3D 인쇄 기술을 활용하여 조직학과 MRI를 병합하기 : 두뇌를위한 프로토콜 단면

본 프로토콜의 전반적인 목표는 맞춤형 3D 프린팅 뇌 홀더와 슬라이서 박스를 제작하여 자기공명영상(MRI) 이미지 볼륨을 조직학적 절편과 정확하게 정렬하는 것입니다. 본 영상은 마모셋에서 추출한 뇌 조직에 초점을 맞추고 있지만, 이 프로토콜은 설치류, 비인간 영장류 또는 인간의 뇌 등 모든 뇌에 적용할 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 워크스테이션을 준비하십시오.

튜브의 20 milliliter 표시선까지 Fomblin과 거즈를 채웁니다. 채우는 과정에서 공기 방울을 제거하기 위해 거즈를 압축합니다. 뇌의 포르말린 성분을 조심스럽게 건조시킵니다.

그다음 뇌의 전면부가 튜브 바닥을 향하도록 삽입합니다. 뇌의 측면에 거즈를 둘러 위치를 고정한 후 튜브 내에 조심스럽게 고정합니다. 튜브의 나머지 빈 공간을 거즈와 Fomblin으로 채웁니다.

진행 과정 동안 기포를 주의 깊게 제거하십시오. 그런 다음 캡을 단단히 고정하고 튜브를 파라핀으로 밀봉하십시오. 대뇌 반구간 열(inter hemisphere fissure)에 맞춰 캡과 라인에 표시하십시오.

그 다음 튜브를 종이 타월로 감싸고 표식이 상단 중앙에 오도록 코일에 삽입합니다. 코일을 MRI 스캐너에 넣습니다. 데이터 획득 및 후처리가 완료되면 뇌의 디지털 모델을 만드는 데 사용할 수 있는 T2 강조 영상을 얻게 됩니다.

MRI를 관상면(coronal orientation)으로 엽니다. 그런 다음 변환 도구를 사용하여 이미지를 1 밀리미터 등방성 복셀(isotropic voxels)로 리샘플링합니다. 다음으로, 비선형 노이즈 감소 필터를 적용합니다.

룩업 테이블(look up table) 표시를 선택합니다. 그런 다음 이중 임계값(dual Threshold) 버튼을 클릭합니다. 그래프의 슬라이더를 드래그하여 뇌 전체가 포함되도록 설정합니다.

min/max 임계값(Threshold) 세그멘테이션 알고리즘을 사용하여 이진 뇌 마스크를 생성하십시오. 강도 그래프의 하단 왼쪽 모서리, 스케일 바로 아래에 표시된 값을 하한값(Lower limit) 상자에 입력하십시오. 그런 다음 'Binary'를 선택하고 'Inverse threshold' 선택을 해제하십시오.

Morphological 알고리즘에서 Fill holes를 선택하십시오. Process in 2.5D 항목을 체크하십시오. 후뇌와 피질 사이의 간극을 메우려면 line VOI를 선택하십시오.

뇌의 양측 가장 외측 지점에서 후뇌와 피질 사이에 연결선을 그리십시오. 뇌 전체에 걸쳐 VOI 연결선을 계속 그리십시오. VOI를 이진 마스크(Binary mask)로 변환하십시오.

Image calculator를 사용하여 OR 연산을 선택함으로써 VOI와 뇌 Binary 마스크를 결합하십시오. Promote destination image type를 선택합니다. 이제 Morphological 알고리즘 중 Fill holes를 선택하십시오.

그리고 2.5D의 Process를 확인하십시오. 알고리즘에서 Extract surface를 선택하고 Mask image를 선택한 뒤, 이름을 입력하고 파일 형식을 ply로 선택하십시오. 슬라이스 평면 위치에 해당하는 커팅 박스의 간격은 뇌의 앞쪽, 뒤쪽 또는 여기 보이는 백질 병변과 같은 관심 영역을 기준으로 설정할 수 있습니다.

박스 VOI를 사용하여 뇌 주변에 박스를 그립니다. 의도한 플레이트 간격 두께에 해당하는 MRI 슬라이스 수만큼 해당 박스를 복사하여 붙여넣습니다. 그다음 섹션당 MRI 슬라이스 수만큼 건너뛴 후, 이전과 동일하게 박스를 배치하여 또 다른 블레이드 간격을 생성합니다.

뇌 전체에 대해 이 과정을 반복합니다. 박스 VOI를 이진 마스크(Binary mask)로 반전시킵니다. 그런 다음, 앞서 뇌에 대해 수행했던 것과 같이 Extract surface를 사용하여 표면을 추출합니다.

블레이드 갭의 이진 마스크(Binary mask)를 선택하십시오. Image math를 사용하여 여기에 10,000을 곱하십시오. 그런 다음 Image calculator를 사용하여 곱해진 이진 마스크를 리샘플링된 등방성 MRI에 더하십시오.

이제 삼평면 뷰(triplanar view)를 선택하면, 뇌가 절단될 위치를 보여주는 MRI 블레이드 맵을 세 개의 직교 뷰에서 확인할 수 있습니다. Netfabb Professional에서 'Add part'를 선택하십시오. 그런 다음 Blade Gap 모델과 Brain Model 플라이(plys)를 선택하십시오.

뇌 모델을 선택하고 리페어 모드(repair mode)를 클릭하십시오. 쉘 선택 버튼을 사용하여 뇌를 선택합니다. 그런 다음 선택 영역을 다른 쉘로 전환하여 삭제하십시오.

그런 다음 수정을 적용하고 기존 부품을 제거합니다. 뇌를 선택한 상태에서 이동(Move)을 선택합니다. 원점으로 클릭하고 X, Y, Z 상자에 파라미터를 기록합니다.

이는 블레이드 간격 위치를 유지하는 데 필요합니다. translate를 클릭하고 창을 닫으십시오.

Blade Gap 모델을 선택하고 이전 단계에서 기록한 매개변수를 사용하여 이동시킵니다. Brain 모델을 선택하고 repair mode를 클릭하십시오. shell selection 버튼을 사용하여 뇌를 선택하십시오.

그 다음 Smooth triangles를 선택하십시오. Iterations(반복 횟수)에 4를 입력하십시오. 그리고 Prevent volume shrinking 항목을 체크하십시오.

Reduce Triangles를 선택하고 Target Triangle Count 상자에 200000을 입력하십시오. 그런 다음 Automatic repair를 선택하고 기본 복구를 수행하십시오. 복구 내용을 적용하십시오.

그런 다음 평활화된 뇌 모델을 STL 파일로 내보냅니다. 평활화된 뇌 모델을 Meshmixer로 불러옵니다. 조각 도구를 사용하여 라인 VOI로 그려진 영역들을 평활화합니다.

그리고 모델의 기타 미세한 결함들을 수정합니다. 매끄럽게 다듬고 편집된 뇌 모델을 Netfabb Professional로 불러옵니다. 그런 다음 brain slicer parts marmoset 부품을 추가합니다.

Shells를 parts로 선택하십시오. 그런 다음 프로토콜에 설명된 대로 각 파트의 이름을 변경하십시오. 프로토콜에 설명된 선택 설정을 사용하여, 파트들을 클릭하고 드래그하여 뇌가 박스 중앙에 위치하도록 배치하십시오.

부품을 클릭하고 드래그하여 상자 내 뇌의 깊이를 조절하십시오. 부드럽게 편집된 뇌 모델을 선택하고, 상자 컷아웃 모델을 선택한 뒤 불리언 연산(boolean operation)을 선택하십시오. 뇌 모델을 클릭하여 빨간색으로 변경하십시오.

그런 다음 불리언 뺄셈(boolean subtraction)을 선택하십시오. 계산을 적용합니다. 뇌가 제대로 배치되는 것을 방해할 수 있는 돌출부(overhangs)가 있는지 확인하십시오.

제거 방법은 프로토콜의 보충 섹션을 참조하십시오. 블레이드 간격 모델을 선택하고 이동(move)을 클릭하십시오. Z 위치에서 기록하십시오.

이 부분이 가장 후방의 블레이드 간격 위치가 됩니다. 그런 다음 창을 닫으십시오. 브레인 슬라이서 부품 목록에서 블레이드 부품을 선택하고 이동(Move)을 클릭하십시오.

이전 단계에서 얻은 Z 값을 입력하십시오. 그리고 현재 위치의 X 및 Y 값을 입력하십시오. 절대 이동(absolute Translation)을 선택하고 이동시키십시오.

Duplicate를 클릭하십시오. 여기에서 보는 것처럼 섹션 두께가 일정하다면, 전체 블레이드 수와 전체 개수 및 Z 개수를 입력하고, Z gap 상자에 섹션 두께를 입력하십시오. 그런 다음 duplicate를 선택하십시오.

브레인 슬라이서 부품 중에서 마이크로톰 블레이드 부품을 선택하십시오. 블레이드 부품에 수행했던 것과 동일한 이동 및 복제 단계를 반복하십시오. 모든 마이크로톰 블레이드와 메인 블레이드 홀더를 선택한 후 불리언 연산(boolean operation)을 클릭하십시오.

모든 마이크로톰 칼날(Microtome Blades)을 선택하여 빨간색으로 바꾼 다음, 불리언 뺄셈(boolean subtraction)을 클릭하십시오. 그 후 계산을 적용하십시오. 수정 모드로 진입하여 자동 수정(Automatic repair)을 선택하십시오.

Extended Repair를 수행하고 수정을 적용합니다. 블레이드 홀더를 STL 파일로 내보냅니다. 모든 블레이드, 메인 및 보조 박스, 그리고 매끄럽게 편집된 뇌 모델을 모두 선택한 후 불리언 연산(boolean operation)을 클릭합니다.

부품 선택 창을 사용하여 메인 박스를 제외한 모든 부품을 빨간색으로 변경하십시오. 그런 다음 불리언 차집합(boolean subtraction)을 선택하십시오. 계산을 적용합니다.

수정 모드로 진입하여 뇌에 손상을 줄 수 있는 날카로운 모서리가 있는지 확인하십시오. 이러한 부분은 Netfabb 수정 모드나 Meshmixer의 조각 도구를 사용하여 수정할 수 있습니다.

그 다음 자동 복구를 선택하십시오. 확장 복구를 수행한 후, 복구를 적용하십시오.

뇌 상자(brain box)를 STL 파일로 내보냅니다. Cura에서 로드(Load)를 선택하여 뇌 상자를 가져옵니다. 회전(Rotate) 버튼을 클릭합니다.

그 다음, 클릭 앤 드래그하여 박스를 평평하게 배치합니다. 프로토콜에 표시된 대로 출력 설정을 수정합니다. 그런 다음 툴패스(toolpath)를 저장합니다.

블레이드 홀더에 대해서도 동일한 과정을 수행하고 해당 객체를 복제하십시오. 그런 다음 툴패스(toolpath)를 저장하십시오. 프린트 베드에 접착제를 얇게 바른 후, 프로토콜에 기술된 설정을 사용하여 3D 프린터로 브레인 박스와 블레이드 홀더를 출력하십시오.

출력이 완료되면 뇌를 절편 제작 단계로 준비할 수 있습니다. 프로토콜에 설명된 대로 워크스테이션을 설정하십시오. 뇌를 상자 안에 조심스럽게 배치하고 단단히 고정되었는지 확인하십시오.

마이크로톰 칼날(Microtome Blades)을 칼날 홀더와 함께 상자의 해당 틈새에 배치합니다. 보호 장갑을 착용한 상태에서 칼날 홀더를 단단히 누릅니다. 뇌 조직을 절단하기 위해 천천히 균형 잡힌 압력을 가합니다.

뇌의 앞부분부터 슬랩을 하나씩 제거하십시오. 이 접근 방식은 단순하지만, 방법론적으로 단계가 많고 여러 종류의 소프트웨어를 사용해야 하므로 연구자는 절차를 시작하기 전 사용자 인터페이스에 익숙해져야 합니다. 이 워크플로우는 마모셋 뇌 슬라이서 박스 제작 프로토콜을 요약한 것입니다.

뇌를 Formalin으로 고정하고 150 micron 해상도로 T2 강조 MRI를 촬영합니다. 이미지를 처리하고 임계값을 설정하여 이진 마스크(Binary mask)를 생성합니다. 그런 다음 3D 모델링 소프트웨어를 사용하여 표면을 렌더링합니다.

슬라이서 템플릿과 뇌 모델 간의 불리언 뺄셈(boolean subtraction)을 통해 뇌 슬라이서의 디지털 모델을 생성합니다. 이후 3D 프린터를 사용하여 뇌 슬라이서 박스를 출력합니다. 그다음 절단을 위해 뇌를 슬라이서 박스 안에 단단히 고정합니다.

뇌를 절편으로 나눈 후, 생체 내(In Vivo) MRI 영상과 사후 MRI 영상, 그리고 절편 표면 사진을 시각적으로 비교하면 여러 절편에 걸쳐 방향이 잘 일치함을 알 수 있습니다. 고해상도 사후 MRI와 여러 뇌 절편의 LFB CV 염색 조직학적 단면을 더욱 철저히 비교한 결과, 마모셋 뇌의 모든 구조에서 정확하고 일관된 일치가 나타났습니다. 이 다발성 경화증 동물 모델에서 동물들은 뇌 전반에 걸쳐 퍼진 백질 병변을 발달시킵니다.

이 기법을 사용하여 생체 내(In Vivo) MRI에서 검출된 작은 병변을 사후 MRI와 조직학적 절편 모두에서 추적할 수 있습니다. 또한 조직학적 분석과 사후 MRI를 통해 생체 내 MRI에서는 발견하지 못한 병변을 찾아낼 수 있습니다. 본 사례의 생체 내 MRI에서는 양측 시각신경로에서 병변을 시사하는 정상적인 고신호 강도의 명확한 증거가 나타나지 않았습니다.

그럼에도 불구하고, 사후 MRI에서 시각로의 신호 고강도가 관찰되었습니다. 그리고 이러한 영역들은 LFB CV 조직학적 단면에서 관찰된 수초 탈락 병변과 직접적으로 일치했습니다. 결론적으로, 본 연구에서 소개한 방법론을 통해 연구자들은 MRI 소견의 기저에 있는 병리학적 상태를 정확하게 평가할 수 있습니다.

우리는 이것이 뇌 관련 질환 및 염증, 재수초화와 같은 특정 병리학적 과정에 대한 새로운 바이오마커를 식별하는 유망한 접근 방식이라고 생각합니다.