0.5 및 1.0 밀리몰 GdDOTA 샘플 중 하나, 물 대조군 2개를 수평으로 로드합니다.

두 번째 샘플 세트를 두 번째 60ml 주사기에 로드하여 이 절차를 반복합니다. 각 주사기에 하나의 밀리몰 GdDOTA 용액을 채우고 주사기 팁을 덮습니다. MRI 스캐너에 주사기 중 하나를 수평으로 놓아 샘플이 스캐너에 대해 수직이 되도록 합니다.

주사기를 스캐너 중앙으로 밀어 넣습니다. 해부학적 스캔을 선택하여 자석의 등중심에 주사기를 배치합니다. 그런 다음 신호등 버튼을 눌러 초기 스캔 매개변수를 조정하고 스캔을 시작합니다.

빠르게/느린 각도로 촬영하는 방법을 선택하여 T1 가중치 이미징을 수행하거나 이완 향상을 통한 빠른 획득 방법을 선택하여 T2 가중치 이미징을 수행합니다. 로컬라이저 스캔을 사용하여 수직으로 정렬된 샘플에 대한 관상 절편을 선택합니다. 노이즈 획득 파라미터에 대한 대비를 최적화하고 이미지를 획득합니다.

원형 ROI를 사용하여 배경 및 각 샘플에 대한 평균 신호 진폭과 표준 편차를 확인합니다. 신호 대 잡음 비율을 계산합니다. NMR, MALDI-TOF MS 및 원소 분석은 평균 49개의 거대고리 단위가 G4 PAMAM 수상기에 결합되었음을 나타냅니다.

DCA 용액의 농도와 종방향 및 횡방향 이완 시간도 NMR로 측정되었습니다. 얻어진 이완성 값을 상업적으로 이용 가능하고 임상적으로 사용되는 GdDOTA 단량체와 비교하였다. DCA 성능은 GdDOTA 단량체와도 비교되었습니다.

두 세트의 용액은 공액 거대 고리 단위의 수에 의해 결정된 것과 유사한 가돌리늄 농도를 가졌고 다른 두 세트는 유사한 분자 농도를 가졌습니다. 유사한 가돌리늄 농도를 가진 T1 가중 이미징 실험에서 신호 대 잡음비는 GdDOTA보다 DCA에서 약간 더 높았습니다. 용액의 분자별 농도가 비슷할 때 DCA 신호 대 잡음비는 GdDOTA보다 약 3배 더 컸습니다.

T2 가중 이미징 실험에서 DCA의 신호 대 잡음비는 특히 더 높은 DCA 농도에서 두 농도 쌍 모두에서 GdDOTA의 신호 대 잡음비보다 현저히 낮았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 정제 및 특성화된 덴드리머 기반 MRI 조영제를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 분자의 단위를 수정하여 다양한 유형의 수지상 및 나노 크기의 MRI 조영제를 준비하고 편리하게 분석할 수 있습니다.

이 기술을 마스터한 후 MRI 조영제 개발 분야의 연구원들은 현대 분자 이미징에 매우 중요한 다양한 기능 연구를 수행하기 위해 다양한 특정 프로브를 준비할 수 있어야 합니다.