Name: 3D 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 MRI를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 학습하세요 3D 인쇄 기술을 활용하여 MRI와 조직학 단면을 정밀하게 정렬하는 방법을. 말모셋 뇌 조직을 대상으로 한 이 프로토콜은 방사선학-조직병리학적 상관관계 분석에 활용됩니다.

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NINDS의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)이 이 연구를 지원했습니다. NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility에 감사드립니다. 사후 MRI 촬영에 도움을 주신 Jennifer Lefeuvre와 Cecil Chern-Chyi Yen에게 감사드립니다. 3D 프린팅에 도움을 주신 John Ostuni와 Section on Instrumentation Core Facility에 감사드립니다. 이 작업의 그림 1은 3D-CoForm 프로젝트의 지원으로 개발된 도구인 MeshLab의 스냅샷을 사용했습니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 MRI 및 조직학 섹션 사이의 정확한 비교를 할 수 있습니다. 프로토콜은 이러한 마모 셋 또는 설치류 사람이나 작은 동물의 뇌에 적용 할 수있는 통합 된 형식으로 제공된다. 대형 (인간)에 대한 구체적이고 두뇌가 강조된다 (인간이 아닌 영장류와 설치류) 작은 및 첨부 된 비디오와 그림의 차이는 우리는 비단 원숭이에서 응용 프로그램을 보여줍니다. 접근 방법은 간단하지만,이 방법은 여러 단계뿐만 아니라 여러 종류의 소프트웨어의 사용을 요구한다. 또한, 잠재적으로이 방법의 정확도에 영향을주는 여러 가지 문제를 언급하는 것이 중요하다. 생체 MRI의 화질은 중요한 인자이다. MRI 디지털화 조직학 이미지 간의 이미지 해상도에서의 차이를 최소화하기 위해 가능한 한 작은 MRI 복셀의 크기가 사용되어야한다. 이 개념은 또한 사후 MRI의 화질에 적용된다. 증가하는 동안사후 MRI에서의 획득 시간이 제제는 기포 관련된 초점 신호 끊김 같은 이미지 아티팩트들을 도입 할 수있다, 더 높은 이미지 해상도를 허용한다. 이러한 아티팩트는 조직 영역을 모호뿐만 아니라 형상에 영향을 미칠 수있다. 또한, 사후 MRI에서 조직의 크기는 정착 과정 및 시간에 의해 영향을받을 가능성이 높다. 생체 내 생체 MRI 경기에 밀접 취득 중에 조각 형상 설정의 해부학 적 구조를 이용하여 근사화 될 수 있지만, 비선형 등록이 여전히 두 MRI 이미지 매칭 정밀도 높은 수준에 도달 할 필요가있을 것이다. 뇌 홀더와 슬라이서의 설계는 중요한 단계이다. 뇌의 디지털 모델을 만들 때, 평활 알고리즘은 다소 고정 뇌 모델 상대를 확대하는 것이 적용된다. 이 홀더 및 슬라이서로 뇌를 쉽게 삽입 할 수 있습니다 홀더에 날카로운 모서리를 줄여 &amp;# 39;의 윤곽. 모델이 너무 클 경우 (예 : 5 % 이상), 뇌 MRI는 사후 및 / 또는 단면 동안 이동할 수있다. 또 다른 중요한 점은 소뇌 제대로 인쇄 3D 객체 내부에 배치되도록 뇌 모델의 설계를 적용하는 것이다. 소뇌가 부검 뇌에서 추출 중에 손상된 경우가 특히 어려울 수있다. 뇌 슬라이서 홀더를 인쇄 할 때, 3 차원 프린터 유형은 신중하게 선택되어야한다. 일부 다중 - 제트 프린터는 지지체 물질을 제거하기 위해 오븐을 이용하여 후 처리를 필요로한다. 이 프린터는 방수 및 데스크톱 융합 증착 모델링 (FDM) 프린터보다 상대적으로 내구성이 객체를 생성 할 수 있지만, 가열 공정은 뇌의 윤곽에 완벽하게 수직하지 않은 블레이드 격차를 작성, 약간 상자를 워프 할 수 있습니다 지원을 제거합니다. 뇌 절편 과정은 또 다른 중요한 단계입니다. 일을 절단하기 전에전자 석판으로 전체 뇌, 뇌가 뇌 슬라이서 내부에 단단하게 앉아 있는지 확인하는 것이 중요하다 : 약간의 압력이 뇌에 적용되는 어떤 움직임이 없어야합니다. 이로써 블레이드 연구자에 의해 설정된 위치에서 정확하게 뇌을 극복 할 수 있도록한다. 절단시 연속, 균형 잡힌 압력이 모두 블레이드 홀더 적용해야합니다. 블레이드의 선명도 및 조직의 강성에 따라 약간의 횡 절단 동작 평면 절단면을 유지하는데 바람직 할 수있다. 파라핀 매립 공정은 MRI 및 조직학 간의 오정렬의 원인이 될 수있다. 티슈 슬래브 매립 과정 카세트에 평평 앉아 있지 않으면, 마이크로톰의 절단면 및 슬래브의 표면 위치 사이의 기울기가있을 것이다. 이것은 모든 조직이 노출 된 평면을 찾을 수 없게 부분 절단이 필요하다. 틸트를 보정하는 한 가지 방법높은 등방성 해상도 사후의 MRI에서 보는면의 각도를 변경하는 것이다. 그러나, 이것은 일반적으로 이방성 해상도 (일반적으로 관상 슬라이스 두께)로 취득한 생체 MRI에서 수행하는 것은 거의 불가능하다. 마지막으로, 조직뿐만 아니라 (주름, 균열, 접이식) 슬라이드의 제조 동안 포르말린 고정 파라핀 기간 임베딩 (수축) 중 일부의 변형이 발생할 수있다. 이러한 변형 중 일부는 슬라이드 상에 전송하기 전에 수욕에서 4-5 ㎛의 섹션을 바꾸어 보정 될 수있다. 다른 변형 부분적 사후 MRI 이미지 조직학 디지털화 된 이미지의 변형 화상 coregistration를 수행함으로써 해결 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 신중하고 숙련 된 연습과 변형을 최소화하는 섹션을 조직학하기 위해 MRI 볼륨을 일치에 가장 효과적인 방법이다. 결론적으로, 여기에 소개 된 방법은 INV 수 있습니다estigators 정확하게 MRI 소견의 기본 병리를 평가합니다. 보다 일반적으로, 그것은 식별 및 / 또는 염증이나 재유 수화와 같은 특정 병리학 적 프로세스를 대상으로 조사 연구를위한 새로운 MRI 바이오 마커를 검증하기위한 유망한 방법이다.

생체 내 MRI는 거시적 수준에서 조직 무결성에 대한 비침습적이고 민감한 측정을 제공합니다. 생체 내에서 관찰되는 MRI 신호 강도의 변화는 현재 진행 중인 많은 임상 시험에서 결과 측정입니다. 1 MRI를 통해 보이는 강도 변화는 전체 뇌의 맥락에서 이상 영역을 식별할 수 있지만, 병리학적 과정을 구별할 만큼 충분히 특이적이지 않은 경우가 많습니다. 이것은 특히 여러 병리학을 포함하는 동적 과정에 해당됩니다. 예를 들어, 다발성 경화증(MS) 또는 그 동물 모델에서는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE), 염증, 부종, 미엘린 분해, 축삭 파괴, 신경교증 및 신경 세포 사멸이 겹칩니다. 2, 3 기저 병리학에 대해 필요한 특이성을 얻으려면 MRI로 식별된 비정상 조직의 조직학에 대한 지식과 함께 컨텍스트를 고려해야 합니다.
그러나 잘 통제된 동물 실험에서도 조직학을 생체 내 MRI와 일치시키는 것은 여러 가지 이유로 근본적으로 어렵습니다. 첫째, 조직학 절편과 MRI 사이의 차원 척도의 차이는 몇 자릿수의 크기입니다. 4 둘째, 적절한 비교를 위해 MRI 절편 평면의 방향은 절단 시 뇌 조직의 절단면과 일치해야 합니다. 뇌의 모양으로 인해 뇌가 평평한 표면에 있을 때 일관되게 직선적이고 정확하게 절단하는 것은 매우 어렵습니다. 셋째, 잠재적으로 작은 관심 영역(병변, 종양 등)에 비해 뇌의 크기가 크면 병리학자가 조직을 처리하는 데 "건초더미 속의 바늘" 시나리오가 생성됩니다. 넷째, 표적 조직이 발견되더라도 일반적으로 원본 MRI 데이터와의 연관성을 사실상 불가능하게 만드는 방식으로 처리됩니다. 마지막으로, 뇌 조직의 전통적인 병리학적 절편은 종종 부정확하고 일관성이 없어 조직학적 절편과 MRI 이미지 간의 비교를 더욱 복잡하게 만듭니다. 
 이러한 문제를 극복하기 위한 이전의 시도는 변형 알고리즘을 사용하여 데이터를 공동 등록하거나 조직 내부 또는 주변에 기준으로 기준 마커를 배치하는 데 의존했습니다. 5, 6, 7, 8 전자의 접근 방식은 데이터 형식, 이미징 아티팩트 및 조직 처리로 인한 변화로 인해 합병증에 특히 취약한 복잡한 계산 모델을 필요로 합니다. 4 반면에, 후자의 접근법은 조직 자체를 오염시키거나 달리 해를 끼칠 가능성을 내포한다. 9 개
여기에 설명된 접근 방식은 생체 내 MRI와 조직학 사이의 격차를 해소하기 위해 사후 MRI를 사용하여 양식 간의 전환을 개선합니다. 사후 MRI는 생체 내에서 달성할 수 있는 것보다 더 높은 해상도로 뇌의 3차원(3D) 이미지를 제공하며, 더 나아가 형태학적으로 정확한 뇌 표면 모델을 생성하는 데 필요한 데이터를 제공합니다. 그런 다음 이 디지털 모델을 사용하여 뇌를 위한 3D 프린팅 맞춤형 홀더를 만들 수 있습니다. 브레인 홀더는 신중한 위치 지정을 통해 MRI 중심의 정밀한 뇌 절편을 가능하게 하여 복잡한 수학적 알고리즘의 필요성을 줄이고 표적 샘플링을 위해 특정 영역에 집중할 수 있습니다. 
우리 연구실은 최근 인간10 및 마모셋 뇌에 대한 사후 MRI 및 3D 프린팅 기술을 사용하여 맞춤형 뇌 홀더 및 슬라이서를 만드는 새로운 방법을 도입했습니다. 4 이 두 가지 방법을 통해 연구 환경에서 MRI와 조직학 간의 보다 정확한 상관관계를 확인할 수 있으며, 궁극적으로 MRI 이상의 기저에 있는 특정 병리학을 더 깊이 이해할 수 있습니다. 생체 내에서 시간이 지남에 따라 뇌를 반복적으로 샘플링하는 신중하게 설계된 실험은 병리학 해석을 위한 맥락을 제공할 수 있으며, 이는 다시 MRI 해석에 특이성을 더할 수 있습니다. 여기에서는 인간이 아닌 영장류, 설치류 또는 인간에서 파생된 모든 뇌 조직에 적용할 수 있는 통합된 프레임워크에서 수정된 프로토콜을 제시합니다. 마모셋 단면화에 대한 자세한 지침과 해당 비디오를 제공합니다. 전체 프로토콜은 모든 유형의 뇌에 적용되지만, MRI 획득 및 조직 크기의 차이와 특정 뇌 유형을 다룰 때 직면하는 문제로 인해 처리되는 뇌의 유형에 따라 접근 방식에 약간의 차이가 있습니다. 이 프레젠테이션에서 "human"이 포함된 섹션은 인간 뇌에 특화된 프로토콜의 차이를 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>7T/30cm USR AVIII Bruker MRI</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>38mm Bruker Biospin 볼륨 코일</td><td>Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fomblin</td><td>Solvay Solexis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 팔콘 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 멸균</td><td>코닝</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 거즈 스폰지</td><td>Fisher Scientrific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 다목적 실험실 필름</td><td>Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica RM2235 로터리 마이크로톰&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 일회용 블레이드, 로우 프로파일 (819)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate, 0.1% 수성</td><td>전자 현미경 과학</td><td>26089-01</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue, 95% 알코올</td><td>전자 현미경 과학</td><td>0.1</td><td></td>%</tr><tr><td>ETOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2 확장&nbsp;</td><td>Ultimaker.75</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kg 공식 Ultimaker 브랜드 PLA&nbsp; 필라멘트, 2.85mm, 실버 메탈릭</td><td>Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 (블루 에디션)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Netfabb Professional 5.0.1</td><td>Netfabb</td><td>http://www.netfabb.com/professional.php</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer 10.9.332</td><td>Autodesk</td><td>http://www.meshmixer.com/download.html</td><td></td></tr><tr><td>Mipav 7.2</td><td>NIH CIT</td><td>http://mipav.cit.nih.edu</td><td></td></tr><tr><td>Cura</td><td>Ultimaker</td><td>https://ultimaker.com/en/products/cura-software</td><td></td></tr></tbody></table>

3d 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 mri를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

MRI(Magnetic Resonance Imaging)는 전체 조직 부피를 3차원으로 샘플링하여 거시적 규모로 정상 조직과 비정상 조직을 구분할 수 있습니다. MRI는 조직 이상을 감지하는 데 매우 민감한 도구이지만, 신호 변화와 근본적인 병리학적 과정의 연관성은 일반적으로 간단하지 않습니다. 예를 들어, 중추 신경계에서 염증, 탈수초화, 축삭 손상, 신경교증 및 신경 세포 사멸은 모두 MRI에서 유사한 소견을 유도할 수 있습니다. 따라서 MRI 스캔의 해석은 상황에 따라 달라지며, 따라서 방사선학적-조직병리학적 상관관계가 가장 중요합니다. 불행히도, 뇌 조직의 전통적인 병리학적 절편은 종종 부정확하고 일관성이 없기 때문에 조직학적 절편과 MRI의 비교가 복잡합니다. 이 논문은 영장류의 뇌 조직을 정확하게 절단하여 조직학과 MRI를 정확하게 일치시킬 수 있는 새로운 방법론을 제시합니다. 이 기사에 설명된 자세한 프로토콜은 연구자가 3D 프린팅 뇌 슬라이서 제작에 의존하는 이 방법을 적용하는 데 도움이 될 것입니다. 약간 수정하면 인간을 포함한 다른 종의 뇌에 쉽게 구현할 수 있습니다.

이 방법의 흐름은 뇌가 분리되면, 슬래브의 표면면의 MR 이미지 및 이미지와 시각적으로 비교하여 여러 석판 걸쳐 양호한 방향이 일치 (도 2)을 나타낸다도 1에 요약 하였다. 슬래브는 파라핀에 포함 된 후, 그들은 마이크로톰에 절단 및 스테인드된다. 높은 해상도 사후 MRI와 스테인드 조직학 섹션 사이의보다 철저한 비교는 비단 원숭이 뇌의 모든 구조에서 정확하고 일관된 경기 (그림 3)를 보여줍니다. MS이 동물 모델에서, 동물 뇌 백색질 퍼져 백질 병변을 개발한다. 이러한 병변은 MRI를 수행하여 비 침습적으로 검출 할 수있다. 도 4는 MRI 소견 병리학 기판 해명이 기술의 능력을 보여준다. 생체 내 MRI에서 발견 된 작은 병변 수사후 MRI 및 조직학 모두 추적 할 수. 인 세트에 도시 된 바와 같이, 병변 내 탈수 초화는 (주변 조직에 비해 hyperintensity)이 MR 신호 변화를 주도 주요 구성 요소 중 하나이다. 조직학 및 사후 MRI는 생체 내 MRI (그림 4)에서 놓친 병변을 표시 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig1.jpg" /> 비단 원숭이의 뇌 슬라이서 상자를 만드는 1. 워크 플로우 그림. 뇌는 포르말린 (A1)과 T2 강조 MRI는 에지 당 150 μm의 (A2)의 등방성 복셀로 취득으로 고정되어있다. 이미지 처리 및 바이너리 마스크 (A3)을 만들 임계 된 있습니다. 표면이어서 3D 모델링 소프트웨어 (A4)에 렌더링된다. 슬라이서 템플릿과 뇌 모델 사이의 부울 뺄셈은 뇌 슬라이서 (B1)의 디지털 모델을 생성합니다. 뇌 슬라이서 상자는 3D 프린터 (B2)에 인쇄되어 있습니다. 뇌는 다음 슬라이서 상자에 단단히 배치절단 (B3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig2.jpg" /> 그림 2.에서 왼쪽에서 오른쪽으로 : 생체 내 MRI, 사후 MRI, 조직 슬래브 사진. 슬라이싱 평면은 대응하는 생체 MRI 슬라이스 (A)에 비해 시각적 사후 MRI (B)에 기초하여 설정 하였다. 뇌 후 절단하고, 얻어진 슬래브 일관성 (C) 인 것으로 밝혀졌다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig3.jpg" /> 그림 3. 고해상도 사후의 MRI 및 조직학부분 일치. 슬래브는 4 μm의 섹션으로 마이크로톰 절단, 빠른 파란색과 크레 실 바이올렛 (B)로 염색, 파라핀에 포함되었다. 섹션은 다음 시각적으로 100 μm의의 T2 * 뇌 구조 (A)에 따라 MRI -weighted와 일치 하였다. 이 이미지를 획득하기위한 세부 사항은 프로토콜 및 표 1. 뇌 구조의 보조 섹션에서 : (1) 빨간색 화살표 = 내부 캡슐, 파란색 화살표 = 전방 접합면; (2) 빨간색 화살표 = 피질, 파란색 화살표 = 광학 기관; (3) 빨간색 화살표 = 미상, 파란색 화살표 = 해마; (4) 빨간색 화살표 = 뇌량, 파란색 화살표 = 대뇌 말라; (5) 빨간색 화살표 = 열등 둔덕, 파란색 화살표 = 피라미드 기관. B1의 점선 박스는 하나의 뇌 절단 또는 파라핀 매립 중에 에러가 좌측 전방 접합면의 불일치로 이어지는 상기 Y 축을 중심으로 약간 회전 의한 슬라이스를 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig3large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54780/54780fig4.jpg" /> 그림 4. 조직 학적 섹션으로 생체 내 MRI에서 병변을 추적. 생체 내 MRI 중 하나 광학 기관 (A1)의 병변을 제안하는 이상 hyperintensity 신호의 더 설득력있는 증거가 없었다. 그러나, 높은 해상도 사후의 MRI는 모두 광학 책자 (A2)의 명확한 하이퍼 강렬한 라인을 보여줍니다. 4 μm의 조직 학적 섹션의 빠른 블루 / 크레 실 바이올렛 얼룩은 생체 MRI에 본 hyperintense의 영역 (A3)을 탈수 초 것을 보여줍니다. 대뇌 백질에서, 생체 내 MRI 미묘한 양자 hyperintensity (B1, 인 세트의 확대)를 보여줍니다. hyperintense 지역은 높은 해상도 사후 MRI (B2)에 대한 명백하다. 4 μm의 조직 학적 섹션의 LFB 염색이 영역 (B3)를 탈수 초 것을 보여줍니다. 기준 I와 비교 한 후N 생체 MRI 및 hemotoxylin - 및 - 에오신 염색, 우측은 해부학 적 이상이 아닌 탈수 초 병변 인 것으로 측정되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54780/54780fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="기업 코드 파일" src="/files/ftp_upload/54780/54780supplementalfiles.jpg" /> 기업 코드 파일. Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> Brain_Slicer_Parts_Human.stl : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Brain_Slicer_Parts_Human.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> Cap_Insert.stl : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54780/Cap_Insert.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜의 전반적인 목적은 정확하게 정의 된 3D 인쇄 뇌 홀더 및 슬라이서 박스의 생성을 통해 조직학 섹션 자기 공명 영상 (MRI) 이미지 볼륨을 정렬하는 것이다.

3D 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 MRI를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 맞춤형 3D 프린팅 뇌 홀더와 슬라이서 박스를 제작하여 자기공명영상(MRI) 이미지 볼륨을 조직학적 절편과 정확하게 정렬하는 것입니다. 본 영상은 마모셋에서 추출한 뇌 조직에 초점을 맞추고 있지만, 이 프로토콜은 설치류, 비인간 영장류 또는 인간의 뇌 등 모든 뇌에 적용할 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 워크스테이션을 준비하십시오.튜브의 20 milliliter 표시선까지 Fomblin과 거즈를 채웁니다. 채우는 과정에서 공기 방울을 제거하기 위해 거즈를 압축합니다. 뇌의 포르말린 성분을 조심스럽게 건조시킵니다.그다음 뇌의 전면부가 튜브 바닥을 향하도록 삽입합니다. 뇌의 측면에 거즈를 둘러 위치를 고정한 후 튜브 내에 조심스럽게 고정합니다. 튜브의 나머지 빈 공간을 거즈와 Fomblin으로 채웁니다.진행 과정 동안 기포를 주의 깊게 제거하십시오. 그런 다음 캡을 단단히 고정하고 튜브를 파라핀으로 밀봉하십시오. 대뇌 반구간 열(inter hemisphere fissure)에 맞춰 캡과 라인에 표시하십시오.그 다음 튜브를 종이 타월로 감싸고 표식이 상단 중앙에 오도록 코일에 삽입합니다. 코일을 MRI 스캐너에 넣습니다. 데이터 획득 및 후처리가 완료되면 뇌의 디지털 모델을 만드는 데 사용할 수 있는 T2 강조 영상을 얻게 됩니다.MRI를 관상면(coronal orientation)으로 엽니다. 그런 다음 변환 도구를 사용하여 이미지를 1 밀리미터 등방성 복셀(isotropic voxels)로 리샘플링합니다. 다음으로, 비선형 노이즈 감소 필터를 적용합니다.룩업 테이블(look up table) 표시를 선택합니다. 그런 다음 이중 임계값(dual Threshold) 버튼을 클릭합니다. 그래프의 슬라이더를 드래그하여 뇌 전체가 포함되도록 설정합니다.min/max 임계값(Threshold) 세그멘테이션 알고리즘을 사용하여 이진 뇌 마스크를 생성하십시오. 강도 그래프의 하단 왼쪽 모서리, 스케일 바로 아래에 표시된 값을 하한값(Lower limit) 상자에 입력하십시오. 그런 다음 'Binary'를 선택하고 'Inverse threshold' 선택을 해제하십시오.Morphological 알고리즘에서 Fill holes를 선택하십시오. Process in 2.5D 항목을 체크하십시오. 후뇌와 피질 사이의 간극을 메우려면 line VOI를 선택하십시오.뇌의 양측 가장 외측 지점에서 후뇌와 피질 사이에 연결선을 그리십시오. 뇌 전체에 걸쳐 VOI 연결선을 계속 그리십시오. VOI를 이진 마스크(Binary mask)로 변환하십시오.Image calculator를 사용하여 OR 연산을 선택함으로써 VOI와 뇌 Binary 마스크를 결합하십시오. Promote destination image type를 선택합니다. 이제 Morphological 알고리즘 중 Fill holes를 선택하십시오.그리고 2.5D의 Process를 확인하십시오. 알고리즘에서 Extract surface를 선택하고 Mask image를 선택한 뒤, 이름을 입력하고 파일 형식을 ply로 선택하십시오. 슬라이스 평면 위치에 해당하는 커팅 박스의 간격은 뇌의 앞쪽, 뒤쪽 또는 여기 보이는 백질 병변과 같은 관심 영역을 기준으로 설정할 수 있습니다.박스 VOI를 사용하여 뇌 주변에 박스를 그립니다. 의도한 플레이트 간격 두께에 해당하는 MRI 슬라이스 수만큼 해당 박스를 복사하여 붙여넣습니다. 그다음 섹션당 MRI 슬라이스 수만큼 건너뛴 후, 이전과 동일하게 박스를 배치하여 또 다른 블레이드 간격을 생성합니다.뇌 전체에 대해 이 과정을 반복합니다. 박스 VOI를 이진 마스크(Binary mask)로 반전시킵니다. 그런 다음, 앞서 뇌에 대해 수행했던 것과 같이 Extract surface를 사용하여 표면을 추출합니다.블레이드 갭의 이진 마스크(Binary mask)를 선택하십시오. Image math를 사용하여 여기에 10,000을 곱하십시오. 그런 다음 Image calculator를 사용하여 곱해진 이진 마스크를 리샘플링된 등방성 MRI에 더하십시오.이제 삼평면 뷰(triplanar view)를 선택하면, 뇌가 절단될 위치를 보여주는 MRI 블레이드 맵을 세 개의 직교 뷰에서 확인할 수 있습니다. Netfabb Professional에서 'Add part'를 선택하십시오. 그런 다음 Blade Gap 모델과 Brain Model 플라이(plys)를 선택하십시오.뇌 모델을 선택하고 리페어 모드(repair mode)를 클릭하십시오. 쉘 선택 버튼을 사용하여 뇌를 선택합니다. 그런 다음 선택 영역을 다른 쉘로 전환하여 삭제하십시오.그런 다음 수정을 적용하고 기존 부품을 제거합니다. 뇌를 선택한 상태에서 이동(Move)을 선택합니다. 원점으로 클릭하고 X, Y, Z 상자에 파라미터를 기록합니다.이는 블레이드 간격 위치를 유지하는 데 필요합니다. translate를 클릭하고 창을 닫으십시오.Blade Gap 모델을 선택하고 이전 단계에서 기록한 매개변수를 사용하여 이동시킵니다. Brain 모델을 선택하고 repair mode를 클릭하십시오. shell selection 버튼을 사용하여 뇌를 선택하십시오.그 다음 Smooth triangles를 선택하십시오. Iterations(반복 횟수)에 4를 입력하십시오. 그리고 Prevent volume shrinking 항목을 체크하십시오.Reduce Triangles를 선택하고 Target Triangle Count 상자에 200000을 입력하십시오. 그런 다음 Automatic repair를 선택하고 기본 복구를 수행하십시오. 복구 내용을 적용하십시오.그런 다음 평활화된 뇌 모델을 STL 파일로 내보냅니다. 평활화된 뇌 모델을 Meshmixer로 불러옵니다. 조각 도구를 사용하여 라인 VOI로 그려진 영역들을 평활화합니다.그리고 모델의 기타 미세한 결함들을 수정합니다. 매끄럽게 다듬고 편집된 뇌 모델을 Netfabb Professional로 불러옵니다. 그런 다음 brain slicer parts marmoset 부품을 추가합니다.Shells를 parts로 선택하십시오. 그런 다음 프로토콜에 설명된 대로 각 파트의 이름을 변경하십시오. 프로토콜에 설명된 선택 설정을 사용하여, 파트들을 클릭하고 드래그하여 뇌가 박스 중앙에 위치하도록 배치하십시오.부품을 클릭하고 드래그하여 상자 내 뇌의 깊이를 조절하십시오. 부드럽게 편집된 뇌 모델을 선택하고, 상자 컷아웃 모델을 선택한 뒤 불리언 연산(boolean operation)을 선택하십시오. 뇌 모델을 클릭하여 빨간색으로 변경하십시오.그런 다음 불리언 뺄셈(boolean subtraction)을 선택하십시오. 계산을 적용합니다. 뇌가 제대로 배치되는 것을 방해할 수 있는 돌출부(overhangs)가 있는지 확인하십시오.제거 방법은 프로토콜의 보충 섹션을 참조하십시오. 블레이드 간격 모델을 선택하고 이동(move)을 클릭하십시오. Z 위치에서 기록하십시오.이 부분이 가장 후방의 블레이드 간격 위치가 됩니다. 그런 다음 창을 닫으십시오. 브레인 슬라이서 부품 목록에서 블레이드 부품을 선택하고 이동(Move)을 클릭하십시오.이전 단계에서 얻은 Z 값을 입력하십시오. 그리고 현재 위치의 X 및 Y 값을 입력하십시오. 절대 이동(absolute Translation)을 선택하고 이동시키십시오.Duplicate를 클릭하십시오. 여기에서 보는 것처럼 섹션 두께가 일정하다면, 전체 블레이드 수와 전체 개수 및 Z 개수를 입력하고, Z gap 상자에 섹션 두께를 입력하십시오. 그런 다음 duplicate를 선택하십시오.브레인 슬라이서 부품 중에서 마이크로톰 블레이드 부품을 선택하십시오. 블레이드 부품에 수행했던 것과 동일한 이동 및 복제 단계를 반복하십시오. 모든 마이크로톰 블레이드와 메인 블레이드 홀더를 선택한 후 불리언 연산(boolean operation)을 클릭하십시오.모든 마이크로톰 칼날(Microtome Blades)을 선택하여 빨간색으로 바꾼 다음, 불리언 뺄셈(boolean subtraction)을 클릭하십시오. 그 후 계산을 적용하십시오. 수정 모드로 진입하여 자동 수정(Automatic repair)을 선택하십시오.Extended Repair를 수행하고 수정을 적용합니다. 블레이드 홀더를 STL 파일로 내보냅니다. 모든 블레이드, 메인 및 보조 박스, 그리고 매끄럽게 편집된 뇌 모델을 모두 선택한 후 불리언 연산(boolean operation)을 클릭합니다.부품 선택 창을 사용하여 메인 박스를 제외한 모든 부품을 빨간색으로 변경하십시오. 그런 다음 불리언 차집합(boolean subtraction)을 선택하십시오. 계산을 적용합니다.수정 모드로 진입하여 뇌에 손상을 줄 수 있는 날카로운 모서리가 있는지 확인하십시오. 이러한 부분은 Netfabb 수정 모드나 Meshmixer의 조각 도구를 사용하여 수정할 수 있습니다.그 다음 자동 복구를 선택하십시오. 확장 복구를 수행한 후, 복구를 적용하십시오.뇌 상자(brain box)를 STL 파일로 내보냅니다. Cura에서 로드(Load)를 선택하여 뇌 상자를 가져옵니다. 회전(Rotate) 버튼을 클릭합니다.그 다음, 클릭 앤 드래그하여 박스를 평평하게 배치합니다. 프로토콜에 표시된 대로 출력 설정을 수정합니다. 그런 다음 툴패스(toolpath)를 저장합니다.블레이드 홀더에 대해서도 동일한 과정을 수행하고 해당 객체를 복제하십시오. 그런 다음 툴패스(toolpath)를 저장하십시오. 프린트 베드에 접착제를 얇게 바른 후, 프로토콜에 기술된 설정을 사용하여 3D 프린터로 브레인 박스와 블레이드 홀더를 출력하십시오.출력이 완료되면 뇌를 절편 제작 단계로 준비할 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 워크스테이션을 설정하십시오. 뇌를 상자 안에 조심스럽게 배치하고 단단히 고정되었는지 확인하십시오.마이크로톰 칼날(Microtome Blades)을 칼날 홀더와 함께 상자의 해당 틈새에 배치합니다. 보호 장갑을 착용한 상태에서 칼날 홀더를 단단히 누릅니다. 뇌 조직을 절단하기 위해 천천히 균형 잡힌 압력을 가합니다.뇌의 앞부분부터 슬랩을 하나씩 제거하십시오. 이 접근 방식은 단순하지만, 방법론적으로 단계가 많고 여러 종류의 소프트웨어를 사용해야 하므로 연구자는 절차를 시작하기 전 사용자 인터페이스에 익숙해져야 합니다. 이 워크플로우는 마모셋 뇌 슬라이서 박스 제작 프로토콜을 요약한 것입니다.뇌를 Formalin으로 고정하고 150 micron 해상도로 T2 강조 MRI를 촬영합니다. 이미지를 처리하고 임계값을 설정하여 이진 마스크(Binary mask)를 생성합니다. 그런 다음 3D 모델링 소프트웨어를 사용하여 표면을 렌더링합니다.슬라이서 템플릿과 뇌 모델 간의 불리언 뺄셈(boolean subtraction)을 통해 뇌 슬라이서의 디지털 모델을 생성합니다. 이후 3D 프린터를 사용하여 뇌 슬라이서 박스를 출력합니다. 그다음 절단을 위해 뇌를 슬라이서 박스 안에 단단히 고정합니다.뇌를 절편으로 나눈 후, 생체 내(In Vivo) MRI 영상과 사후 MRI 영상, 그리고 절편 표면 사진을 시각적으로 비교하면 여러 절편에 걸쳐 방향이 잘 일치함을 알 수 있습니다. 고해상도 사후 MRI와 여러 뇌 절편의 LFB CV 염색 조직학적 단면을 더욱 철저히 비교한 결과, 마모셋 뇌의 모든 구조에서 정확하고 일관된 일치가 나타났습니다. 이 다발성 경화증 동물 모델에서 동물들은 뇌 전반에 걸쳐 퍼진 백질 병변을 발달시킵니다.이 기법을 사용하여 생체 내(In Vivo) MRI에서 검출된 작은 병변을 사후 MRI와 조직학적 절편 모두에서 추적할 수 있습니다. 또한 조직학적 분석과 사후 MRI를 통해 생체 내 MRI에서는 발견하지 못한 병변을 찾아낼 수 있습니다. 본 사례의 생체 내 MRI에서는 양측 시각신경로에서 병변을 시사하는 정상적인 고신호 강도의 명확한 증거가 나타나지 않았습니다.그럼에도 불구하고, 사후 MRI에서 시각로의 신호 고강도가 관찰되었습니다. 그리고 이러한 영역들은 LFB CV 조직학적 단면에서 관찰된 수초 탈락 병변과 직접적으로 일치했습니다. 결론적으로, 본 연구에서 소개한 방법론을 통해 연구자들은 MRI 소견의 기저에 있는 병리학적 상태를 정확하게 평가할 수 있습니다.우리는 이것이 뇌 관련 질환 및 염증, 재수초화와 같은 특정 병리학적 과정에 대한 새로운 바이오마커를 식별하는 유망한 접근 방식이라고 생각합니다.

utilizing-3d-printing-technology-to-merge-mri-with-histology-protocol

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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3D 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 MRI를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면

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