Name: 단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 학습하세요 고속 나노 측위 시스템을 활용한 단일 분자 FRET 실험 방법을 통해 생물분자의 실시간 구조 정보를 얻는 기술입니다. TIRF 현미경과 베이지안 추론 소프트웨어를 결합하여 유연한 도메인의 위치를 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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저자는 흐름 챔버의 기계 도면에 대해 B. Gruchmann에게 감사를 표합니다. 또한 NPS 및 기본 샘플링 엔진에 대한 통찰력 있는 의견과 토론을 제공해 주신 Max Beckers와 Florian Drechsler에게 감사를 표하고 싶습니다.

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우리는 정확하게 즉 생체 거대 분자, 핵산 및 / 또는가요 성 단백질 링커를 통해 부착 염료 간의 FRET 효율성을 결정하기 위해 설정 및 실험 절차를 제시한다. smFRET 정확한 측정 (제 3)을 보장하기 위해, 측정하는 동안 언제든지 유동 챔버로부터 공기를 배제하는 것이 중요하다. 또한, 형광체와 유량 용기를 너무 많이 넣지해야합니다. 형광 명확하게 정확한 분석을 위해 구분해야합니다. 도너의 표백 보이지 않는다 smFRET 쌍은 분석에서 제외되어야 할 바와 같이, 시야에서 분자의&gt; 80 %가 영화의 끝에 표백 있는지 확인. 도너 및 억 셉터 채널의 크로스 토크 (cross-talk)와 상대 검출 효율 보정 샘플 β 인자 및 γ 이중의 불균일성을 고려하여 각각마다 개별적으로 계산 페어링 FRET. <p class= &quot;jove_content는&quot;&gt; 카메라 설정 (통합 시간, 전자 증 이득 전치 증폭기 이득 및 3.9 절에 설명 된 판독 레이트) 잡음비, 동적 범위 및 시간 해상도로 신호의 최적 균형을 제공하는 값으로 설정되어야한다. 서로 다른 실험하거나 상이한 하드웨어를 사용하는 경우 재조정 될 필요가있다. 프레임 번호는 도너 대부분 관측 시간 내에 표백 분자되도록 충분히 높게 할 필요가있다. 형광 분광기 (7 항 내지 9)의 측정에 대한 신호 강도 및 기록 된 데이터의 스펙트럼 해상도 간의 절충이 발견되어야한다. 이를 위해 형광 분광계의 여기 및 방출 통로의 슬릿은 사용되는 장비 및 시료 농도에 따라 적응되어야한다. 또한, 우리는 과도 또는 동적 macrom의 구조 정보를 얻기 위해 고속 NPS 분석 방법을 제시olecular 단지. NPS는 비 템플릿 DNA 가닥의 경로 및 고세균 RNA 폴리머 라제 오픈 복잡 전사 개시 인자의 위치를 ​​나타 내기 위해 적용되었다. 60 개 이상의 서로 다른 거리 측정의 네트워크를 사용하여, 우리는 새로 구현 샘플링 엔진 (준비 EILERT, T., 베 커스, M., DRECHSLER, F., 미카엘, J.)가 장착 빨리 NPS, 보여 주었다 원래 글로벌 NPS 방법 (27)에 비해 크기 ≈2 수주 복잡한 smFRET 네트워크 분석에 필요한 시간을 감소시킨다. 이 알고리즘의 견고성은 병렬 템퍼링 방식과 결합 된 대도시 - 내 - 깁스 샘플러에 뿌리를두고있다. 빠른 NPS 네트워크 결과의 정확한 재현성을 보여줍니다 이전 30 게시 된 결과와 일치한다. 몇 가지 다른 방법이 smFRET 측정 (11)로부터 구조 정보를 추론하는 것을 목표로 발표되었다 </s업&gt; 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 이들 접근법 모두는 하나의 특정 색소 모델을 제공한다. 따라서, 각각의 모델에서 가정을 만족하지 않는 염료가 사용될 거짓 구조 정보 발생할 수 없다. 빠른 NPS는 반대로, 각 염료 분자 다른 모델을 선택할 수 있습니다. 이 두 가지의 구조적인 동작을 설명하는 데 도움이 염료 분자 자체뿐만 아니라 그것의 부착을 위해 사용되는 링커. 상기 염료 분자의 분자량 로컬 환경뿐 아니라 물리적 특성에 가장 적합한 어느 모델을 결정한다. 고세균 개시 복합체의 분석 smFRET 네트워크의 모든 염료 분자 등방성 가정이 급격히 감소 나 리드n은 신뢰할 볼륨의 크기는 고전 모델에 비해. 모든 염료에 대한 평균 동적 위치와 함께 (95 %에서) 모든 신뢰할 볼륨 크기의 중앙값을 분자보다 0.5 내지 3으로 감소시킨다. 그러나 이러한 염료 분자의 포스 테리어는 가정이 잘못된 구조 정보에 리드를 한 것으로 표시, 그들의 smFRET 측정과 더 이상 일치하지 않습니다. 대조적으로, 전형적인 모델에서 결정된 포스 테리어 결정된 smFRET 효율과 일치한다. 모든 염료에 대한 평균 등방성 및 / 또는 동적 위치의 가정으로 빨리 NPS 각 염료 다섯 가지 모델 중 하나를 할당 할 수있는 염료 분자 전과을 가능하게 불일치로 이어집니다. 각 모델은 동일한 액세스 볼륨을 사용한다. 염료 AVS의 계산 알고리즘은 몇 가지 가정한다. 우선, 형광체의 공간적 형상은 구형으로 근사된다. 따라서, 직경은 계정 형광의 WID 고려일, 높이와 두께 (제 12 조)을 사용해야합니다. 또한, 상기 링커의 형태는가요 성로드에 의해 근사된다. 제 12 항에 제시된 값은 12 C 링커를 통해 부착 염료 알렉사 647에 대해 계산 하였다. 지금까지, 이는 실험 형상 주어진 정확하게 모델이 가장 적합 선험적으로 결정하는 것은 불가능하고, 따라서 모든 모델 시험해야한다. 여전히 데이터와 일치하면서 일반적으로, 하나는 가장 작은 가능한 후방 크기를 제공하는 모델을 선택한다. 모델 선택은 smFRET 데이터와 일치하는지 여부를 테스트하기 위해 사후 우도를 모두 계산한다. 일관성 후방에서 수집 한 샘플의 90 % 이상이 우도의 95 % 신뢰 구간 내에있는 것을 의미한다. 그것이 사실이지만 염료 분자 smFRET 네트워크 거리 불확실성이 작을 이방성 하부 기하학적 배열도 고려 될 필요가있다. 따라서, 잠시 연구전형적인 첫번째 선택은 ISO 모델 낮은 형광 이방성 염료 분자이다 epresenting, 일관성 검사는 올바른 염료 모델을 선택하기위한 직접적인 수단을 제공한다. 염료 모델의 최적 선택은 위치 파악 정확성의 급격한 증가를 야기 함과 동시에 그 FRET 데이터 네트워크의 일관성을 유지할 수있다. 요약하면, 빨리 NPS는 큰 거대 분자 복합체의 구조 및 동적 정보를 얻을 수 있습니다. 이러한 X 선 결정학 또는이 따라서 매우 복잡한 생물학적 과정의 기전을 이해 우리 넓어 높은가요 또는 과도 복합체를 모니터링 할 수 극저온 전자 현미경 등의 일반적인 구조 방법 대조적.

생체 분자의 구조를 결정하는 것은 그 기능을 이해하기위한 중요한 전제 조건이다. 구조 결정을위한 두 개의 잘 확립 된 방법은 극저온 전자 현미경 및 X 선 결정학 (1, 2)이다. 오늘, 두 가지 방법은 옹스트롬 수준 아래로 해상도를 가진 고해상도 구조 정보를 제공합니다. 이러한 두 가지 방법은 단백질 복합체 같은 큰 생 분자의 구조를 규명하기 위해 광범위하게 사용되고있다. 기존의 방법은 지속적 지난 수십 년에 걸쳐 개선되어 왔지만, 큰 동적 과도 복합체 3을 조사하는 경우, 생물학적 구조의 복잡성은 여전히, 특히 구조 생물학에 중요한 도전을 제기. 고분자 복합체의 역학, 특히 구조 - 기능 관계를 연구하기 위해서, 단일 분자 방법론 잠을ided 유용한 정보 4. 여러 새로운 전략 구조 및 동적 정보를 획득하는 방법에 직교 제공 개발되었다. 예 고속 AFM (5) 기계적 조작 6 지역화 형광 현미경 (7)뿐만 아니라, 단일 분자 포스터 공명 에너지 전이 (smFRET) (8, 9)이다. FRET 매우 이른 이후에 의한 생체 거대 분자 (10)의 길이 규모의 거리에 의존하는 분자자를 지칭되었다. smFRET의 한 특히 흥미로운 애플리케이션은 추론 smFRET 측정으로부터 얻어진 거리 정보를 사용하는 정보는 11, 12, 13, 14, 15의 구조 &gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. smFRET 인해 높은 시간 분해능으로, 단백질 구조의 이동 부분의 위치는 국소 수있다. 그러나, 염료 분자에 대한 smFRET 데이터 중요한 보정 파라미터로부터 정량적 정보를 추출하기 위해 측정을 24 동안 결정되어야한다. 이들 보정 계수로, FRET 효율 E FRET은 공식을 사용하여 계산 될 수있다 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> , 어디 A와 I D (도 2 참조)이다. β-인자 수용체 채널에 크로스 - 토크에 대한 도너 발광 누설 계정에 의해 계산된다 <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> 나는 'A와 나'D 경우 기증자의 형광 강도와 수용체 분자의 사진 표백 후 수용체 분자이다. γ 인자는 두 채널의 검출 상대 효율의 차이뿐만 아니라 도너의 형광 양자 수율 셉터 염료의 차이를 보정한다. 그것은으로 모든 개인 시간 추적 계산한다 이 설명은 종종 중요뿐만 아니라 보정 될 필요 셉터 분자의 직접적인 자극을 무시한다는 참고. 이러한 보정 인자를 결정하는 것은 광 신체적 변화 및 구조 역학 구별하기 위해 교류 방식 (25)에 도너뿐만 아니라 수용체 모두를 여기 시키는데 유용하다. 정량적 smFRET 효율뿐만 아니라 양적 구조 정보를 얻을뿐만 아니라 위해, 나노 포지셔닝 시스템 (NPS)는 2008 (26)에 도입 하였다. 이름은 위성 기반의 위성 위치 확인 시스템 (GPS)과의 유사성을 기준으로 선택되었다. 국민 연금은 biomacromolecular 단지에서 알 수없는 염료 위치의 현지화를 위해 smFRET 및 X 선 결정학 데이터를 결합하는 하이브리드 기술이다. 는 Crystal 구조는 기준 프레임으로서 작용하고 smFRET 결과를 알 수없는 위치 형광 (안테나)과 결정 구조 (위성)로부터 공지 된 위치 사이의 거리 정보를 획득하기 위해 사용된다. 연속적인 실험에서 안테나와 여러 개의 위성들 사이의 거리가 측정되고, 상기 안테나의 위치는 베이지안 파라미터 추정에 기초하여 통계적으로 엄격한 분석 기법에 의해 결정된다. 결과적으로, 상기 안테나의 위치를 ​​가장 가능성뿐만 계산되지만 완전한 3D 불확실성 분포 소위 후방은 신뢰할 볼륨 시각화. 더욱이, NPS smFRET 완전한 네트워크 (27)의 분석을 허용하도록 확장되었다. NPS는 진핵 전사 중요한 질문 상류 DNA, 비 - 주형 DNA 및 RNA 중합 효소 II 신장 공동 내의 초기의 mRNA 즉 과정들을 해결하기 위하여 사용되어왔다또한 전사 개시의 효과를 보여주는 mplex 12, 28, 26 요인 29 오픈 프로모터의 동적 구조는 복잡. 더욱이, NPS는 전사 연장 인자 Spt4 / 5 (31)와 동일한 위치에 경쟁적으로 결합하는 전사 개시 인자 TFE의 위치는 고세균 RNA 폴리머 라제 오픈 착체 (30)의 특히 구조를 규명 하였다. 이후 smFRET 기반 구조 방식의 수는 15, 18, 21, 23을 발표 하였다. 다른 smFRET 기반 구조 방법을 비교하면,이 방법의 정밀도 명백한 색소 모델의 특정 선택에 크게 의존하는 것이 분명해진다. 하나는주의해야염료 분자는 지역 환경에 따라 서로 다른 공간과 배 양성 문제가 발생할 수 있습니다. 이를 위해, 빠른 NPS는 32 도입되었다. 고속 NPS 크게 계산 시간을 감소시키는 향상된 샘플링 알고리즘을 사용한다. 또한, 고속 NPS는 하나의 구조 분석을 수행하고 각 염료 분자의 사용자는 다음에 설명한다 다섯 가지 염료 모델 세트를 선택할 수 있습니다. 고전 불리는 가장 보수적 모델 염료는 하나이지만 알려지지 않은 위치를 차지하는 것으로 가정한다. 이 위치에서, 형광 물질은 크기가 각각의 (시간에 따른) 형광 이방성 결정하는 콘에서 자유롭게 회전 할 수있다. 원뿔의 방향으로 측정 된 거리 smFRET 효율 변환시 큰 불확실성에 이르게하는 공지되지 않는다. 그것은 다른 염료 모드에 비해 작은 정밀도로 이끌 것이기 때문에 이러한 점에서, 모델은, 보수적LS. 매우 짧은 거리를해야 띄게 잘못된 위치 결정에 클래식 모델 리드에 의해 가정. 전형적인 smFRET 값의 경우, 정확한 위치는 항상 비교적 큰 신뢰할 수있는 볼륨에 묶여 있습니다. 보다 정밀 바람직하므로 그러나, 개발 및 정밀도를 향상시키기 위해 도움이 될 다른 염료 모델을 시험하는 것이 중요하다. 염료 고유의 형광 수명보다 빠르게 회전하면, 소위 ISO 모델을 적용 할 수있다. 여기서, 2 κ 배향 계수 (특성 등방성 포스터 반경을 계산하기 위해 필요한 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ) 2/3로 설정됩니다. 전형적인 모델 (32)에서와 비교하여 그 결과 계산 신뢰할 볼륨은 작은 크기의 약 2 명령이다. 빠른 reori뿐만 있도록 형광이있는 환경에서 발견되는 경우에모든 액세스 볼륨 이상이 정해져있는,하지만 또한 빠른 동작은 meanpos 이소 모델이 사용되어야한다. 이 모델에서, 상기 염료는 효과적으로 공간적 평균화 다항식 거리 변환 (15)에 의해 차지되는 평균 하나의 위치를 차지한다. 예를 들어, (일반적으로 소수성) 염료는 친수성 영역, 예를 들면, DNA에 연결되어있는 경우,이 모델이 적용됩니다. meanpos 이소 모델의 적용은 약 2의 팩터에 의해 신뢰할 볼륨의 크기를 더욱 감소 리드. 그러나, 단백질에 결합 염료는 입체적 액세스 볼륨 (AV)의 몇몇 소수성 패치에 가역적으로 결합 할 수 있습니다. 순간적으로이 지역 사이에서 전환하지만, 한 지역이 자유 회전을 겪게하고 내 빠른 현지화 움직임이 가장 VAR-meanpos 이소 모델에 의해 설명되는 형광. 비슷한 상황에있는 염료는 모델이 적용되는 VAR-meanpos을 자유롭게 회전 할 수 없습니다. 더 라 이 모델에 대한 etails는 우리의 최근 출판물 (32)에서 찾을 수 있습니다. 이 모델은 특히 염료 발생할 수있는 다양한 환경을 설명하고이를 적용하는 것은 현명 현지화 정밀도를 최적화에 광범위한 레퍼토리를 제공합니다. 고속 NPS의 특정 위치에 부착 된 각 염료 분자는 FRET-파트너가 서로 다른 모델이 허용되도록, 각각의 모델에 할당 될 수있다. 이 무한한 및 확대에 자연을 모델링 할 수 있습니다. 그러나, 하나의 최종 모델의 조합에 의해 얻어진 결과는 실험 데이터와 일치 여전히되도록 엄격한 통계 학적 테스트를 수행하는 것이 중요하다. 이 시험은 빨리 NPS 소프트웨어에 포함되어 있습니다. 실험 데이터에 고속 NPS를 적용하기 위해 (단지) 세 개의 입력 변수의 측정이 필요하다. 우선, 색소 쌍 특정 등방성 포스터 반경 (/54782/54782eq5.jpg "/&gt;)를 정의 할 필요가 도너 염료. 따라서, 양자 수율 (QY) 상기 도너 형광 발광 스펙트럼과 수용자의 흡수 스펙트럼을 측정 할 필요가있다. 이러한 측정은 수행 될 수있다 표준 분광기 및 표준 형광 분광기를 사용하여 대량. 각각의 쌍의 경우, R 0은 프리웨어 PhotochemCAD을 사용하여 계산되고, NPS 분석에 사용될 수있다. 또한, 염료 분자 (시간 - 분해) 형광 이방성 필요 편광 (시간)에 민감한 형광 분광기를 사용하여 얻을 수있다. 그러나, 고속 NPS 가장 중요한 입력 파라미터는 전반사 형광 현미경 (TIRFM)와 같은 단일 분자 형광 현미경 설정에서 측정 smFRET 효율이다 . 여기서는 smFRET 데이터를 획득하고 고속 NPS (도 1)를 적용하는 단계별 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Flowchamber 준비</td></tr><tr><td>맞춤형 메탈 샘플 홀더</td><td>자체 제작</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>석영 유리 슬라이드, 76&nbsp; mm x 26&nbsp; mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립, 60 mm x 24&nbsp; mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>세제, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>초순수 Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Zepto 플라즈마 클리너</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.</td><td>시그마-알드리치</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>메톡시 PEG-숙시니미딜 발레레이트, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 PEG-숙시니미딜 발레레이트, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 바이오카보네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>S5761 시그마&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2127 시그마-알드리치&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>밀봉 필름 (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 유연한 실리콘 튜빙, 0.8&nbsp; mm ID, 2.4&nbsp; mm OD</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>미세 구경 폴리에틸렌 튜브, 0.58mm ID, 0.96mm OD(Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Total internal reflection fluorescence microscope</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>다이오드 펌핑 고체 레이저, 491nm, Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>다이오드 레이저 643nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>이색성 거울, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>이색성 거울, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>음향 광학 조정 가능 필터</td><td>AA Opto-Electronic</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>플라노-볼록 원통형 렌즈, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>플라노-오목 원통형, f = -300&nbsp; mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프리즘, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>초점 렌즈, f = 75&nbsp; mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 스테퍼 모터, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>압전 액추에이터, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR 다이오드 레이저</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>자동 초점 시스템의 일부</td></tr><tr><td>이색성 거울, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>위치 감지 검출기(PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>자동 초점 시스템</td></tr><tr><td>침수 대물렌즈의 일부, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>이색성 거울, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>방출 경로</td></tr><tr><td>방출 필터의 일부, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>녹색 채널 방출 경로</td></tr><tr><td>방출 필터, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760 방출 경로 EMCCD 카메라의 3RD660-760</td><td>빨간색 채널</td></tr><tr><td>, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Miscellaneous</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>UV-VIS 분광계</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>형광 분광계</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>EM-CCD 카메라</td>Apt 사용자 유틸리티용 <td>Andor</td><td></td> 제어 소프트웨어</tr><tr><td>&nbsp; (V1.022)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>피에조 모터용 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>접착제</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nile red</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>avidin-coated 형광 multispec 비즈&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>기술 컴퓨팅 언어 custon 작성 소프트웨어</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>과학 그래프 및 데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>흡수 큐벳 1&nbsp; cm 경로 길이</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>형광 큐벳 경로 길이 3mm</td></tr></tbody></table>

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 fret

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer(smFRET)를 사용하여 생체 분자 복합체에 대한 구조 정보를 실시간으로 얻을 수 있습니다. 따라서 다중 smFRET 측정을 사용하여 삼변측량을 통해 단백질 복합체 내부의 알려지지 않은 염료 위치를 국소화합니다. 정량적 정보를 얻기 위해 NPS(Nano-Positioning System)는 확률론적 데이터 분석을 사용하여 X선 결정학의 구조 정보를 단일 분자 형광 데이터와 결합하여 가장 가능성이 높은 위치뿐만 아니라 실험적 불확실성을 나타내는 사후라고 하는 완전한 3차원 확률 분포를 계산합니다. 이 개념은 수많은 염료 분자를 포함하는 smFRET 네트워크 분석을 위해 일반화되었습니다. NPS의 최신 버전인 Fast-NPS는 마르코프 체인 몬테카를로 샘플링 및 병렬 템퍼링을 기반으로 하는 베이지안 매개변수 추정을 사용하는 새로운 알고리즘을 특징으로 하여 비교적 짧은 시간에 대규모 smFRET 네트워크를 분석할 수 있습니다. 또한 Fast-NPS를 사용하면 각 염료에 대해 5가지 모델 중 하나를 선택하여 사후를 계산할 수 있으며, 이는 염료 분자가 국소 환경으로 인해 나타내는 다양한 공간 및 방향 거동을 설명합니다.
여기에서는 smFRET 데이터를 얻고 Fast-NPS를 적용하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Fast-NPS의 세 가지 입력 매개변수, 즉 smFRET 값, 염료 분자의 양자 수율 및 이방성을 획득하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. 최근 NPS는 고풍스러운 개방형 프로모터 단지의 건축을 밝히는 데 사용되었습니다. 이 데이터는 5가지 서로 다른 염료 모델이 사후 분포에 미치는 영향을 입증하는 데 사용됩니다.

전사는 모든 생물의 유전자 발현의 첫 단계이다. 고세균에서 전사 단일 RNA 폴리머 라제 (RNAP)에 의해 수행된다. 진핵 생물에 비해 고세균 RNAP는 간단 전사 기계를 갖는 동안 자신의 진핵 대응에 눈에 띄는 구조 닮았다. 따라서 고세균는 RNA 중합 효소 II (POL II)에 의해 진핵 전사 개시를 연구하기위한 모델 시스템으로 사용할 수있다. 최근 고세균 RNA 중합 효소 열린 복합체의 전체 구조는 단일 분자 FRET 및 NPS에서 결정되었다. NPS 분석 데이터는 전사 개시의 메커니즘에 대한 유용한 정보를 제공하는 완전한 오픈 고세균 프로모터 착체의 모델을 구축 하였다. 이 구조를 해명하기 위해, smFRET 효율은 오픈 프로모터 COM 위치한 알 안테나 염료 분자 사이에서 측정했다플렉스 및 위치 결정 구조 (PDB-ID : 2WAQ)에서 알려진 RNAP, 다섯 참조 사이트에 포함 된 몇 가지 알려진 위성 염료 분자 (37). 안테나 염료 비 주형 DNA, TFB, TBP TFE 또는 다른 위치 중 하나에 장착 하였다. 본 연구에 사용 된 전체 네트워크의 60 측정 거리로 구성되었다. 도 7은 NPS 분석에서 내장 완전한 오픈 고세균 프로모터 착체의 모델을 도시한다. 그것은 이중 가닥 프로모터 DNA (빛과 진한 파란색), (회색)에 RNA 중합 효소 및 전사 개시가 (보라색) TBP 요인을 포함, TFB (녹색) 및 TFE (노란색). 모델은 전형적인 모델 (A)에서 ISO 모델 (B)을 사용하여 계산 하였다 NPS 분석 믿을만한 볼륨은 meanpos 이소 모델 (C)에서, VAR-meanpos 이소 모델의 결과와 중첩 (D) 및 VAR-meanpos 모델 (E). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> 그림 1 : 빠른 NPS 계산에 필요한 매개 변수의 수집 및 처리의 흐름. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> 그림 2 : smFRET 이벤트의 실시 형광 강도의 시간 추적. smFRET, II : 도너 (녹색), 세 개의 특징적인 단계, 즉 I 나타내는 수용체 분자 (적색)의 형광 강도 도너 형광 수용체 광표백 후 III : 도너 광표백 후 배경 형광.g2large.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> 그림 3 : smFRET 실험에 대한 유량 용기의 도식입니다. 흐름 챔버는 아크릴 유리 홀더와 사용자 정의 금속 홀더에 장착된다. 유동 챔버의 샌드위치 디자인은 석영 유리 (용융 실리카) 입구 및 출구 호스, 밀봉 막과 유동 챔버를 폐쇄하는 커버 슬립을 부착하기위한 구멍이 슬라이드를 포함한다. TIRF 조명의 프리즘 유동 챔버의 아래쪽에 장착된다. 중공 탭 나사는 유량 용기의 입구와 출구를 제공한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img> 고도 = "그림 4"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg"/&gt; 도 4 : 석영 유리 슬라이드와 밀봉 필름의 제조. 밀리미터 (주어진)의 구멍의 위치를 ​​나타내는 석영 유리 슬라이드 기계 도면. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> 그림 5 : 유량 용기의 기계 도면. 유리 홀더 알루미늄 장착 프레임 아크릴 알루미늄 프리즘 홀더에 대한 조치는 밀리미터에 제시되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> igure 6 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; 그림 6 : smFRET 실험에 사용되는 프리즘 형 TIRF 설정의 도식 그림. 광학 부품에 대한 약어 : A, 조리개; DM, 다이크로 익 미러; F, 방출 필터; L 렌즈; M, 거울; 객관적인 O; P, 프리즘; PSD, 위치 민감한 포토 다이오드; S, 샘플; PS, 위치 단계; T, 망원경. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> 그림 7 : 다른 모델 가정의 시뮬레이션 결과. 모든 사진은 고세균 RNA 중합 효소 보여 함께 프로모터 DNA (각각 tDNA과 파란색 ntDNA 및 시안)에 대한 모델 (PDB-ID 2WAQ, 상위 뷰), TBP (보라색), TFB (녹색) 및 TFE (노란색)고세균 복잡한 30을 엽니 다. 믿을만한 볼륨 (A) 전형적인 모델 (B)에서 ISO 모델 (C)를 meanpos 이소 모델 (D)가 VAR-meanpos 이소 모델 및 (E)가 VAR의 NPS 시뮬레이션 결과에 대해 중첩 -meanpos 모델입니다. 모든 볼륨은 68 % 신뢰도에 표시됩니다. 고전 및 VAR-meanpos 네트워크는 smFRET 데이터와 일치한다. 반면, 모든 염료에 대한 ISO, meanpos 이소 또는 VAR-meanpos 이소 모델 선택 네트워크는 측정 된 데이터와 일치하지 않습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

TIRF 현미경을 사용하여 대규모 공여체-수용체 네트워크에서 smFRET 데이터를 얻기 위한 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 베이지안 추론 소프트웨어인 Fast-NPS를 사용한 이러한 측정의 단계별 분석은 적응된 염료 모델의 적용을 통해 고분해능 구조 정보를 산출합니다.

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Fast Nano-positioning 시스템의 전반적인 목표는 단일 분자 FRET 실험과 엄격한 통계 분석을 결합하여 생체 분자의 실시간 구조 정보를 제공하는 것입니다. 이 방법은 표준 구조 생물학 도구를 적용할 수 없는 거대분자에서 유연한 도메인의 국소화와 같은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답합니다. 다른 FRET 기반 구조 도구와 비교하여 빠른 NPS의 주요 개선 사항은 가장 가능성이 높은 위치뿐만 아니라 3차원 확률 분포를 사용하여 다양한 염료 모델을 비교할 수 있다는 것입니다.이 기술의 주요 장점은 단백질 데이터베이스의 구조 데이터를 정량적 단일 분자 형광 측정과 결합한다는 것입니다. 절차를 시작하려면 플로우 챔버와 샘플 홀더를 조립합니다. 입구 및 출구 나사를 준비하려면 실리콘 튜브를 속이 빈 탭 나사에 끼우고 면도날로 튜브의 양쪽 끝을 똑바로 자릅니다.탭 나사를 샘플 홀더에 나사로 고정합니다. 플로우 챔버의 석영 슬라이드 구멍을 샘플 홀더 나사산에 맞춥니다. 유리 홀더 나사를 부드럽게 조여 흐름 챔버를 제자리에 고정합니다.20cm 길이의 실리콘 튜브 조각을 입구 및 출구 나사에 끼웁니다. 500마이크로리터의 PBS로 플로우 챔버를 세척합니다. 그런 다음 PBS에 100마이크로리터의 중성자 용액으로 플로우 챔버를 세척하여 흡입구 튜브 끝에 물방울이 형성되어 공기가 시료 챔버로 유입되는 것을 방지합니다.Clamp 흐름 챔버에서 공기를 배제하기 위해 모든 조작 후에 입구와 출구 튜브를 닫습니다. 챔버를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS로 뉴트라비딘 용액을 씻어냅니다.프리즘에 이멀젼 오일 한 방울을 떨어뜨리고 프리즘을 샘플 챔버에 나사로 고정합니다. 단일 분자 FRET 데이터는 전반사 형광 현미경을 사용하여 획득합니다. 카메라 소프트웨어와 스테이지 피에조 모터 소프트웨어를 시작합니다.챔버를 TIRF 현미경의 마이크로미터 스테이지에 가능한 한 직선으로 수평으로 장착하고 세 개의 레이저가 모두 교차하는 방식으로 장착합니다. 침수 액체를 추가하고 IR 반사를 확인하여 현미경 대물렌즈의 초점을 맞춥니다. 카메라 매개변수, 파일 경로 및 자동 증가 매개변수를 설정합니다.라이브 카메라 피드를 시작하고 최대 강도의 세 가지 레이저를 모두 사용하여 배경 형광을 표백합니다. 그런 다음 레이저 강도를 낮추십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 형광 비드 용액을 챔버에 로드합니다.비드가 챔버 표면에 결합될 때까지 10분 동안 기다립니다. 50 - 100 beads의 시야각으로 동영상을 녹화하고 높은 피크 발견 임계값으로 배치 분석을 수행합니다. 동영상 파일을 로드하고 시야의 반대쪽 모서리에 뚜렷한 중심이 있는 두 개의 구슬을 선택합니다.해당 구슬에서 최대 강도의 픽셀을 선택합니다. 프리즘을 제거하고 청소하십시오. 두 번째 시료 챔버를 준비하고 프리즘 홀더를 챔버에 나사로 고정합니다.챔버를 마이크로미터 스테이지에 장착합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 50-100피코몰라 용액의 비오틴화 형광 표지 샘플을 챔버에 로드합니다. 분자가 챔버 표면에 결합할 때까지 기다립니다.동시에 Take Signal을 클릭하여 기록을 시작하고 기증자 여기 레이저를 켭니다. 레이저 출력을 조정하여 시야에 있는 분자의 최소 80%가 표백되도록 한 다음 챔버를 이동하여 표백되지 않은 영역을 표시하고 다음 영화를 녹화합니다. 이런 식으로 샘플 챔버의 나머지 부분을 표백합니다.TIRF 현미경에서 측정한 후 획득한 단일 분자 FRET 데이터를 분석하여 평균 FRET 효율을 산출해야 합니다. 샘플의 donor 및 acceptor 동영상에 대한 배치 분석을 수행합니다. 그런 다음 데이터 분석 소프트웨어에서 일괄 처리된 동영상 파일을 로드합니다.NOT Selected 버튼을 클릭하여 개별 FRET 위상을 표시합니다. FRET 기간의 시작 부분을 클릭하고, 그 다음에는 백화로 인해 수용체 강도가 감소하는 시점을 클릭하고, 마지막으로 표백으로 인해 공여체 강도가 감소하는 시점을 클릭합니다. 다음 창에서 예를 선택하여 선택한 FRET 효율 추적을 유지합니다.모든 분자가 분석되면 흔적을 저장하고 다음 영화를 분석합니다. 분석이 완료되면 스크립트를 실행하여 FRET 결과를 결합합니다. 결합된 프레임별 FRET 파일을 기본 입력 옵션을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어로 가져올 수 있습니다.데이터를 히스토그램으로 플로팅하고 비선형 곡선 피팅 툴을 사용하여 가우스에 피팅합니다. 초과 값은 주요 FRET 효율입니다. UV VIS 및 형광 분광법을 사용하여 각 염료에 대한 등방성 Forster 반경과 정상 상태 이방성 값을 측정합니다.나노 포지셔닝 시스템은 잘 알려진 GPS에서 영감을 얻었으며, 알 수 없는 위치인 안테나를 여러 알려진 위치와 함께 위성과 함께 지역화할 때 사용됩니다. NPS 분석을 시작하려면 FastNPS 소프트웨어를 시작하고 새 작업 파일을 만듭니다. 레이블이 지정된 안테나 및 위성의 위치 우선순위를 정의하려면 ModelDyePrior 창에서 정의되는 위치의 공간 해상도를 입력합니다.대응하는 중심에 있는 PDB 파일을 불러와 거대분자 내부를 제외합니다. dye diameter와 skeletonization distance를 입력합니다. 가능한 염료 위치의 최소 및 최대 위치 좌표를 입력합니다.정의되는 위치가 위성인 경우 플렉시블 링커를 통해 염료 부착을 선택하고 중심이 지정된 PDB 파일에서 원자 좌표를 입력합니다. 링커의 길이와 지름을 입력합니다. calculate accessible volume(액세스 가능한 볼륨 계산)을 클릭하고, 위치를 이전에 저장하고, 시각화를 위해 내보냅니다.모든 위성 및 안테나에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 위치가 정의되면 Define Measurement 창을 열고 새 염료 분자를 만듭니다. 해당 염료와 연결된 이전 위치를 로드합니다.fluorescence anisotropy(형광 이방성)를 채우고 적절한 염료 모델을 선택한 다음 염료를 활성화합니다. 모든 염료가 정의될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 새 측정을 만듭니다.정의된 염료에서 FRET 쌍을 선택합니다. 오류가 있는 단일 분자 FRET 효율과 이 염료 쌍의 등방성 Forster 반경을 입력하고 측정을 활성화합니다. 모든 염료 쌍에 대해 이 작업을 반복합니다.그런 다음 계산 창을 엽니다. 염료가 다른 모델에 할당된 경우 사용자 정의(User Defined)를 선택합니다. 그렇지 않으면 모든 염료에 사용할 모델을 선택합니다.계산을 수행하고 결과 창을 엽니다. FastNPS를 사용할 때는 일관성을 유지하면서 신뢰할 수 있는 부피를 최소화하기 위해 모든 염료에 대해 모델을 조정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 농도가 90%보다 낮으면 자세한 농도를 클릭하고 농도가 90% 미만인 항목에 공통적인 염료를 식별합니다.Define Measurement 창을 열고 해당 염료의 모델을 변경합니다. 사용자 정의 모드에서 계산을 다시 실행합니다. 신뢰할 수 있는 양의 염료를 단독으로 또는 배치로 내보냅니다.시각화 소프트웨어에서 밀도 파일을 열고 원하는 수준으로 신뢰성을 조정합니다. 고세균 RNA 중합효소 개방 프로모터 복합체 내에서 알려지지 않은 안테나 분자와 알려진 여러 위성 분자 사이에서 단일 분자 FRET 효율을 측정했습니다. 이 데이터의 NPS 분석은 고세균 RNA 중합효소 개방 프로모터 복합체에 비해 이러한 염료 분자의 신뢰할 수 있는 부피를 측정했습니다.염료 분자를 사용한 5가지 모델을 선택하고 결과를 비교했습니다. 신뢰할 수 있는 부피는 염료가 방향을 알 수 없는 원뿔 내에서만 자유롭게 회전할 수 있다고 가정한 모델로 계산했을 때 측정된 데이터와 일치했습니다. 특히 클래식 모델은 염료가 고정된 위치에 있다고 가정하기 때문에 가장 보수적입니다.이렇게 하면 상대적으로 큰 신용 볼륨이 생성되지만 볼륨은 일반적으로 올바른 위치를 둘러쌉니다. 고정밀 모델은 염료가 형광 수명 내에서 완전히 자유롭게 회전한다는 가정을 사용합니다. 클래식 모델과 마찬가지로 iso 모델은 염료가 접근 가능한 부피 내에서 고정된 위치에 있다고 가정합니다.meanpos-iso 모델은 가능한 모든 위치에 대해 동적 평균을 가정합니다. iso 모델의 신뢰할 수 있는 볼륨은 비 iso 모델로 계산된 볼륨보다 훨씬 작지만 측정된 데이터와 일치하지 않습니다. 우리는 기존 구조 도구로는 해결할 수 없는 문제인 과도 복합체의 동적 구조 정보를 캡처할 수 있는 기술을 개발하고 싶었습니다.단일 분자 FRET 데이터가 기록되면 FastNPS 분석이 몇 시간 내에 완료되어 다양한 염료 모델을 빠르게 비교할 수 있습니다. 이 절차에 따라 실험적 단일 분자 FRET 데이터와 일치하는 구조화된 모델을 얻기 위해 MD 시뮬레이션과 같은 다른 방법을 나중에 수행할 수 있습니다.

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