나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

이 Real-Time PCR 검사 방법론의 전반적인 목표는 DNA와 RNA 기반 병원체를 모두 고처리량 방식으로 함께 검출하는 것입니다. 임상 표본의 핵산은 OpenArray 플레이트에 로드된 공통 프라이머 풀로 사전 증폭되고 병원체의 존재 여부를 분석됩니다. 이 방법은 전염병에 대한 OneHealth 감시 노력을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.

기존 기술과 비교하여 이 방법을 사용하면 서로 경쟁하지 않고 더 많은 표적에 대해 더 많은 샘플을 테스트할 수 있으므로 테스트 효율성이 향상됩니다. 이 방법은 맞춤형 나노 스케일 PCR 플레이트를 사용합니다. 프라이머와 프로브는 관통 구멍의 가장자리에 인쇄되어 있으며 샘플은 액체 처리기를 사용하여 로드됩니다.

우리는 말과 개의 호흡기 병원체 패널에 대해 테스트되는 임상 표본에 대한 방법을 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플레이트를 설계합니다. 여기에 사용된 플레이트는 18개의 타겟으로 3개씩 구성되어 있습니다.

면봉과 기관 세척에 매체를 추가하여 최소 1-2ml의 액체가 있도록 합니다. 면봉과 DMEM을 튜브에서 격렬하게 소용돌이치십시오. 그런 다음 피펫을 사용하여 약 1ml의 매체를 새 튜브로 옮깁니다.

각 비드 튜브에 235마이크로리터의 용해 버퍼와 175마이크로리터의 샘플을 추가합니다. 총 핵산을 추출하기 위해 제조업체의 프로토콜을 진행합니다. 먼저 샘플 맵을 확인하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 핵산 또는 프리앰프의 역전사 및 사전 증폭을 준비합니다.

8.5마이크로리터의 프리앰프 마스터 믹스와 5.5마이크로리터의 DNA/RNA 샘플을 플레이트의 왼쪽만 사용하여 표준 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 샘플, 포지티브 대조군 및 네거티브 대조군을 프리앰프 믹스와 결합한 후 표준 96웰 플레이트를 투명한 접착 씰로 철저히 밀봉합니다. 사이클링 중 밀봉 틈이 형성되는 것을 방지하기 위해 면도날을 사용하여 과도한 밀봉을 제거하십시오.

PCR 플레이트 스피너를 사용하여 밀봉된 플레이트를 20초 동안 원심분리합니다. 모든 시약이 플레이트 웰 바닥에 결합되어 있는지 확인하십시오. 기존 써모사이클러를 켠 후 프리를 선택하십시오.amp 사이클링 프로그램을 시작하고 프로그램을 시작하십시오.

96웰 플레이트를 써모사이클러에 넣는 것은 써모사이클러의 바닥 부분이 스크린의 온도 판독값을 모니터링하여 cDNA 생산에 필요한 온도에 도달할 때에만 가능합니다. 일단 사전amp 실행이 완료되면 플레이트가 밀봉된 상태로 유지되었는지 확인하십시오. 이중 장갑과 슬리브 커버를 착용한 후 프리앰프 플레이트에서 씰을 제거합니다.

그런 다음 외부 장갑을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 96웰 프리앰프 플레이트의 1-6열 각 웰에 56마이크로리터의 TE 버퍼를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합하여 프리앰프 생성물을 1-5로 희석합니다. 이렇게하려면 피펫의 첫 번째 중지로 이동하여 바닥에서 흡인하고 더 높이 분배하지만 거품을 생성하지 마십시오.

사용하지 않는 well에 관계없이 6개의 컬럼 모두에 TE buffer를 추가합니다. 384웰 이송을 준비합니다.amp텍스트 프로토콜에 설명된 대로 증폭 플레이트. 준비 단계가 완료되면 잘 맞는 새 이중 장갑과 슬리브 커버를 착용하십시오.

낮은 부피의 파이펫팅을 수행하는 동안 증발 속도가 높기 때문에 마스터 믹스와 샘플을 효율적으로 분배하고 플레이트를 즉시 밀봉하는 것이 중요합니다. 2.5마이크로리터의 증폭 마스터 믹스를 384웰 플레이트에 추가합니다. 여기서는 시연 목적으로 흰색 플레이트를 사용하지만 눈의 피로를 줄이기 위해 검은색 플레이트를 사용해야 합니다.

2.5마이크로리터의 희석된 프리앰프 제품을 텍스트 프로토콜의 맵에 따라 384웰 플레이트로 이동합니다. 여기에 표시된 컬러 주사위는 고정 채널 파이펫의 전달 순서를 보여줍니다. 즉시 호일 씰로 플레이트를 단단히 덮으십시오.

겉장갑과 슬리브 커버는 버리십시오. PCR 플레이트 스피너에서 384웰 플레이트를 20초 동안 원심분리합니다. 호일 씰을 제거하지 말고 384웰 플레이트를 리퀴드 핸들러에 넣으십시오.

케이스가 들어 있는 패키지를 엽니다 amplification 플레이트를 선택하고 일련 번호가 오른쪽에 있는 첫 번째 슬롯의 액체 처리기에 조심스럽게 넣고 플레이트 표면을 건드리지 않고 케이스의 가장자리를 잡습니다. 모든 것이 제자리에 놓이면 액체 처리기 내부의 384웰 플레이트에서 호일 씰을 제거합니다. 다음을 클릭한 다음 각 단계가 완료될 때 모든 확인란을 선택합니다.

액체 처리기의 도어를 닫고 즉시 주입 프로세스를 시작하십시오. 액체 처리기 옆에 머물면서 플레이트가 채워지면 즉시 다음 단계로 진행하십시오. 액체 처리기가 작동하는 동안 케이스 덮개 하단의 보호 필름을 제거합니다.

상단 필름은 제자리에 둡니다. 빨간 테이프를 약간 당겨 접착제에서 분리하여 프라임합니다. 적재된 제거 amp액체 처리기에서 lification 플레이트를 선택하고 오른쪽에 일련 번호가 있는 플레이트 프레스에 부드럽게 놓습니다.

노치가 있는 끝이 오른쪽에 오도록 접시 위에 뚜껑을 놓고 접착제를 바닥에 놓습니다. 플레이트 프레스 레버를 조심스럽게 아래로 당겨 닫으면 표시등이 20초 동안 깜박입니다. 이 시간 동안 플레이트 프레스를 만지지 마십시오.

표시등이 녹색으로 고정되면 레버를 들어 올리고 가장자리를 잡고 밀봉된 플레이트를 조심스럽게 제거합니다. 밀봉된 증폭판을 케이스 가장자리를 수직으로 잡고 즉시 주사기 팁을 케이스 끝에 있는 로딩 포트에 삽입한 다음 침지 유체를 한 번의 부드러운 연속 동작으로 천천히 분배하여 플레이트와 뚜껑 사이의 공간을 채웁니다. 접시가 잠기면 모서리에 작은 기포 하나를 남겨 두십시오.

플레이트의 가장자리를 수직으로 계속 잡고 플러그를 포트에 삽입하고 플러그를 시계 방향으로 돌려 적재 포트를 밀봉하고 손잡이가 부러질 때까지 충분한 압력을 가합니다.에탄올을 완전히 뿌린 보푸라기 없는 천으로 케이스를 청소합니다. 케이스를 말리려면 깨끗한 천으로 케이스를 아래쪽으로 닦으십시오.

밀봉된 플레이트를 amp합리화 기계. instrument 탭에서 instrument console을 선택합니다. 증폭 기계를 선택한 다음 문 열기 버튼을 클릭합니다.

플레이트 어댑터의 첫 번째 슬롯에 증폭판을 놓고 어댑터가 왼쪽 상단 모서리에 있는 어댑터와 올바르게 정렬되어 있는지 확인합니다. 바코드가 위쪽을 향하고 기기 앞쪽을 향하도록 플레이트의 방향을 지정합니다. 문 닫기 버튼을 클릭한 후 화면 하단의 홈 탭으로 이동합니다.

실행 메뉴에서 OpenArray를 선택합니다. 플레이트 ID 가져오기를 클릭합니다. 실행을 시작하려면 실행 시작을 클릭합니다.

결과 매크로가 포함된 스프레드시트를 엽니다. 내보낸 데이터 파일에서 화면 하단의 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이동 또는 복사를 선택합니다. to book 필드에서 results 매크로를 선택합니다.

그런 다음 Move to end(끝으로 이동)를 클릭하고 create copy(사본 생성)라고 표시된 상자를 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭합니다. 이전 내보내기 탭을 삭제한 다음 새로 추가된 탭의 이름을 내보내기로 바꿉니다.

view(보기)를 클릭한 다음 macros(매크로)를 클릭하고 macro(매크로)를 선택한 다음 run(실행)을 클릭합니다. 그런 다음 보기, 매크로를 차례로 클릭하고 Macro2를 선택한 다음 실행을 클릭하여 Macro2에 대해 이 작업을 반복합니다. 증폭 기계 소프트웨어에서 각 샘플의 곡선을 확인하고 화면 왼쪽의 분석/증폭 플롯을 선택하여 매크로 테이블에 대해 제어합니다.

그런 다음 샘플 탭을 선택하고 각 샘플을 클릭하여 테이블의 각 양성 결과에 대해 2개 또는 3개의 양성 증폭 곡선이 있는지 확인합니다. 형광 판독값은 Real-Time PCR이 성공적으로 수행되었음을 보여주기 위해 증폭 주기에 대해 표시됩니다. 대부분의 샘플은 Real-Time PCR 반응의 사이클 2와 25 사이에 상대적 임계값 수준에 도달했습니다.

서로 다른 3일에 실행되는 표준 곡선은 양수 대조군을 사용하여 선형성과 증폭 범위를 보여주기 위해 플롯됩니다. 주기 임계값은 핵산 표준물질의 사본 수의 log base 10에 대해 표시됩니다. 두 개의 매크로는 첫 번째 열의 표본 이름과 긍정적인 결과를 얻은 대상에 대한 각 대상에 대한 세 개의 Ct 값의 평균을 채웁니다.

증폭되지 않은 대상은 이 표에서 공백으로 표시됩니다. 10개의 임상 샘플과 4개의 일상적인 대조군에 대한 정량적 결과가 표시되며, 여기의 경우와 같이 음성 증폭 대조군은 모든 표적에 대해 음성이어야 하고 음성 추출 대조군은 내부 대조군만 포함해야 합니다. 이 세트의 한 샘플은 실패한 내부 대조군을 보여주며, 이는 샘플에 억제제가 있음을 나타냅니다.

이 비디오를 시청한 후에는 나노 단위 PCR 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 통해 수의학 진단에서 증후군 기반 패널을 더 쉽게 실행할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 전염병의 원인 병원체에 대한 에세이를 포함하도록 조정할 수 있습니다.