세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

이 방법의 전반적인 목표는 단백질 케이지 내부에 자기 나노입자를 합성한 후, 자기 나노입자가 세포에 빠르게 부착될 수 있도록 단백질을 기능화하는 것입니다. 이 방법은 MRI 또는 자기 세포 분리와 같은 응용 분야에 중요한, 세포의 신속하고 효율적인 자기 표지를 가능하게 하는 자기 나노입자를 생성하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 나노입자 농도와 짧은 배양 시간으로도 세포 자성화를 달성할 수 있어, 나노입자 노출로 인한 잠재적인 부작용을 방지할 수 있다는 점입니다.

먼저, 질소 가스 실린더에 연결된 튜브를 탈이온수에 넣고 용기를 클링 필름으로 밀봉하여 500 milliliters의 탈이온수에서 산소를 제거합니다. 그런 다음, 약 60분 동안 질소 가스를 버블링합니다. 이중 자켓 반응 용기에 연결된 워터 배스를 65 °C까지 가열합니다.

그 다음, 50 millimolar HEPES 완충액(pH 8.6) 75 milliliters를 반응 용기에 넣습니다. 용기를 밀폐하고 완충액 용액에 질소 가스를 약 20분 동안 버블링하여 탈산소화합니다. 동시에 마그네틱 교반기를 사용하여 완충액 용액을 교반합니다.

HEPES 완충액의 탈산소 처리가 끝나면, 질소 분위기를 유지하기 위해 질소 튜브를 용액 위에 띄운 상태로 유지하며 제거하십시오. 최종 농도가 3 mg/mL가 되도록 apoferritin을 첨가하십시오. 마그네틱 교반을 계속하되, 거품이 발생하면 교반 속도를 줄이십시오.

마그네토페리틴 합성을 위해, 두 개의 시린지 펌프를 사용하여 10.1 milliliters의 철-코발트 전구체와 10.1 milliliters의 과산화수소를 0.15 milliliters per minute의 유속으로 apoferritin 용액에 동시에 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 합성 단계를 계속 진행하십시오. 그 후, 연동 펌프를 사용하여 10 milliliters per minute의 유속으로 샘플을 양이온 매질이 포함된 컬럼에 로딩합니다.

유속 10 mL/min으로 그래디언트 펌프를 사용하여 컬럼을 약 100 mL의 러닝 버퍼로 세척합니다. 단백질을 용출시키기 위해, 10 mL/min의 속도로 NaCl 농도가 증가하는 Tris 버퍼 150 mL를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 단백질이 500 mM의 NaCl 농도에서 용출되면, 자동 분획 수집기를 사용하여 50 mL씩 분획하여 수집합니다.

15 mL 원심분리 필터 유닛과 이어서 4 mL 볼륨 유닛을 사용하여 150 mL의 magnetoferritin을 약 2 mL 부피로 농축합니다. 이 절차에 대한 자세한 프로토콜은 원심분리 필터 유닛의 제조사 지침을 참조하십시오. 그런 다음, 인젝션 루프를 사용하여 농축된 시료를 겔 여과 컬럼에 로딩합니다.

분당 1.3 milliliters의 유속으로 running buffer를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 자동 분획 수집기를 사용하여 6 milliliter씩 분획을 수집합니다. 단백질 단량체(Protein monomers)가 마지막으로 용출됩니다.

이 단계에서 정제된 magnetoferritin은 양이온화 전까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 10 mg의 magnetoferritin에 대해, 374 mg의 DMPA를 정량하여 2.5 mL의 200 mM MES 완충액에 녹입니다. 진한 염산을 사용하여 용액의 pH를 약 7로 조정합니다.

염산을 사용하여 DMPA 용액의 pH를 조절할 때 독성 가스가 방출됩니다. 반드시 흄 후드 내에서 이 재료들을 취급하십시오. 4 mg/mL 농도의 magnetoferritin 용액 2.5 mL를 추가합니다.

마그네틱 스터러를 넣고 2시간 동안 교반하여 평형을 맞춥니다. 용액의 pH를 5.0으로 조정한 후, DMPA magnetoferritin 용액에 141 mg의 EDC 분말을 첨가합니다. 3시간 30분 동안 계속 교반합니다.

침전물을 제거하기 위해 용액을 0.22 micron 시린지 필터로 여과하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질을 투석합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 hMSC를 배양합니다. 플레이트에 분주된 세포를 2 mL의 실온 PBS로 세척합니다.

그런 다음, 플레이트에 도말된 세포에 멸균된 양이온화 magnetoferritin 용액 1 mL를 첨가하고 원하는 시간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세척한 후, Trypsin-EDTA 0.5 mL를 첨가하고 37 °C에서 5분 동안 배양하여 세포를 수확합니다. Trypsin-EDTA를 불활성화하기 위해 배양액 1 mL를 첨가한 후, 용액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮겨 524 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 0.5 mL의 자기 분리 버퍼(magnetic separation buffer)에 재현탁합니다.

다음으로, 자석을 멀티 스탠드에 부착하고 자석에 자기 분리 컬럼을 추가합니다. 컬럼 위에 전분리 필터를 배치합니다. 그런 다음, 전분리 필터에 0.5 milliliters의 자기 분리 완충액을 넣고 필터와 컬럼을 모두 통과시켜 세척합니다.

다음으로, 컬럼 아래에 15 milliliter 원심분리 튜브를 배치하고 0.5 milliliters의 세포 현탁액을 자기 분리 컬럼의 필터 리저버에 넣습니다. 리저버가 비워지면 0.5 milliliters의 자기 분리 버퍼를 추가합니다. 리저버가 다시 비워지면 0.5 milliliters의 자기 분리 버퍼를 추가로 넣습니다.

자기 분리 버퍼의 총 부피가 1.5 milliliters가 되도록 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 이 세척 단계는 컬럼에서 자성을 띠지 않는 모든 세포를 용출시킵니다. 자석에서 컬럼을 제거하여 새로운 15 milliliter 원심분리 튜브에 넣습니다.

그런 다음, 컬럼 저장조에서 필터를 제거합니다. 저장조에 자성 분리 버퍼 1 mL를 넣고, 제조사에서 제공한 플런저를 사용하여 즉시 컬럼을 통해 밀어냅니다. 이렇게 하면 자성 세포가 컬럼에서 원심 분리 튜브로 용출됩니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 철 정량을 진행하십시오. 음성 염색된 마그네토페리틴 샘플의 투과 전자 현미경 이미지는 단백질 케이지 내부에 나노입자가 형성되었음을 보여주었습니다. 제타 전위 측정 결과, 양이온화를 통해 마그네토페리틴이 양의 표면 전하를 띠게 되었음을 확인했습니다.

인간 중간엽 줄기세포를 양이온화된 마그네토페리틴에 1분 동안 노출시킨 결과, 세포 집단의 92%가 자화되었으며 세포당 3.6 picograms의 철이 전달되었습니다. 배양 시간을 15분으로 늘리면 세포 집단 전체가 자화되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 단백질 용액에 금속염 전구체를 순차적으로 첨가하여 apoferritin 공동 내에 자기 나노입자를 합성하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

그런 다음, TMPA 결합을 이용하여 단백질을 화학적으로 양이온화하는 방법을 설명하겠습니다. 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 마그네토페리틴의 합성, 정제 및 양이온화는 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 산소 오염을 방지하고, 마그네토페리틴 합성 전 과정에서 정확한 온도와 pH를 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 이어, 양전하화된 apoferritin 케이지에 양자점 또는 치료제와 같은 다른 화물을 캡슐화하여 해당 물질들을 세포로 더 효율적으로 전달할 수 있습니다. 이 기술은 자기 세포 조작 분야의 연구자들이 나노입자의 흡수율이 낮거나, 장시간의 나노입자 노출 또는 고농도의 나노입자에 매우 민감한 세포에서 자기 표지를 탐색할 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.