Name: 인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 학습하세요 인간 전혈에서 NK 세포 수와 세포독성 활성을 유세포 분석으로 빠르고 정확하게 측정하는 방법을. 면역학 연구에 재현 가능한 결과를 제공합니다.

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이 프로젝트는 USDA National Institute of Food and Agriculture의 Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395의 지원을 받았습니다.

참고 : 모든 혈액 수집 절차는 애팔 래 치아 주립 대학 (ASU) 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 규정 된 지침에 따라 실시 하였다. 1. 전체 혈액 컬렉션 <ol><li> 공인 phlebotomist는 세계 보건기구 (WHO)의 가이드 라인에 따라 혈액을 채취 있습니다. </li><li> 디 에틸렌 디아민 산 칼륨을 함유 한 4 mL의 혈관 (K 2 EDTA)으로 혈액을 채취. 제조업체의 지시에 따라 혈관을 전환. 분리 될 때까지 벤치 탑 로커에 실온에서 혈관을 유지합니다. </li></ol> DIO 표지 된 표적 세포의 제조 2 <ol><li> K562 세포의 성장 완료 Iscove 개변 둘 베코 미디어 세포의 상태를 확인하기 위해 검정에 앞서 몇 주 동안 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 (IMDM). 정광을 조정3 × 105 세포로 세포의 이온 / ㎖ 매일 세포의 완료를 통해 카운트 세포 후속 통로. 매 2 ~ 3 일 전체 미디어의 변화를 수행합니다. </li><li> 혈구 1 : 분석 당일 1을 이용하여 세포 수를 수행한다. <ol><li> K562 플라스크에서 10 μL를 제거하고 1.5 mL의 튜브에 배치합니다. </li><li> (1)의 희석 요인에 대해 동일한 1.5 ML 튜브에 트리 판 블루 염료의 10 μL를 추가 : 1. </li><li> 부드럽게 영화 튜브는 K562 세포를 혼합 파란색 염료를 트리 판입니다. </li><li> K562 세포 트리 판 블루 염색은 실온에서 1 분 동안 품어하도록 허용합니다. </li><li> 튜브에서 스테인드 K562 세포의 15 μL를 제거합니다. </li><li> 세포 수에 대한 혈구 상에 피펫. </li><li> 네 모서리의 사각형 셀뿐만 아니라 다섯 제곱의 총 중앙 광장을 계산합니다. </li><li> 식을 이용하여 세포 수를 계산한다 : 총 세포 / ㎖ = 총 세포 계수 X (희석 계수 / 사각형의 수) X 10,000 / mL의 </li></ol> 무 혈청 IMDM 배지에서 1 × 106 세포 / ml의 최종 농도로 재현 탁 K562 표적 세포. </li><li> K562 염색 된 표적 세포를 들어, 10 × 106 K562 세포의 총 1 × 106 세포 / ㎖의 밀도로 한 15 ㎖의 튜브에 K562 표적 세포의 10 mL를 첨가. 사용할 준비가 될 때까지 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에 놓습니다. </li><li> K562 한 15 ㎖의 튜브에 세포를 표적 K562 DIO 염색 된 표적 세포의 경우, 10 × 106 K562 세포의 총 1 × 106 세포 / ㎖의 밀도로 10 mL를 첨가. <ol><li> DIO 염색 부드럽게 소용돌이에 지정된 15 ML 튜브에 세포 현탁액 1 ㎖ 당 1 μL DIO의 셀 라벨 솔루션을 추가합니다. 예를 들어, 1 × 106 세포 / ㎖를 10 × 106 K562 세포 / ml로 DIO 셀 라벨 용액 10 μL를 추가한다. </li><li> 15 ML 튜브에서 5 % CO 2와 37 ° C에서 20 분 동안 품어 K562-DIO 솔루션입니다. </li></ol></li><li> 따르다배양을 보내고, 15ml의 튜브를 포함하는 K562-DIO 용액에 실온 인산 완충 용액 (PBS) 3 ㎖를 추가한다. </li><li> 실온에서 135 XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 1,000 μL 볼륨 조절 피펫 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 세포 펠렛을 함유 15 ML의 튜브에 신선한 IMDM의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 와동 튜브 세포를 재현 탁한다. </li><li> 반복 2.7 2.10에 두 번 더 반복합니다. </li><li> 사용할 준비가 될 때까지 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에 보관 세포. 주 : 세포를 최대 24 시간 동안 인큐베이터에 저장 될 수 있지만, 동일한 날에 이들을 사용하는 것이 바람직하다. </li></ol> 컨트롤 3. 준비 <ol><li> 별도의 적절하게 표시 1.5 ml의 튜브에 다음 이동 : <ol><li> 신선한 IMDM 500 μL 1.5 mL의 관 표시된 "더블 긍정적"으로 K562 세포를 DIO 표지 재현 탁 함유 추가. </li><li> 신선한 IMDM의 500 μL를 추가하면 "만 DIO"로 DIO 표지 K562 세포를 재현 탁 함유하는 1.5 ㎖의 튜브를 표시. </li><li> 에 재현 탁 레이블이없는 K562 세포를 포함하는 신선한 IMDM의 500 μL를 추가 "프로피 디움 요오드 (PI)는 전용"1.5 mL의 튜브를 표시. </li></ol></li><li> 5 분 동안 55 ℃로 물을 욕조에 두 번 양성과 PI 전용 튜브를 놓습니다. </li><li> 5 분 경과 후, 튜브를 제거하고 70 % 에탄올로 닦아. </li><li> 더블 긍정적으로 PI와 PI 1.5 mL의 튜브 (10) L을 추가합니다. </li><li> 30 분 동안 37 ° C의 배양기에서 세 K562 타겟 셀 제어 놓는다. </li><li> 30 분 인큐베이션은 163 x g에서 2 분간 원심 분리 세 K562 타겟 셀 제어 지나면. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 신선한 IMDM 세포 배양액 20 μL 각 제어를 재현 탁하고, 적어도 5 % 이산화탄소로 37 ° C의 배양기에서 떠나최적의 DIO 신호에 대한 30 분. 참고 : 컨트롤 지금 사이토 이미징 흐름을 통해 실행 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. NK 세포 자동 분리 <ol><li> 전지 세퍼레이터를 켜고 시동 사이클을 완료 할 수 있습니다. </li><li> 모든 유체 병 조명이 녹색과 폐기물 병이 비어 있는지 확인합니다. </li><li> 실내 온도 15 ML의 튜브 랙을 얻습니다. 참고 : 선택 샘플 볼륨에 근거한다. 예를 들어, 볼륨 미만 3 ㎖를 15 ㎖의 튜브 랙을 사용하여 볼륨 이상 3 ㎖를 50 ㎖의 튜브 랙을 사용한다. </li><li> 라벨 샘플 튜브를 따라 (샘플 / 참가자마다 반복) : 참가자 1 항목의 혈액 샘플; 참가자 1 음의 부분; 참가자 1 긍정적 인 부분. </li><li> 조심스럽게 "전체 혈액 샘플"15 ㎖의 튜브에 단계 1.2에서 전체 혈액의 1.5 mL를 피펫. </li><li> 단계 4.5에서 적절하게 레이블이 15 mL의 "전체 혈액 샘플"튜브를 삽입하고 15 mL의 "음의 분수"를 표시하고튜브 랙의 단계 4.4에서 "긍정적 인 분수"튜브. 행 (R1) A : : thefollowing 샘플 랙 설정을 사용하여 전체 혈액 샘플, 행 (R2) B : 음, 레이블이없는 부분, 행 (R4) C : 긍정적, 자기 표시된 부분을. </li><li> autolabeling의 MiniSampler 상 분리 랙을 삽입합니다. </li><li> 메뉴에서 "시약"를 선택하고 유리 병은 분리 랙에 위치 할 곳을 강조 표시합니다. </li><li> 2 차원 코드 리더를 활성화하기 위해 "시약 읽기"를 선택합니다. </li><li> 코드 판독기 덮개 0.5-2.5 cm 사이의 2D 코드 리더 앞의 적절한 시약 병을 놓습니다. 참고 : 예를 들면, NK 세포의 분리를 위해 필요한 시약 CD56이다. </li><li> 최적의 판독 용 2D 코드 리더 앞의 각도 시약 병을 잡으십시오. </li><li> 적절한 분리 랙 위치로 시약 병을 놓습니다. </li><li> 화면의 분리 탭에서 원하는 위치를 선택합니다. </li><li> 라벨 하위 메뉴에서 노소를 할당tolabeling 프로그램입니다. </li><li> 위치 1, 2, 3 및 4를 랙에 세포 분리 시약 CD56 마이크로 비드를 할당한다. </li><li> 은 "posselwb"분리 프로그램을 선택합니다. </li><li> 은 "린스"세척 프로그램을 선택합니다. </li><li> 숫자 키패드를 사용하여 "볼륨"하위 메뉴에 1,500 μL의 샘플 볼륨을 삽입합니다. </li><li> 키패드의 "입력"옵션을 선택합니다. </li><li> 세포 분리를 시작합니다 "실행"을 선택합니다. </li><li> 충분한 버퍼의 모든 샘플을 처리 할 수 ​​있습니다 확인 "OK"를 선택합니다. </li></ol> (5) NK 세포 수에 따라 세포 분리 <ol><li> 즉시 세포 분리와 세포 분리에 따라 긍정적 인 부분을 검색 할 수 있습니다. 상온에서 둡니다. 이 부분은 원하는 순수 NK 세포 인구를 포함한다. </li><li> 각 샘플의 경우, 단계 2.2에 따라 혈구를 사용하여 세포 수를 수행합니다. <ol><li> 계산 한 후, 세포 수를 기록한다. </li></ol></li></ol> 6. 세포 독성 분석 샘플 준비 <ol><li> 준비하고 그에 따라 각 샘플 / 참여자 1.5 mL의 튜브 레이블을 붙입니다. </li><li> 피펫 각 튜브에 NK 세포와 DIO-labled K562 세포의 비율을 원하는. 참고 : 예를 들어, 표적 K562 세포 및 NK 효과기 세포의 바람직한 비율은 1 : 5이다. </li><li> 135 X g에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 재현 탁 NK-DIO는 인터루킨 -2 (IL-2) 및 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) (불완전 NK 세포 배양 배지)없이 NK 세포 배지 500 μL의 K562 세포 혼합물 표지. 주 : 불완전 NK 세포 배양 배지가 L- 글루타민, 및 리보 데 옥시 리보 뉴 클레오 시드없이 중탄산 나트륨 필수적인 미디엄 이글 최소이다. </li><li> 각 튜브에 PI의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 163 x g에서 2 분간 원심 분리한다. </li><li> 2 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 2 시간 배양 한 이후, centrifu163 x g에서 2 분간 GE. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 25 μL 불완전 NK 세포 배양 미디어를 Resuspend 세포. </li></ol> 자발적 7. 준비 ( "S") 샘플 <ol><li> DIO 표지 K562 세포 피펫 500 μL 1.5 ㎖의 튜브에 (1 × 106 세포 / ㎖ 농도). </li><li> 각 튜브에 PI의 10 μL를 추가합니다. </li><li> 163 x g에서 2 분간 원심 분리 튜브. </li><li> 2 시간 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 2 시간 배양, 163 x g에서 2 분간 원심 분리를 다음과 같다. </li><li> 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 25 ㎕의 불완전 알파 - 최소 필수 매체 (α-MEM) 세포 배양 배지에 재현 탁 세포. </li></ol> 이미징 플로우 사이토 8. 데이터 수집 <ol><li> 기기를 켭니다 사이토 흐름 이미징의 전면 도어 내부의 녹색 버튼을 누릅니다. </li><li> 알 켭니다이미징과 관련된 리터 컴퓨터는 사이토의 흐름. </li><li> 소프트웨어 사이토 이미징 흐름을 시작합니다. </li><li> 시스템을 세척 및 샘플 라인을 준비하기 위해 "시작"버튼을 클릭합니다. </li><li> "시작"이 완료되면, "교정"창을 닫습니다. </li><li> 채널 할당 : 왼쪽 상단에이를 할당하기 위해서 각각의 채널을 클릭. </li><li> Area_M06 대 원시 최대 픽셀 _MC_6, Area_M02 대 원시 최대 픽셀 _MC_2, AspectRatio_M01 대 Area_M05 및 FieldArea_M01 대 원시 최대 픽셀 _MC_5 : 오른쪽에서 4 산점도를 만들 수 산포도 버튼을 클릭합니다. </li><li> 먼저 "더블 긍정적"컨트롤을 사용하여 샘플을 분석하기 시작합니다. <ol><li> 를 클릭 "로드." </li><li> 샘플 로더에 3.9 단계 3.4에서 "두 번 긍정적"샘플 1.5 ML 튜브를 놓습니다. </li><li> 은 "확대"탭에서 40X 목표를 선택합니다. </li><li> 405 mW의 전원을 켜고642 mW의 레이저. </li><li> 은 "브라이트"채널을 켭니다. </li><li> 를 클릭 "을 선택 강도." </li><li> 검출기가 과부하되지 않도록 "이중 양성"대조 샘플에 기초하여, 405 mW의 레이저의 원하는 강도를 결정한다. 참고 : 예를 들어, 본 실험을위한 최적의 강도가 11 mW에 설정되었다. </li></ol></li><li> 원하는 설정이 달성 된 후, 데이터를 수집. <ol><li> 은 "취득 파일"탭에서 사용자 지정 파일 이름 텍스트를 입력합니다. 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. </li><li> "수집"옆에 취득하는 세포의 수를 입력합니다. 일반적으로이 수는 1 만 1,000 사이 다릅니다. </li><li> 를 클릭 "획득." 주의 : 원하는 셀 번호를 취득하면, 상기 데이터 파일은 자동으로 이전에 선택된 폴더에 저장된다. </li></ol></li><li> 인수가 완료되면, 다음 제어 샘플을로드 - DIO 만 제어합니다. 강한&gt; <ol><li> 를 클릭 "로드." </li><li> 샘플 로더에 "DIO 전용"샘플 1.5 ㎖의 튜브를 놓습니다. </li><li> 선택한 "확대"탭에서 40X 목표를 둡니다. </li><li> 405 mW의 레이저가 켜져 둡니다. </li><li> 642 mW의 레이저와 "브라이트"채널을 끕니다. 주 : 이제 원하는 설정이 달성되었는지, 데이터를 취득 할 수있다. </li><li> 은 "취득 파일"탭에서 사용자 지정 파일 이름 텍스트 입력 및 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 옆에 취득하는 세포의 수를 입력합니다 "수집합니다.". 일반적으로이 번호는 1000입니다. </li><li> 를 클릭 "획득." 주의 : 원하는 셀 번호를 취득하면, 데이터 파일은 자동으로 이전에 선택된 폴더에 저장된다. </li></ol></li><li> 은 "PI 전용"제어 샘플 단계를 반복 8.10. 실험 샘플은 현재 수집 할 준비가 된 것입니다. </li><li> remaini를 처리은 "자발적인 'S'샘플 '다음을 포함하여, 실험 샘플을 NG : <ol><li> 선택한 "확대"탭에서 40X 목표를 둡니다. </li><li> 405 mW의 642 mW의 레이저를 켭니다. </li><li> 은 "브라이트"채널을 켭니다. </li><li> 를 클릭 "설정 강도." </li><li> 은 "취득 파일"탭에서 사용자 지정 파일 이름 텍스트 입력 및 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 사용자 정의 파일 이름 텍스트를 입력합니다. </li><li> 옆에 취득하는 세포의 수를 입력합니다 "수집합니다." </li><li> 은 "획득"버튼을 클릭합니다. 주의 : 원하는 셀 번호를 취득하면, 데이터 파일은 자동으로 이전에 선택된 폴더에 저장된다. </li></ol></li><li> 모든 실험 샘플 단계를 반복 8.12. </li><li> 모든 실험 데이터와 파일을 수집 한 후, 시스템을 소독하기 위해 "종료"버튼을 클릭합니다. </li></ol> 9. Imaging 흐름 사이토 샘플 분석 <ol><li> 분석 소프트웨어 애플리케이션 사이토 촬상 흐름을 연다. </li><li> "파일"에서 실험 .RIF 파일을 엽니 다. </li><li> 선택하여 단일 색상 .RIF 파일을 (DIO 전용 제어 단계 8.10 및 8.11 동안 생성 된 PI 전용 제어)를 사용하여 새로운 매트릭스를 구축 소프트웨어 사이토 이미징 흐름 보상 탭에서 "새 매트릭스 만들기"를 참조하십시오. 참고 : 소프트웨어는 단일 색상 파일의 선택을 묻는 메시지와 매트릭스 파일 (.ctm 파일 확장자)을 만들 병합 것, 즉 채널 보상을 적용하기 위해 선택하는 것입니다. </li><li> 소프트웨어의 "빌딩 블록"기능을 이용하여 도트 플롯을 만든다. <ol><li> 도트 플롯 게이트 (주파수 대 BrightFieldGradient_RMS) 포커스 세포를 만듭니다. 게이트 "초점"(그림 1A)를 호출합니다. </li><li> "포커스 방식"게이트를 사용하면, g에 밝은 필드 화면 비율 대 밝은 필드 지역의 도트 플롯을 만들 중항 세포를 먹었다. 게이트 "싱글"(그림 1B)를 호출합니다. </li><li> 은 "싱글"게이트를 사용 Intensity_MC_Ch5 대 Intensity_MC_Ch02의 도트 플롯을 만들 수 있습니다. 확인하고 게이트 DIO 양성에만 세포 (대상, 살아) 및 PI-DIO (죽은 대상) 더블 양성 세포 (그림 1C)이 플롯을 사용합니다. 주 : 모든 플롯 단계 9.4.1, 9.4.2에 기술 및 9.4.3은 소프트웨어 "빌딩 블록"함수를 이용하여 생성 될 수있다. </li></ol></li><li> 각 게이트의 세포 수에 액세스 할 수 도트 플롯의 통계 기능을 클릭합니다. </li><li> 다음 식을 이용하여 자발 시료에서 죽은 대상 및 실험 시료의 비율을 계산한다 : 샘플 % 죽은 대상은 = (#dead 목표 × 100) / (#는 목표 + #dead 목표를 살) </li><li> 다음 식을 사용하여 세포 독성을 계산한다 : %의 세포 독성 = [(실험 데드 자발적인 죽은) / (100 자발적 죽은)] × 100 </li></ol>1 "&gt; :"유지 - together.within 페이지 = FO "_content <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg"> 그림 1 : 세포 독성 활동 분석을위한 대표 히스토그램, 산점도 및 이미지. (A) 포커스 세포 분석. (B) 단일 세포 분석. (C) 표적 세포 염색 분석. 모든 결정은 각 이벤트에 첨부 된 이미지를 사용하여 제조된다. 이것은 단순히 그래프에서 이벤트를 클릭 분석 소프트웨어에 액세스 할 수있다. 사멸 NK 세포와 라이브 K562 대상을 보여주는 (D)는 이중 이벤트의 대표 이미지. CH01, 브라이트. CH02, DIO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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본 연구에 기재된 방법은 직접 (특히이 경우, 장시간 운동) 자극에 응답하여 개인의 NK 세포의 특이 적 활성을 측정한다. 일반적으로, NK 세포는 마커의 조합을 사용하여 분류 밀도 구배 또는 셀을 사용하여 하나의 혈액으로부터 분리된다. 그들은 시간이 걸리는 다수의 조작을 수반 한 사용자 심하게 의존하는 이러한 방법이 널리 사용되지만, 그들은 여러 단점을 가지고있다. 그 결과, 과도한 스트레스, 또는 동일한 실험에서 실험 실험 증가 변화 될 수있는 격리 된 NK 세포에 배치된다. 본 논문에서는 자기 기반 격리를 사용하는 프로토콜을 설명했다. 혈액 또는 NK 세포의 조작을 최소화하면서이 개인의 전혈에서 NK 세포의 높은 숫자의 신속하고 신뢰성있는 정렬을 허용한다. 이 방법은, 샘플이 드문 드문 인간 연구에 특히 적합하지만,너무 많은 샘플을 함께 처리 할 필요가있을 때 역설적으로의 방법은 매우 어렵다. 실제로 세포 독성 분석을위한 획득 창은 경험에 많아야 한 번에 5 샘플로 변환...

자연 살해 세포는 선천성 면역계의 필수 요소이다. 그들은 매우 조절 동안, 인식하고 세포 간 접촉을 통해 사전 활성화 일없이 비정상 세포를 제거하는 기능을 갖는다. 따라서, 그들은 감염에 대한 방어의 빠른 라인을 형성한다. 특히 심한 운동은, 일시적으로 면역 시스템 2, 3, 4, 5를 누르는 것으로 나타났다. NK 세포가 효과적으로 질병 향상된 감도의 창을 생성이 효과 4, 6, 7, 특히 쉽다. 따라서, 개입의 연구는 전, 중 또는 NK 세포 기능에 미치는 영향을 줄이는 목적으로 강렬한 운동 후하는 운동 선수 후 대회의 복지에 대한 특별한 관심입니다. 8 드물다 1); 2) NK 세포 스트레스에 매우 민감하고 실험 기간 동안 생존하고 안정적으로 유지하는 생리 학적 조건에 노출에 의존하는 상수; 3) 표준 분석은 피콜 구배 9로, NK 세포의 세포 독성을 확인하고 분석 (10)를 해제, 신뢰할 수와 일치하지 않습니다. 인간 샘플의 고유 한 변화는 이들 이슈 인 화합물. 중재 동안에 수집 된 신선한 인간 샘플 적어도 동물 샘플 또는 불멸화 세포주에 비해, 수배 상당히 규제하고 어렵다. 이 실험을 반복하거나 통계적으로 유의 임계 값에 도달하기 위해 연구 코호트에 참가자를 추가 할 수있는 기회를 감소시킨다. 종합적으로, 이러한 문제는 fo를 간소화 할 수있는 프로토콜의 필요성을 지원R 모두 높은 처리량과 인간 시료에서 NK 세포 용균 활성의 높은 신뢰도 분석. 우리는 식별 외부 인자에 대한 노출을 최소화하면서 인간의 전혈로부터 분리하고 시험 NK 세포에 필요한 시간을 단축 워크 플로우를 구축. 감소 또는 NK 세포의 세포 독성의 증가를 검출 할 수 있도록 E 비율 : 상기 방법은 두 기기, 자기 기반의 셀 소터와 사이토 촬상 흐름 및 분석 특정 최적화 T의 사용을 최적화한다.

<table><tbody><tr><td>K-562 림프모세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove의 변형된 Dulbecco's Media</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>고포도당, L-글루타민, HEPES 포함, 멸균 여과</td></tr><tr><td>알파 최소 필수 매체</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드가 없지만 2mM L-글루타민 및 1.5g/L 중탄산나트륨</td></tr> 트리<tr><td>판 블루 용액 0.4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>조직 배양 등급</td></tr><tr><td>프로프리듐 요오드 염색 용액</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO 세포 라벨링 솔루션</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 세척 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 열</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>전혈 CD56 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II 이미징 유세포분석기</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0.4-0.7% 차아염소산염(살균기)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% 이소프로판올(Debubbler)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS(Sheath fluid)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>칼슘 또는 마그네슘 없음</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Version Mark II, 2013년 9월</td></tr><tr><td>아이디어 응용 소프트웨어</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>버전 6.1, 2014년 7월</td></tr></tbody></table>

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK 세포는 NK 세포 독성 세포 기능에 대한 외부 간섭의 영향을 결정하기 위해 널리 사용되는 척도이다. 그러나,이 분석의 정확성 및 재현성 때문에 사용자의 오류로 인해 또는 실험 조작에 NK 세포의 감도 역시 불안정한 것으로 간주 될 수있다. 이러한 문제를 제거하기 위해 최소로 줄여 워크 플로우에 설립되었으며 여기에 표시됩니다. 우리는 선수에서, 다양한 시점에서 혈액 샘플을 얻어 설명하기 위해 (N = 4) 운동의 강렬한 한판 승부에 제출 된 그. 첫째, NK 세포를 동시에 확인하고 직접 전체 혈액에서와 같은 작은 하나 밀리리터에서, CD56 태그 및 자기 기반의 정렬을 통해입니다. 정렬 된 NK 세포는 시약 또는 상한 항체의 제거됩니다. 이들은 혈액 밀리리터 정확한 NK 세포 수를 설정하기 위해 계산 될 수있다. 둘째, 분류 NK 세포 (이펙터 세포 또는 E)를 3,3&#39;- Diotade와 혼합 될 수있다각 이벤트의 시각화 및 위양성의 제거를 허용하는 촬상 유동 세포 계측기를 사용하여 E 비율 분석 : 5 T : cyloxacarbocyanine 과염소산 (DIO)은 분석 최적 1의 K562 세포 (표적 세포 또는 T)를 태그 또는 (예 : 이중선 또는 이펙터 세포와 같은) 위음성. 이 워크 플로는 약 4 시간에 완료, 심지어 인간의 샘플 작업을 매우 안정적인 결과를 허용 할 수 있습니다. 가능한 경우, 연구 팀은 인체에서 여러 가지 실험적인 개입을 테스트, 데이터의 무결성을 손상시키지 않고 여러 시점에 걸쳐 측정을 비교할 수 있습니다.

NK 세포 수의 결정 전혈에서 NK 세포 수 무거운 실행의 효과는도 2에 기재된 운동 프로토콜을 사용하여 측정 하였다. 혈액 샘플은 초기 채혈 후 최종적으로 24, 48 시간을 1.5 시간 운동 후, 즉시 운동 후, 운동 전에 그려진 하였다. 전혈 밀리리터 NK 세포의 농도는 각각의 러너 (도 3A)에 대한 각 타임 포인트에 대한 평균 (도 3b)상에서 측정 하였다. 우리의 결과 (도 3a) 1 2 주자 쇼 4 본 직전 천천히 24 및 48 시간 후에 정상으로 복귀 급감 하였다 운동 후 NK 세포 수의 약간의 증가와 유사한 패턴. 이러한 경향은 특히 주자의 그룹에 대한 NK 세포의 평균 플롯으로 표시가 있지만 유의 한 차이에서 있었...

이 작업은 인간 혈액 샘플에서 NK(Natural Killer) 세포 수와 NK 세포 독성을 정확하고 빠르게 측정하기 위한 고급 워크플로우를 설명합니다.

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

이 실험의 전반적인 목표는 인간 전혈 샘플에서 NK 세포 수와 세포 독성 활성화 수준을 빠르고 신뢰할 수 있으며 안정적인 방식으로 측정하는 것입니다. 이 방법은 NK 세포의 생체 활성에 대한 외부 개입의 영향과 같은 면역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 정확하면서도 실험 전반에 걸쳐 재현 가능한 결과를 제공한다는 것입니다.인간 전혈에서 NK 세포를 분리하기 위해 먼저 Whole blood sample, Negative Fraction 및 Positive Fraction이라고 표시된 15ml 튜브를 세포 분리기 튜브 랙의 적절한 위치에 배치합니다. 모든 튜브가 로드되면 자동 라벨링을 위해 분리기 랙을 미니 샘플러에 삽입하고 메뉴에서 시약을 선택하여 바이알이 랙에서 배치될 위치를 강조 표시합니다. Read Reagent를 선택하여 2D 코드 리더를 활성화하고 코드 리더 커버에서 0.5-2.5cm 각도로 2D 코드 리더 앞에 적절한 시약 바이알을 놓습니다.판독 바이알을 적절한 분리기 랙 위치에 놓습니다. 그런 다음 분리 탭에서 원하는 위치를 강조 표시합니다. 그런 다음 레이블 지정 하위 메뉴를 열고 자동 레이블 지정 프로그램을 선택합니다.세포 분리 시약 마이크로비드를 랙 위치 1, 2, 3 및 4에 할당합니다. 그리고 Posselwb separaton 프로그램을 선택합니다. 헹굼 세척 프로그램을 선택합니다.Volume 하위 메뉴에서 Sample Volume에 대해 1500 microliters를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 그런 다음 실행을 클릭하여 셀 분리를 시작합니다. 확인을 클릭하여 모든 샘플을 처리하는 데 사용할 수 있는 버퍼가 충분한지 확인합니다.세포독성 분석 샘플을 준비하려면 먼저 각 샘플 및/또는 참가자에 대해 1.5ml 튜브를 적절하게 라벨링하고 NK 세포와 DIO 라벨링된 K562 세포의 원하는 비율을 각 튜브에 파이프로 추출합니다. 원심분리로 세포를 모으고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 세포 혼합물을 500마이크로리터의 불완전한 NK 세포 배지에 재현탁시키고 각 튜브의 세포를 5마이크로리터의 프로피듐 요오드화물로 라벨링합니다.다른 원심분리를 통해 세포를 수집하고 도태 배양을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 동일한 원심분리 조건에서 세포를 원심분리하고 펠릿을 25마이크로리터의 새로운 불완전 NK 세포 배양 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석으로 세포를 분석하려면 먼저 이미징 유세포 분석기 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 시스템을 플러시합니다.다음으로, 산점도 버튼을 클릭하여 4개의 산점도를 생성하고 이중 양성 대조 튜브를 로드합니다. 이중 양성 대조군 샘플을 사용하여 검출기에 과부하가 걸리지 않도록 405 밀리와트 레이저에 대해 원하는 강도를 결정하고 적절한 수의 세포 수를 획득하도록 이미저를 설정합니다. 405 milliwatt 레이저를 DIO와 PI 검출에 적합한 강도로 설정하려면 염료와 유세포 분석기의 검출 범위에 대한 경험이 필요합니다.이중 양성 대조군 샘플의 획득이 완료된 후 DIO 전용 대조군 샘플을 로드하고 40X 대물렌즈를 선택한 다음 642밀리와트 레이저와 명시야 채널을 끕니다. 적절한 수의 세포를 사육하고 프로피듐 요오드화물 전용 샘플에 대해 수집을 반복합니다. 모든 제어 샘플이 실행되면 405밀리와트 레이저와 명시야 채널을 다시 켜고 강도 설정을 클릭합니다.그런 다음 File Acquisition 탭에서 사용자 지정 파일 이름을 입력하고 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 다음으로 획득할 셀의 수를 입력합니다. 첫 번째 실험용 샘플 튜브를 로드하고 Acquire 버튼을 클릭합니다.모든 샘플이 실행되면 이미징 유세포 분석기 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 열고 단일 실험용 RIF 파일을 엽니다. 보정 탭에서 새 매트릭스 만들기를 선택합니다. 소프트웨어는 단일 색상 파일을 선택하라는 메시지를 표시하고 이를 병합하여 채널 보정을 적용하기 위해 선택할 매트릭스 파일을 생성합니다.빌딩 블록 기능을 사용하여 적절한 점도표를 설정합니다. 그런 다음 통계 기능을 클릭하여 각 게이트의 셀 번호에 액세스합니다. 이 대표적인 실험에서는 표시된 대로 혈액 샘플을 채취하고 각 주자에 대해 전혈 1밀리리터당 NK 세포의 농도를 측정하고 각 시점에 대해 평균적으로 측정했습니다.4명의 주자 중 3명은 운동 후 NK 세포 수가 비슷하게 약간 증가한 것으로 나타났습니다. 그 직후 급격한 감소가 이어지며 이벤트가 끝난 후 24-48시간 후에 천천히 정상으로 돌아옵니다. 평균적으로 NK 세포 수는 운동 후 1.5시간 후에 감소했지만 24시간 후에는 거의 정상 수준으로 돌아왔습니다.세포 수를 계산한 후 NK 세포의 세포독성 활성을 방금 설명한 대로 즉시 분석했으며, NK 세포의 세포독성은 운동 종료 후 1.5시간 후에 평균 감소했으며, 운동 후 24시간까지 크게 증가했습니다. NK 세포독성은 운동 전 수준에 비해 유의하지는 않지만 높은 수준을 유지했습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 약 4시간 안에 완료할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 재현 가능한 하이드로픽 방식으로 인간 혈액 샘플에서 NK 세포 수와 세포 독성 활성을 얻고 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 형광으로 염색된 표적 세포에 대한 자연 살해 세포의 용해 활성을 보여줍니다. 이 방법은 죽은 세포를 염색하고 유세포 분석기를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 표적 세포를 정량화함으로써 NK 세포 유도 세포 독성을 측정할 수 있습니다.

유세포 분석을 위한 Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay 시료 전처리

이 비디오는 표적 암세포에 대한 자연살해(NK) 세포의 세포독성을 결정하기 위해 젖산 탈수소효소 방출 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이 분석은 형성된 붉은 색 생성물의 흡광도를 측정하여 암세포에서 세포질 젖산 탈수소효소의 방출을 정량화합니다.

암세포에 대한 자연살해세포독성 평가를 위한 체외 분석

이 프로토콜은 민감한 세포 기반 세포 독성 분석을 설명합니다. 이 분석은 effector CD8+ T 세포의 수가 증가할 때 살아있는 표적 CD4+ T 세포의 빈도 감소를 열거함으로써 항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포 용해 활성을 직접 평가할 수 있습니다.

세포독성 활성을 측정하기 위한 세포 기반 유세포 분석 분석

간단하고 신뢰할 수있는 방법은 상이한 NK 세포의 서브 세트 내의 탈과립, 사이토 카인 및 케모카인 생산 등의 NK 세포의 기능 세트를 분석하기 위해 여기에 설명된다.

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

양적 인간의 자연 킬러 세포의 세포 독성 활동을 결정 하는 흐름 cytometry 기반 방법은 여기에 표시 됩니다.

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

암세포에 의한 자연살해(NK) 세포 매개 박멸의 회피는 암 개시 및 진행에 중요하다. 여기에서, 우리는 간 종양 세포를 향해 NK 세포 매개 세포 독성을 평가하기 위하여 2개의 비 방사능 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다. 또한 NK 세포 마이그레이션을 분석하기 위해 세 번째 프로토콜이 제시됩니다.

간 종양 세포의 맥락에서 자연 킬러 세포 매개 세포 독성 및 이동의 측정

인간 자연 킬러 세포에서 치료 항체에 의한 FcγRIIIa 구동 이벤트를 연구하기 위한 프로토콜이 여기에 설명되어 있다. 이 인공 자극 플랫폼은 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 디그라니션, 케모킨/사이토카인 생성, 시그널링 경로 와 같은 다운스트림 이펙터 기능의 심문을 허용합니다.

치료 항체의 존재에 FcγRIIIa 참여에 의해 구동 인간 자연 킬러 세포 이벤트의 평가

본 논문에서, 우리는 말초 혈액에서 분리된 1 차적인 인간 자연 킬러 (NK) 세포에 있는 글리코리시스 및 미토콘드리아 호흡을 측정하는 방법을 기술합니다, 휴식 또는 IL15 유도된 활성화에 따라. 설명된 프로토콜은 다른 사이토카인 또는 수용성 자극에 의해 활성화된 1차 인간 NK 세포로 쉽게 확장될 수 있었다.

인간 자연 킬러 세포 대사의 분석

이 프로토콜은 렌즈가 없는 섀도우 이미징 기술을 사용하여 자연 살해(NK) 세포 수 및 활성의 신속한 단일 세포 분석을 위한 무표지 방법을 설명합니다. 이 방법은 회절 패턴의 컴퓨터 분석을 통해 개별 NK 세포의 형태학적 변화를 정량화합니다.

자연 살해 세포 활성화의 신속한 무표지 분석을 위한 현장 배치 가능한 렌즈 프리 이미징 플랫폼

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

학습하세요 인간 전혈에서 NK 세포 수와 세포독성 활성을 유세포 분석으로 빠르고 정확하게 측정하는 방법을. 면역학 연구에 재현 가능한 결과를 제공합니다.

인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

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