Name: 세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 단백질 케이지 내에서 코발트 도핑 마그네토페라틴을 합성하고 양이온화하여 줄기세포에 효율적으로 결합시키는 방법을. 이 기술은 MRI 및 자기 세포 분리 등 다양한 생의학 응용 분야에서 세포 마그네틱 라벨링을 가능하게 합니다.

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이 작업은 Engineering and Physical Sciences Research Council(EPSRC 부여 코드 EP/G036780/1)이 후원하는 Bristol Centre for Functional Nanomaterials를 통해 자금을 지원받았습니다.

인간 중간 엽 줄기 세포 (hMSC)는 브리스톨 Southmead 병원 연구 윤리위원회의 지침에 가득 따라 (참조 # 078 / 01) 및 환자의 동의를 얻은 후에서 고관절 교체 수술을받은 골관절염 환자의 근위 대퇴골 골수에서 수확했다. 1. Magnetoferritin 합성 및 정제 <ol><li> 총론 <ol><li> 금속 전구체의 산화를 제한하는 질소 분위기 하에서 65 ℃에서 밀봉 가능한 이중 자켓 반응기에 magnetoferritin 합성을 수행한다. 주사기 펌프를 이용하여 반응 용기에 뚜껑 액세스 포트를 통해 금속 염 용액과 과산화수소를 주입한다. </li><li> magnetoferritin 합성 한 후, 음이온 교환 크로마토 그래피에 의한 단백질 정제 크기 - 배제 크로마토 그래피, 단백질 캐비티 묶지 않은 나노 입자를 제거하는 (섹션 1.4 참조) 단백질 단량체를 분리 (섹션 1.5 참조). 드브래드 분석을 사용하여 termine 단백질 농도 (1.6 절 참조). </li></ol></li><li> 준비 이전에 합성 <ol><li> 물에 질소 가스 실린더에 접속 된 튜브를 배치 집착 막을 용기를 밀봉하고 약 60 분간 질소 가스를 버블 링하여 탈 이온수 500 ㎖의 탈산 소화. </li><li> 65 ° C에 이중 자켓 반응기에 연결된 수조 가열한다. 약 20 분 동안 버퍼 용액을 통해 질소 가스를 버블 링시켜 용기 및 탈산 소화를 밀봉 반응 용기로의 50 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 완충액 (pH 8.6) 75 mL를 추가. 동시에, 자기 교반기를 사용하여 버퍼 용액을 교반한다. </li><li> HEPES 완충 용액을 탈산 소화 후, 버퍼로부터의 질소 가스를 공급하는 튜브를 제거하고, 질소 분위기를 유지하는 용기에 현탁하고 유지한다. 3 밀리그램 / m의 최종 농도를 달성하기 아포 페리틴 추가엘. 자기 교반을 계속하지만, 거품이 발생하는 경우 교반 속도를 줄일 수 있습니다. </li><li> 탈산 소화를 탈 이온수 50 ml 중에 0.19 g을 용해시켜 황산 코발트 수화물의 25 mM의 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 탈산 소화를 탈 이온수 100 ml 중에 0.98 g을 용해시켜 황산 암모늄 철 수화물 용액을 25 mM의 용액을 제조 하였다. </li><li> 암모늄, 황산 철 수화물 용액 2.5 mL를 제거하고, 황산 코발트 수화물 2.5 ㎖로 교체한다. </li><li> 제 탈산 소화 된 탈 이온수 9 ml의 (/ w 30 W %) 과산화수소 용액 965 μl를 첨가 한 다음 99 ml의 세부 스톡 1 ㎖를 첨가하여 탈산 소화 탈 이온수 과산화수소 8.33 mM의 용액을 조제 탈 산소 탈 이온수. </li></ol></li><li> Magnetoferritin 합성 <ol><li> S 자화 (동시에 아포 페리틴 용액에 철 - 코발트 전구체 및 과산화수소 양의 10.1 ml에 주입tirred) 개의 주사기 펌프를 사용 / 분 0.15 mL의 유속 (총 주입량 : 20.2 mL)을 첨가 하였다. </li><li> 주사 기간 동안, 탈 이온수 500 ml에 다른 탈산 소화. 비고 : 반응 용기의 내용물을 서서히 반응이 진행됨에 따라 짙은 갈색을 채택한다. </li><li> 곧 제의 주입이 완료되기 전에, 철 - 코발트 전구체 및 갓 탈 산소 탈 이온수를 사용하여 과산화수소 용액의 또 다른 100 ㎖를 준비한다. </li><li> 철 - 코발트 및 과산화수소의 새로 제조 한 용액을 사용하여 1.3.1에 기재된 사출 공정을 반복한다. </li><li> 주사 기간 동안, 탈 이온수의 또 다른 500 mL의 탈산 소화, 및 1.3.3 및 1.3.4에 기술 된 바와 같이 진행. </li><li> 세 번째 주사 후, 교반 하에서 15 분간 숙성 용액을 떠난다. </li><li> 용액에서 자유 금속 이온을 킬레이트 화하는 반응 용기에 1 M 시트르산 나트륨 용액 1.5 ml를 추가. </li><li> 반응에서 솔루션을 제거50 ㎖ 원심 분리기 튜브, 4,350 XG에 30 분 동안 원심 분리기와 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 뜨는을 통과로 용기. 이 단계에서, 상청액을 여과 정제 할 때까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 이온 교환 크로마토 그래피 <ol><li> 10 ㎖ / 분의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 양이온 성 매트릭스를 함유하는 컬럼 (20cm 길이 2.5 cm 직경)에 시료를 적재. </li><li> 10 ㎖ / 분의 유속 구배 펌프를 사용하여 버퍼 (50 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스) 완충액의 pH 8.0)을 실행 약 100㎖로 컬럼을 세척 하였다. </li><li> 150, 500, 1000 mM의 NaCl을 최종 농도 각 농도 150 ㎖ : 단백질을 용출, 트리스 완충액에 염화나트륨의 농도가 증가하여 10 ㎖ / 분으로 컬럼을 세척 하였다. </li><li> 단백질은 500 mM의 염화나트륨의 농도에서 용출 된 바와 같이, 자동 분획 수집기를 이용하여 50 mL의 분획을 수집한다. 참고 :를 들어이온 교환 크로마토 그래피의 자세한 프로토콜은 이전에 게시 된 프로토콜을 참조하십시오. (26) </li></ol></li><li> 크기 배제 크로마토 그래피 <ol><li> 4 ml의 부피 단위 다음 15 mL의 원심 분리 필터 장치를 이용하여 약 2 ㎖의 부피로 magnetoferritin의 150 mL로 농축시켰다. 이 절차에 대한 자세한 프로토콜에 대한 원심 필터 유닛의 제조 업체의 지침 (자재 목록 참조)을 참조하십시오. </li><li> 사출 루프를 사용하여 겔 여과 칼럼 상에 농축 시료를 적재. </li><li> 1.3 ㎖ / 분의 유속 (150 mM의 NaCl을 함유하는 50 mM 트리스 완충액의 pH 8.0) 완충액을 실행하여 컬럼을 세척 하였다. </li><li> 자동화 된 부분 Collector를 사용하여 6 ml의 분수를 수집합니다. 단백질 단량체는 지난 용출. 이 시점에서, 정제 magnetoferritin은 양이온 화까지 4 ℃에서 저장 될 수있다. 주 : 겔 여과 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토 그래피에 대한 상세한 프로토콜은 참조 previously 프로토콜을 발표했다. (27) </li></ol></li><li> 단백질 농도를 측정 <ol><li> 시판 말 비장 페리틴을 사용하여 50 mM 트리스 버퍼에 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 ㎎ / ㎖의 페리틴 표준을 준비합니다. 참고 : 시판 페리틴 단백질의 농도는 병에 명시되어있다. 되지 않은 경우,이 정보는 공급 업체에 문의하십시오. </li><li> 용액의 색은 약 0.5 ㎎ / ㎖의 표준 색과 일치 할 때까지 50 mM 트리스 완충액에 미지 농도 magnetoferritin 샘플을 희석한다. 희석 인자를 기록해 둡니다. </li><li> 96 웰 플레이트의 우물에 세중의 각 표준 및 magnetoferritin 샘플의 10 μl를 추가합니다. </li><li> (브래드 포드 분석 시약 자세한 내용은 재료 목록 참조) 각 웰에 기성품 브래드 포드 시약 200 μl를 추가합니다. </li><li> 실온에서 8 분간 인큐베이션. </li><li> 사용하여 λ = 595 nm에서 흡광도를 측정마이크로 플레이트 리더. </li><li> 단백질 농도의 함수로서 페리틴 기준의 평균 흡광도를 플롯하고 magnetoferritin 샘플의 농도를 계산하기 위해 선형 피팅의 기울기와 절편을 사용한다. 참고 : 계정에 표준 곡선에 magnetoferritin 샘플을 조정하는 데 사용 된 희석 배수를 가져 가라. </li></ol></li></ol> 2. Magnetoferritin 양이온 화 <ol><li> 총론 주 : magnetoferritin의 양이온 화를 들어, N, N의 디메틸 -1,3- 프로판 디아민 (DMPA)이 N을 이용하여 MF 표면 아스파라긴산 및 글루탐산 잔기에 결합 된 - (3- 디메틸 아미노 프로필) - N &#39;다이이 미드 하이드로 클로라이드 (EDC). <ol><li> 실온에서 교반하에 반응을 수행. 아래의 프로토콜을 5 ㎖ (단백질 농도 2 ㎎ / ㎖) 총 부피 magnetoferritin 10 ㎎의 양이온 화에 대한 것이다. 그러나, 위 또는 아래로 확장DMPA : EDC 비 일관성뿐만 아니라 버퍼 magnetoferritin 용액의 부피 단백질 유지함으로써. </li><li> 양이온 화 반응 이전에, 50 mM의 NaCl을 함유하는 50mM의 인산 완충액 (pH 7)로 magnetoferritin 샘플을 투석. 이것은 트리스 용출 완충액을 제거하고, 트리스 아민 및 EDC 활성화 된 카르 복실 산 잔기 사이의 원치 않는 반응을 방지하는 것이 중요하다. 투석 후 단백질 농도를 결정하고 / ㎖ 이전 양이온 화 4 밀리그램으로 조정합니다. </li></ol></li><li> 양이온 화 프로토콜 <ol><li> DMPA의 374 밀리그램을 달아 200 mM의 2- (N의 -morpholino) 에탄 설 폰산 (MES) 버퍼의 2.5 ㎖에 용해. </li><li> 농축 (6 M), 염산 (HCL)을 사용하여 용액의 pH를 약 7을 조정한다. 주의 : 흄 후드에서이 단계를 수행은 DMPA에 산의 첨가로는 유독 가스를 방출! </li><li> 4 ㎎ / ㎖에서 magnetoferritin 솔루션의 2.5 ML을 추가 (최종 concenMES의 tration 100㎜로는 magnetoferritin의 최종 농도 / ㎖, 단백질의 총량이 10 mg)을 2 mg을 임. </li><li> 자석 교반기를 추가하고 2 시간이 평형 동안 교반한다. </li><li> 조심스럽게 1 M 염산을 사용하여 pH를 5.0 솔루션을 조정합니다. </li><li> DMPA / magnetoferritin 용액에 EDC 분말 141 mg을 추가합니다. </li><li> 3.5 시간 동안 교반을 계속합니다. </li><li> 모든 침전물을 제거하기 위하여 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 용액을 필터. </li><li> 투석 버퍼를 대체하는 12-14 kDa의 분자량 컷오프 투석 튜브의 용액을 첨가하고 4 ℃에서 2 일 동안 50 mM의 NaCl을 함유하는 50mM의 인산 완충액 (pH 7)의 4 L에 대해 투석 적어도 세 이 기간 동안 번. 참고 :이 시점에서, 양이온 magnetoferritin를 더 사용할 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 양이온 Magnetoferritin 3. 인간 중간 엽 줄기 세포 라벨링 <ol><li> 총론 <ol><l난&gt; 37 ° C, 5 % 이산화탄소 분위기 클래스 II 층류 캐비닛 및 가습 인큐베이터를 사용하여 모든 세포 배양을 수행한다. </li><li> 4 일 - 단층이 175cm 2 플라스크 모든 3 보충 된 배양 배지, 20 ㎖를 사용하는 등 문화 세포. 배양액을 1,000 ㎎ / ℓ의 글루코오스, 10 % (v / v)의 소 태아 혈청, 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액, 1 %를 함유하는 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)로 구성 (V / V) L -alanyl-L 글루타민 용액 5 NG / ㎖로 보충 된 신선한 인간 섬유 아세포 성장 인자. </li></ol></li><li> 양이온 magnetoferritin와 hMSC의 자기 라벨 <ol><li> 종자 15 만 25cm 2 플라스크에 중배엽 줄기 세포와 하룻밤에 37 ° C를 준수 둡니다. </li><li> 필터는 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 양이온 magnetoferritin 소독 및 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 무균 조건 유지, 양이온 magnetoferri의 0.5 μM 용액을 제조인산 주석 식염수 (PBS)를 버퍼. 사용할 때까지 멸균 문화 후드에 덮인 유지합니다. </li><li> 실온 PBS 2 ㎖로 도금 된 세포를 씻으십시오. </li><li> 도금 셀에 살균 양이온 magnetoferritin 용액 1ml를 추가하고 원하는 시간 (1 분에 1 시간) 동안 품어. </li><li> 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.5 mL를 첨가하고 5 분 동안 37 ℃에서 배양하여 PBS로 세포를 수확하고 세포를 세척한다. </li><li> 트립신 / EDTA를 비활성화 524 x g에서 5 분 동안 15 mL의 원심 분리 튜브에서 원심 분리하여 용액을 전송하는 배지 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 뜨는을 취소하고 소 태아 혈청과 PBS에서 2 mM의 EDTA (/ V 승) 0.5 %로 구성, 0.5 ml의에서 세포 펠렛 자기 분리 버퍼를 다시 일시 중지합니다. </li></ol></li><li> 자기 세포 분리 <ol><li> 멀티 스탠드에 자석을 부착하고 자석에 자기 분리 컬럼을 추가 할 수 있습니다. 번째의 사전 분리 필터를 놓고전자 열입니다. </li><li> 사전 분리 필터에 자기 분리 완충액 0.5ml를 배치하고, 필터 및 세척하고 젖은 열 모두를 통해 실행할 수 있습니다. </li><li> 열에서 15 ML의 원심 분리기 튜브를 놓습니다. </li><li> 자기 분리 컬럼의 필터 저장조에 세포 현탁액 0.5ml를 추가. </li><li> 저수지가 비어있는 경우, 자기 분리 버퍼의 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 저수지가 비어있는 경우, 자기 분리 버퍼의 추가 0.5 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 한 번 더 (1.5 ml를해야 세척에 사용되는 자기 분리 버퍼의 총 부피)를 반복합니다. 이러한 세척 단계는 컬럼 (비자 성 세포 분획)의 모든 비 - 자성 세포를 용출. </li><li> 자석에서 열을 제거하고 신선한 15 ML의 원심 관에 넣습니다. 열 저수지에서 필터를 제거합니다. </li><li> 리저버에 자기 분리 완충액 1 ㎖를 첨가하고 제조가 제공 플런저를 사용하여 칼럼을 통해 밀어 즉시아르 자형. 이는 원심 분리 튜브 (자화 세포 분획)로 자화 칼럼으로부터 용출 세포. </li><li> 원심 분리기 524 X g에서 5 분 모두 튜브. </li><li> 뜨는을 취소하고 0.3 ml의 PBS의 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 각 분획물의 세포 수의 수를 계산. </li><li> 자화 된 세포의 비율을 결정 M (%)은 다음의 방정식을 사용하여 : <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/54785/54785eq1.jpg" /> N (M)의 자화 분획 및 N의 셀의 수이다 (M + NM)의 자화와 비자 성 분획의 셀의 개수의 합이다. </li></ol></li><li> 유도 결합 플라즈마 광 방출 분광법을 사용하여 철 정량 양이온 magnetoferritin으로 표시 중배엽 줄기 세포를 준비 (ICP-OES) 주 : 프로토콜은 다른 ICP-OES 악기에 적응해야 할 수도 있습니다. 다시와 상담하는 것이 좋습니다책임있는 기술자. <ol><li> g X 524에서 5 분간 세포를 공지 된 수를 원심 분리기. </li><li> PBS를 상층 액을 제거하고 50 % (v / v)의 질산 0.25 ml를 추가합니다. </li><li> 소용돌이는 산성화 세포 현탁액을 섞는다. </li><li> 실온에서 밤새 인큐베이션. </li><li> 각각의 샘플 및 와류 믹스에 증류수 4.75 ML을 추가합니다. </li><li> ICP-OES로 분석합니다. (28) </li><li> 셀룰러 철 함량에 대한 값을 결정하기 위해 셀의 개수에 대한 측정 된 철 함량 정규화. </li></ol></li></ol>

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aurothioglucose로 염색 magnetoferritin 샘플의 TEM은 단백질 케이지 안에 나노 입자의 성공적인 광물을 밝혔다. 전자 회절 및 나노 입자 코어의 라만 분석 코발트 나노 입자 코어의 성공적인 도핑을 나타내는 코발트 페라이트의 존재를 나타내었다. 이는 혼합 산화물 나노 입자가 성공적 아포 페리틴 공동 내에 광화 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 더욱이, 우리는 코발트 도핑 자기 특성의 조정을 가능하게하는 반응 혼합물에 첨가 코발트 전구체의 양을 변화시킴으로써 변화 될 수 있음을 미리 보여 주었다. (18) Magnetoferritin 합성은 그들이 단단히 밀봉하고 반응물 (예를 들면, 3 구 둥근 바닥 플라스크)를 도입 할 수있는 액세스 포트를 가지고, 용기의 다양한 수행 될 수있다. 반응 온도에서 선박을 배치하여 하나 65 ° C로 유지되어야더블 재킷 용기를 사용하여 물 / 오일 목욕이나. 여기서는 합성을 수행하는 이중 쟈켓 전기 화학 셀 셋업을 사용 하였다. 정확한 pH를 유지하고, 수성 용액의 산소 오염을 방지 성공적인 합성을 보장하는 것이 중요하다. 금속 염 용액은 항상 사전에보다는 사용하기 갓 전에 준비를해야합니다. 또한, 상업 apoferritin 솔루션은 품질 변화 및 합성 결과에 영향을 미칠 수있다 (예., 나노 입자 코어 광물의 크기). 그것은 제조자에 의해 사용되는 임의의 잔류 환원제를 제거하기 전에 합성의 50 mM HEPES 완충액 (pH 8.6)로 apoferritin 용액을 투석 것을 도울 수있다. 합성에 사용 된 아포 페리틴 솔루션의 배치 번호를 기록하는 데 유용합니다, 그래서 특별히 추가 자료 요구가 구입하는한다 제조 업체에서 요구 될 수있다. 또한, 시판 아포 페리틴 단백질 농도는 수 있고, 병 명시해야합성에 필요한 아포 페리틴 용액의 부피를 계산하는 데 이용 될 수있다. 그렇지 않은 경우,이 정보 공급자에게 문의. 여기서 이전 보고서에서 제시된 - - 금속 염 및 과산화수소적인 첨가의 장점은 나노 입자 코어 광물 상이한 로딩 인자 (즉, 나노 크기)이 달성 될 수 있도록 제어 될 수 있다는 것이다. (33) 또한, 상기 예는 자기 분리 컬럼, 전자석 내부에 고정 스테인레스 스틸 분말을 충전 한 컬럼을 사용 magnetoferritin 정제 할 수있다. (34) 따라서, 고도로 단 분산 나노 입자 코어는 벌크 magnetoferritin 샘플로부터 분리 될 수있다. 그러나, 자기 셀 라벨에 관해서는 여기에 제시된이 필요하지 않습니다. magnetoferritin 합성의 한계는 약 10 %의 상대적으로 낮은 합성 수율 및 상업 APO-FE의 비교적 높은 비용rritin 솔루션을 제공합니다. 그러나, 아포 페리틴은 확립 탈 광화 프로토콜에 따라 페리틴 싸게 가능한 말의 비장으로부터 제조 될 수있다. (16) magnetoferritin의 양이온 화는 DMPA 250 분자 및 음으로 하전 된 잔기 당 EDC 50 분자의 몰비를 추가함으로써 달성되었다 (계산 말 비장의 페리틴의 아미노산 서열에 기초하여). 단백질을 통해 시약이 초과 또한 이전에 페리틴의 양이온 화에 대한 결과를보고하는 비교 높은 양이온 화 효율성, 결과. MALDI-TOF 분석 apoferritin 및 양이온 apoferritin 35 때문에 magnetoferritin 코어의 과도한 분자량으로 하였다. 높은 양이온 화 효율을 수득하기 위해, 최적 pH는 또한 중요하다. EDC 매개 가교는 약간 산성 조건 하에서 가장 효과적이며, 우리는 pH가 5 magnetoferritin을위한 최적의 양이온 화 결과를 산출 한 것으로 나타났습니다. 그러나, 다른 단백질의 C에 대한ationization의 pH를 최적화 할 필요가있다. 이 심한 침전으로 이어질 수 있기 때문에 양이온 화 또는 단백질의 등전점 부근은 피해야한다. 양이온 magnetoferritin 줄기 세포 자화 고효율이고 배양 시간도 30 분 이하 사용하여 달성 될 수있다. 심지어 1 분 인큐베이션 MRI 용 T2 및 T2 * 콘트라스트에 영향을 요구보고 범위 인 3.6 PG의 셀룰러 철 함량 결과. 36, 37은이 효율 라벨링 낮은 세포 외 철 농도가 달성되는 것이 현저하다. 예를 들어, 음이온 나노 입자를 사용하여 기존의 연구는 5 mM의 철과 30 분 잠복기 후 세포 당 10 페이지의 철 수준을보고합니다. 비교 (38)는 0.5 μM 단백질을 함유하는 양이온 용액 magnetoferritin 배양은 약 0.2 밀리미터 철 인큐베이션에 대응하고, 또한 철 CEL 당 약 10 페이지를 얻을30 분 후 리터. 우리는 분명히 TEM을 사용하는 endocytotic 소포를 식별 할 수 없습니다. 그러나, 양이온 페리틴을 사용하여 기존의 연구는 국제화 노출의 처음 10 분 이내에 발생한 것으로 나타났습니다. 39, 40 양이온 페리틴은 clathrin- 또는 카베 올린 따라 세포 내 이입을 나타내는 코팅 된 소포, 지역화 될 수있다. 동일한 연구에서도 30 분간 인큐베이션 한 후, 양이온 페리틴이 리소좀 닮은, 세포 표면에 존재뿐만 아니라 multivesicular 체 여전히 것을보고했다. 또한 응용 프로그램은 항암 약물 (41) 또는 양자점 (42)와 같은 다른 나노 입자 및 / 또는 기능 분자,로드 아포 페리틴 케이지의 양이온 화를 포함 할 수있다. 이러한 페리틴 구조의 양이온 화는 세포에 자신의화물을보다 빠르고 효율적으로 전달 될 수 있습니다.

바인딩 표면 또는 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPIONs)의 내재화는 이미징 및 원격 조작 등의 응용 프로그램에 대한 세포 유형의 다양한 자화를 사용할 수있다. (1) 그러나, 충분한 세포 자화를 달성하면 SPION 및 세포 표면 사이의 상호 작용이 약한 경우, 특히, 도전 일 수있다. 과거 장기간 노출 또는 높은 SPION 농도 2는 이러한 문제를 극복하기위한 전략으로 사용되어왔다. 그들은 독성 5,6 증가 및 림프구의 낮은 국제화 속도와 세포 유형에서 매우 제한적인 성공이 있기 때문에 3,4 그럼에도 불구하고, 이러한 전략은 문제가있다. 7 SPIONs의 세포 흡수를 강화하기 위해, 여러 가지 표면 기능화 방식이 모색되고있다. 비특이적 섭취는 형질 A를 사용하여 달성 될 수 있지만 예를 들어, 항체는 수용체 - 매개 엔도 시토 시스 8을 촉진하는데 사용되어왔다신사 9, 10 또는 HIV의 문신 펩타이드로 세포 관통 종. 형질 전환 에이전트가 나노 입자의 침전을 유도 악영향 세포의 기능에 영향을 미칠 수있는 반면 (11, 12)은 그러나, 항체와 펩타이드의 작용 방식은 고가의 시약 및 복잡한 합성 준비에 의해 제한됩니다. 13, 14 최근 화학 양이온 magnetoferritin의 합성 1 분만큼 짧은 배양 시간을 이용하여 자화 인간 중간 엽 줄기 세포에 매우 효과적 신규 SPION (중배엽 줄기 세포)를보고 하였다. 15 Magnetoferritin는 철 저장 단백질 페리틴의 미네날 캐비티 내부 SPION를 재구성하여 합성된다. 16이 단백질 기반 SPION는 단백질 껍질에 의해 부여 된 자기 코어, 17 ~ 19과 생체 적합성 및 수용성의 자기 특성 제어와 같은 세포 자화하기에 매우 적합하게 많은 속성을 결합합니다. 더욱이이상, 표면 기능화 용이 의한 화학적 20-22 또는 유 전적으로 변형 될 수있는 어드레스 가능한 아미노산으로 이루어진다. 23-25 우리 단백질 쉘의 산성 아미노산 잔기의 화학적 양이온 화 용이 빠르고 지속적인 세포 자화 이어지는 세포 표면의 음이온 성 도메인과 상호 작용 안정한 나노 입자를 생성하는 것으로 나타났다. 이 과정은 힘들고 작용하고 긴 배양 프로토콜의 필요성을 제거하고, 비특이적 라벨링기구 인해 빠른 자화 전략은 다른 세포 유형에 대폭적인 응용을 발견한다. 여기, 우리는 양이온 magnetoferritin의 합성, 정제 및 표면 기능화의 상세한 프로토콜을 포함하는 초고속 셀 라벨 방법의 깊이 보고서를 제시한다.

<table><tbody><tr><td>4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)</td> <td>피셔 사이언티픽</td><td>BPE310-1</td><td>분말; pH 8.6에서 1M 재고 용액을 준비하고 50&nbsp로 희석합니다. 사용하기 전에 mM을 사용하십시오. 합성하기 전에 pH를 주의 깊게 확인하십시오!</td></tr><tr><td>말의 비장에서 아포페리틴</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3641</td><td>우리는 LOT# 081M7011V</td></tr><tr><td>코발트 황산염 헵타하이드레이트를 사용했습니다&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td>은 <td>합성 전에 소금에서 신선한 용액을 준비합니다</td></tr>.<tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1543</td>은 합성 <td>전에 소금에서 신선한 용액을 준비</td></tr>합니다. <tr><td>과산화수소 용액 (30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>합성 전에 소금에서 신선한 용액을 준비</td></tr>합니다. <tr><td>시트르산 나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>분말; 1 M 용액은 몇 개월 동안 실온에서 준비하고 보관할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Millex GP 필터 유닛, 0.22&nbsp; 미크론</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>주사기 필터</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>분말; pH 8.0에서 1M 재고 용액을 준비하고 50&nbsp로 희석합니다. 사용 전 mM</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td>poweder; 필요에 따라 버퍼에 추가하십시오</td></tr>. <tr><td>Centriprep 원심 필터 유닛</td><td>Merck Millipore</td><td>4310</td><td>Ultracel YM-50 막, 12 ml 용량; 마그네토페리틴 용액이 약 150 ml에서 20&nbsp로 농축될 때까지 초기 농도에 사용하십시오; ml</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 untis</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Ultracel-10 막, 4&nbsp; ml 부피; 마그네토페리틴 용액을 약 20ml에서 농축하는 데 사용&nbsp; 2 ml</td></tr><tr><td>ANX Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1287-04</td><td>우리가 직접 이 칼럼을 포장했습니다</td></tr>. <tr><td>HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR 칼럼&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-1196-01</td><td>이 칼럼은 준비된 포장&Auml로 구입되었습니다</td></tr><tr><td>. KTA 정제 시스템</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td></td></tr><tr><td>시료 펌프 P-960</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6727-00</td>은 <td>10ml/min의 유속으로 시료를 로드합니다</td></tr>. <tr><td>자동 분획 수집기 Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 분석 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916</td> 용액은 즉시 <td>사용 가능한</td></tr><tr><td>페리틴, 유형 I: 말 비장</td><td>Sigma Aldrich에서 추출합니다.</td><td>F4503</td>은 <td>마그네토페리틴 농도를 측정하기 위해 이 용액에서 페리틴 표준물을 준비합니다</td></tr><tr><td>N,N-dimethyl-1,3-propanediamine (DMPA)Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>308110</td><td>주의: DMPA 용액의 pH를 조정할 때 흄 후드에서 이 단계를 수행하십시오</td></tr><tr><td>N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride ( EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6383</td>은 <td>냉동실에 보관하되 병을 열기 전에 실온에 두십시오.</td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>AppliChem</td><td>A0689,0500</td><td>분말; pH 5 투석 튜브에서 200M 저장 용액을 준비</td></tr>하십시오. 셀<tr><td>룰로오스 멤브레인</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9652</td>는 <td>사용하기</td></tr> <tr><td>전에 탈이온수에 10분 담가둡니다.둘베코' 의 변형된 독수리' s 매체 (DMEM), 1,000 mg/L 포도</td>당 <td>시그마 Aldrich</td><td>D5546</td><td>37°C에서 따뜻하게; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>DMEM 병에 추가, 10%(v/v) 최종 농도</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td>DMEM 병에 추가, 1%(v/v) 최종 농도</td></tr><tr><td>glutamax 용액</td><td>Gibco</td><td>35050-087</td><td>DMEM 병에 추가, 1%(v/v) 최종 농도</td></tr><tr><td>인간 섬유아세포 성장 인자</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td>는 <td>각 매체 변경과 함께 세포 배양 플라스크에 DMEM에 새로 추가합니다. 최종 농도 5 ng/ml</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>멸균 용액, 세포 cultrue</td></tr><tr><td>트립신/EDTA 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td>는 <td>냉동고에 보관하고 37&nbsp; &데그; 사용 전 C 수조:</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>분말; PBS에서 2 mM 용액을 만드십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td>은 <td>2&nbsp에 0.5%(w/v)를 추가합니다. PBS의 mM EDTA 솔루션; 자석 교반기로 조심스럽게 저어주고 거품이 생기지 않도록 하십시오. 필터는 0.22 마이크론 주사기 필터</td></tr><tr><td>MACS 멀티 스탠드</td>를 통해 살균합니다.<td>MACS 자석 MACS MS 컬럼 부착용</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td></tr><tr><td></td><td>일</td><td></td><td>회용; 일회용이지만 멸균이 필요하지 않은 경우 재사용할 수 있습니다: 탈이온수와 100% 에탄올로 세척하고 건조 오븐에 넣으십시오. 녹슨 패치가 보이면 버리십시오.</td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기 자석</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td>컬럼 및 스탠드와 함께 스타터 키트로 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>MACS 컬럼 사전 분리 필터</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>30mm 필터</td></tr><tr><td>질산 용액, 64-66%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7006</td><td></td></tr><tr><td>Titrando 907, 주사기 펌프</td><td>Metrohm</td><td>2.907.0020</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">magnetoferritin 및 양이온화된 magnetoferritin을 특성화하는 데 사용되는 장비</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>분자 장치</td><td></td><td>Bradford 분석에서 흡광도를 측정하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>JEM 1200 EX</td><td>JEOL</td><td></td><td>마그네토페리틴</td></tr><tr><td>InVia 라만 분광계</td>의 TEM 이미징에 사용 <td>Renishaw</td><td></td><td>라만 분광법에 사용</td></tr><tr><td>토러스 DPSS 레이저</td><td>레이저 양자</td><td></td><td>라만 분광법에 사용</td></tr><tr><td>Bruker UltrafleXtreme</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>아포페리틴 및 양이온화된 아포페리틴의 MALDI-TOF 분석에 사용되는</td></tr><tr><td>ZetaSizer Nano-ZS</td><td>Malvern 기기</td><td></td><td>마그네토페리틴 및 양이온화된 마토페리틴 자기 특성 측정 시스템의 유체역학적 직경 및 제타 전위를 측정하는 데 사용</td></tr> 자기 <tr><td>포화</td><td>모멘트 및 자기 감수성을 측정하는 데 사용</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetom Skyra</td><td>Siemens</td><td></td><td>종단 및 횡방향 이완성을 결정하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnai 12 BioTwin Spirit</td><td>FEI</td><td></td><td>양이온화된 마그네토페리틴</td></tr><tr><td>710 ICP-OES</td><td>애질런트로</td><td></td> 표지된 hMSC의 TEM 이미징에 사용 <td>세포의 철 함량을 측정하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 magnetoferritin의 합성

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

이러한 세포 이미징 및 원격 조작 등의 많은 중요한 생물 의학 응용 프로그램은, 초상 자성 산화철 나노 입자 (SPIONs)으로 세포를 라벨링함으로써 달성 될 수있다. SPIONs 충분한 세포 흡수를 달성하는 것은 전통적 SPIONs의 상승 된 농도에 세포를 노출시킴으로써 또는 (72 시간까지) 노출 시간을 연장 충족 된 도전이다. 그러나, 이러한 전략은 독성을 매개하는 것으로 보인다. 여기서는 단백질 기반의 SPION magnetoferritin의 합성뿐만 아니라, 낮은 노출 농도를 이용하여 빠른 셀 자화를 가능하게하는 용이 ​​한 표면 기능화 프로토콜을 제시한다. magnetoferritin의 SPION 코어 말 비장 아포 페리틴의 캐비티 내측 8.2 나노 광물의 평균 입자 직경을 갖는 코발트 - 도핑 된 산화철로 구성된다. magnetoferritin 화학 양이온 화 같이 배양 시간을 사용하는 신규 한 인간 중간 엽 줄기 세포를 자화 막은 높은 활성 SPION (중배엽 줄기 세포)를 제조0.2 mM 이상 기온으로 일분 철 농도 짧게.

TEM은 apoferritin 캐비티 내부 나노 광물을 확인하고 평균 코어 크기 (도 1A 및 1B)를 결정하는 데 사용되었다. 흠 magnetoferritin 샘플 이미지 분석은 8.2 ± 0.7 nm의 평균 코어 직경을주고, aurothioglucose 얼룩 단백질 케이지 내의 나노 입자의 존재를 확인했다. 이미지가 더 균일 한 나노 입자 코어를 분리, 자기 분리를 이용하여 정제 하였다 magnetoferritin 시료를 표시합니다. 자기 정제되지 않은 샘플 Magnetoferritin 약간 넓은 코어 크기 분포를 갖는다. 선택 영역 전자 회절을 사용 magnetoferritin 코어의 구조 (29) 분석이 가능 마그네타이트에 기초하여 상기 역 스피넬 구조의 존재 FE (3 O 4) 및 / 또는 마그 헤 마이트 (γ-FE 2 O 3)뿐만 아니라, 등을 지시 스피넬 구조 CO 3로 인한 </서브&gt; O 4. 또한, 라만 스펙트럼의 Fe 3 O 4, 작은 γ-철 2 O 3의 양, 및 코발트 페라이트 (그림 1 C)에 의한 피크를 한 것으로 밝혀졌습니다. magnetoferritin의 ICP-OES 분석 magnetoferritin 밀리그램 당 코발트 철 102 μg의 0.9 μg의 평균을 나타내었다. 도식은 다음 양이온 화 단계 (그림 2 A)을 보여주는 포함되어 있습니다. 동적 광 산란에 의해 측정 magnetoferritin 및 양이온 magnetoferritin의 수력 학적 지름은 각각 11.8 ± 1.1 내지 12.5 ± 1.4 나노 미터이었다. magnetoferritin에 공유 결합 DMPA의 양이온 화 효율 제타 전위차 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 (MALDI-TOF) 질량 스펙트럼을 사용하여 평가 하였다. 제타 전위는 확인, 양이온 magnetoferritin에 대한 + 8.3 MV에 MF에 대한 -10.5 MV 변경양의 (표 1)에 음의 표면 전위의 변화. 질량 분석 실험은 기본 아포 페리틴 및 양이온 아포 페리틴 (그림 2 B)에 대한 21.1 kDa의 20.1 kDa의의 서브 유닛 분자량을 발견했다. 이 질량 증가는 약 12 ​​DMPA 결합 단백질 서브 유니트 당 분자 전체 24 서브 유닛 단백질의 288 잔기의 양이온 화에 해당한다. 자기 포화 및 감수성은 SQUID magnetometry를 사용하여 측정하고, 횡 방향 및 종 이완성은 자기 공명 영상을 이용하여 측정 하였다. 자기 특성 양이온 화는 동봉 된 SPION (표 1)의 자기 특성에 무시할 영향을 미치고 있음을 나타냅니다 magnetoferritin 및 양이온 magnetoferritin 비슷 하였다. 또한, 이러한 특성은 MAGNE을 양이온 19,30 시연 다른 철 산화물 기반 나노 입자와 유사toferritin는 영상의 명암을 향상에서 기존의 SPION 기반 MRI 조영제로 적합 할 것입니다. 30 분의 노출 후에 세포 표면은 밀집 양이온 magnetoferritin (도 3 A)으로 덮여 있었다. 그러나 일주일 후, 더 나노 입자는 세포 표면 (그림 3 B)에서 찾을 수 없습니다. 양이온 magnetoferritin는 자기 라벨 중배엽 줄기 세포에서 매우 효과적이었다. 특히 1 분간 양이온 magnetoferritin에 세포를 노출시키는 단계 세포 집단의 92 %의 자화 및 셀 당 철 3.6 PG의 전달 결과. 전체 세포 집단 (도 3 C)의 자화 결과 15 분 배양 시간을 증가시킨다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54785/54785fig1.jpg" /> 그림 1 : magnetof의 특성<html> erritin 코어는 5 %, 코발트가 도핑. aurothioglucose (A) 및 염색 (B)로 염색 magnetoferritin의 TEM 화상. 삽입은 자철광 인덱스와 해당 전자 회절을 보여줍니다. 스케일 바 : 20 nm의. magnetoferritin에 대한 (C) 라만 스펙트럼. 화살표는 코발트 페라이트 (T의 2G), 마그네타이트와 마그 헤 마이트 (A 1g 모두)의 주요 라만 진동 모드를 나타낸다. 31,32 사용되는 레이저 파장은 532 nm였다. (오쿠다 등. (18)에서 적응 이미지). 이 magnetoferritin 샘플이 더 균일하게로드 magnetoferritin 입자를 격리 자기 분리를 사용하여 정제되었다고합니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 785fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2 : magnetoferritin의 양이온 화. A) 단백질 표면에 산성 (적색 배포) 기본적인 (노란색) 아미노산 잔기를 나타내는 용매 접근 가능한 표면 영역 표현. (1) Magnetoferritin 단백질 표면 (3)의 산성 아미노산 잔기의 카르 보디이 미드 DMPA 매개 가교시켜 양이온 magnetoferritin (2)로 변경된다. 아포 페리틴 및 양이온 아포 페리틴 서브 유닛의 B) 질량 분광 분석. MALDI-TOF에 의해 생성 된 대량으로 충전 (m / z) apoferritin의 스펙트럼 (ApoF) 및 양이온 apoferritin (고양이 ApoF). 21.1 kDa의 20.1 kDa 내지 질량 증가는 양이온 화 이후에 관찰된다. (코레 Carreira 등의 알에서 적응 이미지. 15) <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 3 : 자기 라벨 및 양이온 magnetoferritin 배양 중배엽 줄기 세포의 세포 분리. 양이온 magnetoferritin와 30 분 배양 후 중배엽 줄기 세포의 A) TEM 이미지입니다. 화살표는 밀집 세포 표면 포장 magnetoferritin 코어의 존재를 나타낸다. 스케일 바 : 200 nm의. 라벨 후 hMSC 일주일 B) TEM 이미지입니다. 세포 표면의 양이온 magnetoferritin 분명하다. 자성 표지의 신속성 조사 C) 세포 집단의 92 %가 magnetoferritin 양이온을 0.5 μM로 1 분 노출 후 착자하고, 전체 세포 집단은 15 분 이내에 자화시켰다. 셀당 철 함량은 ICP-OES를 사용하여 측정 하였다. 세 생물 복제의 평균과 표준 편차가 표시됩니다. 코레 Carreira 등의 알에서 적응 (이미지. 15) <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> MF </td><td> 고양이 MF </td></tr><tr><td> 유체 역학적 직경 [나노] </td><td> 11.8 ± 1.1 </td><td> 12.5 ± 1.4 </td></tr><tr><td> 제타 전위 [MV] </td><td> (-) 10.4 ± 0.2 </td><td> 8.3 ± 0.7 </td></tr><tr><td> 자기 포화 모멘트 [암 2kg -1] </td><td> 54.9 ± 1.6 </td><td> 55.3 ± 1.4 </td></tr><tr><td> 질량 감수성 [이 × 10 4m 3kg -1] </td><td> 1.75 ± 0.08 </td><td> 1.75 ± 0.07 </td></tr><tr><td>세로 이완성 [mM의 -1 초 -1] </td><td> 2.6 ± 0.1 </td><td> 2.3 ± 0.1 </td></tr><tr><td> 가로 이완성 [mM의 -1 초 -1] </td><td> 44.6 ± 1.0 </td><td> 52.8 ± 0.8 </td></tr></tbody></table> 표 1 : magnetoferritin의 물리 화학적 특성 (MF) 및 양이온 magnetoferritin (고양이-MF). (표 코레 Carreira 등의 알에서 적응. 15)

코발트 도핑된 마그네토페리틴의 합성 및 양이온화를 위한 프로토콜과 양이온화된 마그네토페리틴으로 줄기세포를 빠르게 자화하는 방법을 제시합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

이 방법의 전반적인 목표는 단백질 케이지 내부에 자기 나노입자를 합성한 후, 자기 나노입자가 세포에 빠르게 부착될 수 있도록 단백질을 기능화하는 것입니다. 이 방법은 MRI 또는 자기 세포 분리와 같은 응용 분야에 중요한, 세포의 신속하고 효율적인 자기 표지를 가능하게 하는 자기 나노입자를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 나노입자 농도와 짧은 배양 시간으로도 세포 자성화를 달성할 수 있어, 나노입자 노출로 인한 잠재적인 부작용을 방지할 수 있다는 점입니다.먼저, 질소 가스 실린더에 연결된 튜브를 탈이온수에 넣고 용기를 클링 필름으로 밀봉하여 500 milliliters의 탈이온수에서 산소를 제거합니다. 그런 다음, 약 60분 동안 질소 가스를 버블링합니다. 이중 자켓 반응 용기에 연결된 워터 배스를 65 °C까지 가열합니다.그 다음, 50 millimolar HEPES 완충액(pH 8.6) 75 milliliters를 반응 용기에 넣습니다. 용기를 밀폐하고 완충액 용액에 질소 가스를 약 20분 동안 버블링하여 탈산소화합니다. 동시에 마그네틱 교반기를 사용하여 완충액 용액을 교반합니다.HEPES 완충액의 탈산소 처리가 끝나면, 질소 분위기를 유지하기 위해 질소 튜브를 용액 위에 띄운 상태로 유지하며 제거하십시오. 최종 농도가 3 mg/mL가 되도록 apoferritin을 첨가하십시오. 마그네틱 교반을 계속하되, 거품이 발생하면 교반 속도를 줄이십시오.마그네토페리틴 합성을 위해, 두 개의 시린지 펌프를 사용하여 10.1 milliliters의 철-코발트 전구체와 10.1 milliliters의 과산화수소를 0.15 milliliters per minute의 유속으로 apoferritin 용액에 동시에 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 합성 단계를 계속 진행하십시오. 그 후, 연동 펌프를 사용하여 10 milliliters per minute의 유속으로 샘플을 양이온 매질이 포함된 컬럼에 로딩합니다.유속 10 mL/min으로 그래디언트 펌프를 사용하여 컬럼을 약 100 mL의 러닝 버퍼로 세척합니다. 단백질을 용출시키기 위해, 10 mL/min의 속도로 NaCl 농도가 증가하는 Tris 버퍼 150 mL를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 단백질이 500 mM의 NaCl 농도에서 용출되면, 자동 분획 수집기를 사용하여 50 mL씩 분획하여 수집합니다.15 mL 원심분리 필터 유닛과 이어서 4 mL 볼륨 유닛을 사용하여 150 mL의 magnetoferritin을 약 2 mL 부피로 농축합니다. 이 절차에 대한 자세한 프로토콜은 원심분리 필터 유닛의 제조사 지침을 참조하십시오. 그런 다음, 인젝션 루프를 사용하여 농축된 시료를 겔 여과 컬럼에 로딩합니다.분당 1.3 milliliters의 유속으로 running buffer를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 자동 분획 수집기를 사용하여 6 milliliter씩 분획을 수집합니다. 단백질 단량체(Protein monomers)가 마지막으로 용출됩니다.이 단계에서 정제된 magnetoferritin은 양이온화 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 10 mg의 magnetoferritin에 대해, 374 mg의 DMPA를 정량하여 2.5 mL의 200 mM MES 완충액에 녹입니다. 진한 염산을 사용하여 용액의 pH를 약 7로 조정합니다.염산을 사용하여 DMPA 용액의 pH를 조절할 때 독성 가스가 방출됩니다. 반드시 흄 후드 내에서 이 재료들을 취급하십시오. 4 mg/mL 농도의 magnetoferritin 용액 2.5 mL를 추가합니다.마그네틱 스터러를 넣고 2시간 동안 교반하여 평형을 맞춥니다. 용액의 pH를 5.0으로 조정한 후, DMPA magnetoferritin 용액에 141 mg의 EDC 분말을 첨가합니다. 3시간 30분 동안 계속 교반합니다.침전물을 제거하기 위해 용액을 0.22 micron 시린지 필터로 여과하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질을 투석합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 hMSC를 배양합니다. 플레이트에 분주된 세포를 2 mL의 실온 PBS로 세척합니다.그런 다음, 플레이트에 도말된 세포에 멸균된 양이온화 magnetoferritin 용액 1 mL를 첨가하고 원하는 시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세척한 후, Trypsin-EDTA 0.5 mL를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 세포를 수확합니다. Trypsin-EDTA를 불활성화하기 위해 배양액 1 mL를 첨가한 후, 용액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮겨 524 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 0.5 mL의 자기 분리 버퍼(magnetic separation buffer)에 재현탁합니다.다음으로, 자석을 멀티 스탠드에 부착하고 자석에 자기 분리 컬럼을 추가합니다. 컬럼 위에 전분리 필터를 배치합니다. 그런 다음, 전분리 필터에 0.5 milliliters의 자기 분리 완충액을 넣고 필터와 컬럼을 모두 통과시켜 세척합니다.다음으로, 컬럼 아래에 15 milliliter 원심분리 튜브를 배치하고 0.5 milliliters의 세포 현탁액을 자기 분리 컬럼의 필터 리저버에 넣습니다. 리저버가 비워지면 0.5 milliliters의 자기 분리 버퍼를 추가합니다. 리저버가 다시 비워지면 0.5 milliliters의 자기 분리 버퍼를 추가로 넣습니다.자기 분리 버퍼의 총 부피가 1.5 milliliters가 되도록 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 이 세척 단계는 컬럼에서 자성을 띠지 않는 모든 세포를 용출시킵니다. 자석에서 컬럼을 제거하여 새로운 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다.그런 다음, 컬럼 저장조에서 필터를 제거합니다. 저장조에 자성 분리 버퍼 1 mL를 넣고, 제조사에서 제공한 플런저를 사용하여 즉시 컬럼을 통해 밀어냅니다. 이렇게 하면 자성 세포가 컬럼에서 원심 분리 튜브로 용출됩니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 철 정량을 진행하십시오. 음성 염색된 마그네토페리틴 샘플의 투과 전자 현미경 이미지는 단백질 케이지 내부에 나노입자가 형성되었음을 보여주었습니다. 제타 전위 측정 결과, 양이온화를 통해 마그네토페리틴이 양의 표면 전하를 띠게 되었음을 확인했습니다.인간 중간엽 줄기세포를 양이온화된 마그네토페리틴에 1분 동안 노출시킨 결과, 세포 집단의 92%가 자화되었으며 세포당 3.6 picograms의 철이 전달되었습니다. 배양 시간을 15분으로 늘리면 세포 집단 전체가 자화되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 단백질 용액에 금속염 전구체를 순차적으로 첨가하여 apoferritin 공동 내에 자기 나노입자를 합성하는 방법을 이해하게 될 것입니다.그런 다음, TMPA 결합을 이용하여 단백질을 화학적으로 양이온화하는 방법을 설명하겠습니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 마그네토페리틴의 합성, 정제 및 양이온화는 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 산소 오염을 방지하고, 마그네토페리틴 합성 전 과정에서 정확한 온도와 pH를 유지하는 것이 중요합니다.이 절차에 이어, 양전하화된 apoferritin 케이지에 양자점 또는 치료제와 같은 다른 화물을 캡슐화하여 해당 물질들을 세포로 더 효율적으로 전달할 수 있습니다. 이 기술은 자기 세포 조작 분야의 연구자들이 나노입자의 흡수율이 낮거나, 장시간의 나노입자 노출 또는 고농도의 나노입자에 매우 민감한 세포에서 자기 표지를 탐색할 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.

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이 비디오에서는, 우리는 망간 염화와 인간의 배아 줄기 세포를 (hESC) (MnCl 라벨하는 방법을...

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

여기에, 우리는 강한 자기 모멘트 강한 근적외선 (NIR) 흡수와 자기 플라즈몬 나노 입자의 합성 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 특정 분자 표적을 필요로 다양한 생물 의학 응용 프로그램의 Fc 부분을 통해 나노 입자에 항체 접합을 포함한다.

Immunotargeted의 합성 자기 - 플라즈 모닉 나노 클러스터

표적 세포 전달은 다양한 생체 의학 응용 분야에서 유용합니다.  이 프로토콜의 목표는 초상자성 산화철 나노입자(SPION)를 사용하여 세포를 라벨링함으로써 세포 전달 및 국소화를 높은 수준으로 제어할 수 있는 자기 세포 표적화 접근 방식을 가능하게 하는 것입니다.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

이 작품은 자기 나노 입자의 제조를위한 프로토콜을 설명,SiO2로코팅, 그 아민 기능화 (3-아미노 프로필) triethoxysilane (APTES) 및 링커로 수치 닐 모니티를 사용하여 deferoxamine와의 그 연상. 모든 중간 나노입자 및 최종 컨쥬게이트에 대한 Y. 장골염을 이용한 깊은 구조적 특성화 설명 및 포획 박테리아 분석법도 상세히 설명한다.

기능성 자기 나노 입자의 합성, 사이드로포레 페록사민과의 그들의 융합 및 박테리아 검출에 대한 평가

산화철 나노입자는 비수성 솔 젤 시술을 통해 합성되고 음이온 짧은 분자 또는 폴리머로 코팅된다. 인간 줄기 세포 내부의 자기 나노 입자의 통합 및 생체 변환을 모니터링하기 위한 자기 측정의 사용은 진동 시료 자력계(VSM)를 사용하여 입증된다.

자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.

자성 나노 물질의 생체 기능화

이 작품은 신경 조직의 제어를위한 지역 자기력의 엔지니어링에 상향 식 접근 방식을 제시한다. 자기 나노 입자 (MNPs)로로드 된 뉴런 과 같은 세포는 수직 자화와 마이크로 패턴 플랫폼에 의해 도금및 제어됩니다. 또한 자기 특성화, MNP 세포 섭취, 세포 생존 가능성 및 통계 분석이 설명되어 있습니다.

상호 연결된 뉴런의 마이크론 규모의 조직을 위한 자기 플랫폼 제작

우리는 재료 차원과 구성에 대한 독립적 인 제어를 제공하는 망간 페릿 클러스터 (MFC)의 원 포트 수열 합성을보고합니다. 자기 분리를 통해 황변 폴리머를 이용한 표면 기능화를 통해 신속하게 정제할 수 있어 생물학적으로 관련매체에서 비응집재가 되도록 한다. 결과 제품은 생체 의학 응용 프로그램에 대 한 잘 배치.

튜블 가능한 나노 스케일 치수 및 구성망간 페릿 클러스터의 안정적인 수성 현탁액

당사는 광학 트랩에 고정된 선형 DNA 분자에서 형광 라벨링되고 완전히 재구성된 Cdc45/Mcm2-7/GINS(CMG) 헬리카제의 움직임을 직접 이미지화하고 정량화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석을 보고합니다.

완전히 재구성된 CMG의 움직임을 이미지화하기 위한 하이브리드 앙상블 및 단일 분자 분석

배우세요 단백질 케이지 내에서 코발트 도핑 마그네토페라틴을 합성하고 양이온화하여 줄기세포에 효율적으로 결합시키는 방법을. 이 기술은 MRI 및 자기 세포 분리 등 다양한 생의학 응용 분야에서 세포 마그네틱 라벨링을 가능하게 합니다.

세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

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