인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석

이 실험의 전반적인 목표는 인간 전혈 샘플에서 NK 세포 수와 세포 독성 활성화 수준을 빠르고 신뢰할 수 있으며 안정적인 방식으로 측정하는 것입니다. 이 방법은 NK 세포의 생체 활성에 대한 외부 개입의 영향과 같은 면역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 정확하면서도 실험 전반에 걸쳐 재현 가능한 결과를 제공한다는 것입니다.

인간 전혈에서 NK 세포를 분리하기 위해 먼저 Whole blood sample, Negative Fraction 및 Positive Fraction이라고 표시된 15ml 튜브를 세포 분리기 튜브 랙의 적절한 위치에 배치합니다. 모든 튜브가 로드되면 자동 라벨링을 위해 분리기 랙을 미니 샘플러에 삽입하고 메뉴에서 시약을 선택하여 바이알이 랙에서 배치될 위치를 강조 표시합니다. Read Reagent를 선택하여 2D 코드 리더를 활성화하고 코드 리더 커버에서 0.5-2.5cm 각도로 2D 코드 리더 앞에 적절한 시약 바이알을 놓습니다.

판독 바이알을 적절한 분리기 랙 위치에 놓습니다. 그런 다음 분리 탭에서 원하는 위치를 강조 표시합니다. 그런 다음 레이블 지정 하위 메뉴를 열고 자동 레이블 지정 프로그램을 선택합니다.

세포 분리 시약 마이크로비드를 랙 위치 1, 2, 3 및 4에 할당합니다. 그리고 Posselwb separaton 프로그램을 선택합니다. 헹굼 세척 프로그램을 선택합니다.

Volume 하위 메뉴에서 Sample Volume에 대해 1500 microliters를 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 그런 다음 실행을 클릭하여 셀 분리를 시작합니다. 확인을 클릭하여 모든 샘플을 처리하는 데 사용할 수 있는 버퍼가 충분한지 확인합니다.

세포독성 분석 샘플을 준비하려면 먼저 각 샘플 및/또는 참가자에 대해 1.5ml 튜브를 적절하게 라벨링하고 NK 세포와 DIO 라벨링된 K562 세포의 원하는 비율을 각 튜브에 파이프로 추출합니다. 원심분리로 세포를 모으고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 세포 혼합물을 500마이크로리터의 불완전한 NK 세포 배지에 재현탁시키고 각 튜브의 세포를 5마이크로리터의 프로피듐 요오드화물로 라벨링합니다.

다른 원심분리를 통해 세포를 수집하고 도태 배양을 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 동일한 원심분리 조건에서 세포를 원심분리하고 펠릿을 25마이크로리터의 새로운 불완전 NK 세포 배양 배지에 재현탁합니다. 유세포 분석으로 세포를 분석하려면 먼저 이미징 유세포 분석기 소프트웨어의 시작 버튼을 클릭하여 시스템을 플러시합니다.

다음으로, 산점도 버튼을 클릭하여 4개의 산점도를 생성하고 이중 양성 대조 튜브를 로드합니다. 이중 양성 대조군 샘플을 사용하여 검출기에 과부하가 걸리지 않도록 405 밀리와트 레이저에 대해 원하는 강도를 결정하고 적절한 수의 세포 수를 획득하도록 이미저를 설정합니다. 405 milliwatt 레이저를 DIO와 PI 검출에 적합한 강도로 설정하려면 염료와 유세포 분석기의 검출 범위에 대한 경험이 필요합니다.

이중 양성 대조군 샘플의 획득이 완료된 후 DIO 전용 대조군 샘플을 로드하고 40X 대물렌즈를 선택한 다음 642밀리와트 레이저와 명시야 채널을 끕니다. 적절한 수의 세포를 사육하고 프로피듐 요오드화물 전용 샘플에 대해 수집을 반복합니다. 모든 제어 샘플이 실행되면 405밀리와트 레이저와 명시야 채널을 다시 켜고 강도 설정을 클릭합니다.

그런 다음 File Acquisition 탭에서 사용자 지정 파일 이름을 입력하고 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다. 다음으로 획득할 셀의 수를 입력합니다. 첫 번째 실험용 샘플 튜브를 로드하고 Acquire 버튼을 클릭합니다.

모든 샘플이 실행되면 이미징 유세포 분석기 분석 소프트웨어 응용 프로그램을 열고 단일 실험용 RIF 파일을 엽니다. 보정 탭에서 새 매트릭스 만들기를 선택합니다. 소프트웨어는 단일 색상 파일을 선택하라는 메시지를 표시하고 이를 병합하여 채널 보정을 적용하기 위해 선택할 매트릭스 파일을 생성합니다.

빌딩 블록 기능을 사용하여 적절한 점도표를 설정합니다. 그런 다음 통계 기능을 클릭하여 각 게이트의 셀 번호에 액세스합니다. 이 대표적인 실험에서는 표시된 대로 혈액 샘플을 채취하고 각 주자에 대해 전혈 1밀리리터당 NK 세포의 농도를 측정하고 각 시점에 대해 평균적으로 측정했습니다.

4명의 주자 중 3명은 운동 후 NK 세포 수가 비슷하게 약간 증가한 것으로 나타났습니다. 그 직후 급격한 감소가 이어지며 이벤트가 끝난 후 24-48시간 후에 천천히 정상으로 돌아옵니다. 평균적으로 NK 세포 수는 운동 후 1.5시간 후에 감소했지만 24시간 후에는 거의 정상 수준으로 돌아왔습니다.

세포 수를 계산한 후 NK 세포의 세포독성 활성을 방금 설명한 대로 즉시 분석했으며, NK 세포의 세포독성은 운동 종료 후 1.5시간 후에 평균 감소했으며, 운동 후 24시간까지 크게 증가했습니다. NK 세포독성은 운동 전 수준에 비해 유의하지는 않지만 높은 수준을 유지했습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 약 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 재현 가능한 하이드로픽 방식으로 인간 혈액 샘플에서 NK 세포 수와 세포 독성 활성을 얻고 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.