세포의 초고속 자화에 대한 양이온 Magnetoferritin의 합성

이 방법의 전반적인 목표는 단백질 케이지 내부에서 자성 나노 입자를 합성한 다음 자성 나노 입자를 세포에 빠르게 부착할 수 있도록 단백질을 기능화하는 것입니다. 이 방법은 세포의 빠르고 효율적인 자기 표지를 가능하게 하는 자성 나노 입자를 생성하는 데 사용할 수 있으며, 이는 MRI 또는 자기 세포 분리와 같은 응용 분야에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 나노 입자 농도와 짧은 배양 시간을 사용하여 세포 자화를 달성할 수 있어 나노 입자 노출로 인한 잠재적인 부작용을 방지할 수 있다는 것입니다.

먼저 질소 가스 실린더에 연결된 튜브를 물에 넣고 접착 필름으로 용기를 밀봉하여 500ml의 탈이온수를 탈산소화합니다. 그런 다음 약 60분 동안 질소 가스를 거품으로 만듭니다. 이중 재킷 반응 용기에 연결된 수조를 섭씨 65도까지 가열합니다.

그런 다음 75 밀리리터의 50 밀리 몰 HEPES 완충액, pH 8.6을 반응 용기에 첨가합니다. 용기를 밀봉하고 약 20분 동안 완충 용액을 통해 질소 가스를 버블링하여 산소를 제거합니다. 동시에 자석 교반기를 사용하여 완충 용액을 교반합니다.

HEPES 완충 용액을 탈산소화 한 후 완충액에서 질소 튜브를 제거하고 용액 위에 매달려 질소 분위기를 유지하십시오. 아포페리틴을 첨가하여 밀리리터당 3mg의 최종 농도를 달성합니다. 자기 교반을 계속하되 거품이 발생하면 교반 속도를 줄이십시오.

마그네토페리틴 합성을 위해 두 개의 주사기 펌프를 사용하여 10.1ml의 철-코발트 전구체와 10.1ml의 과산화수소를 분당 0.15ml의 유속으로 아포페리틴 용액에 동시에 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 합성 단계를 계속합니다. 그런 다음 분당 10밀리리터의 유속으로 연동 펌프를 사용하여 양이온 매트릭스가 포함된 컬럼에 샘플을 로드합니다.

분당 10ml의 유속으로 그래디언트 펌프를 사용하여 약 100ml의 러닝 버퍼로 컬럼을 세척합니다. 단백질을 용리화하려면 150ml의 증가하는 농도의 염화나트륨과 트리스 완충액으로 컬럼을 분당 10ml로 세척합니다. 단백질이 500mmol의 염화나트륨 농도에서 용리되면 자동 분획 분취기를 사용하여 50ml 분획으로 단백질을 수집합니다.

150ml의 마그네토페리틴을 15ml 원심 필터 장치를 사용하여 약 2ml의 부피로 농축한 다음 4ml 부피 장치를 사용합니다. 이 절차의 자세한 프로토콜은 원심 필터 장치의 제조업체 지침을 참조하십시오. 다음으로, 주입 루프를 사용하여 농축된 샘플을 겔 여과 컬럼에 로드합니다.

러닝 버퍼로 컬럼을 분당 1.3ml의 유속으로 세척합니다. 자동 분획 분취기를 사용하여 6밀리리터 분획을 수집합니다. 단백질 단량체는 마지막에 용리됩니다.

이 시점에서 정제된 마그네토페리틴은 양이온화가 일어날 때까지 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 마그네토페리틴 10mg의 경우, 374mg의 DMPA의 무게를 측정하고 2.5ml의 200millimolar MES 완충액에 용해시킵니다. 진한 염산을 사용하여 용액 pH를 약 7로 조정합니다.

유독성 가스는 염산으로 DMPA 용액의 pH를 조정할 때 방출됩니다. 이러한 물질은 흄 후드에서 취급하십시오. 2.5 밀리리터의 마그네토페리틴 용액을 밀리리터당 4 밀리그램으로 첨가합니다.

자석 교반기를 넣고 평형을 이루기 위해 2시간 동안 저어줍니다. 용액을 pH 5.0으로 조정한 후 DMPA 마그네토페리틴 용액에 EDC 분말 141mg을 첨가합니다. 3시간 30분 동안 계속 저어줍니다.

0.22 미크론 주사기 필터를 통해 용액을 필터링하여 침전물을 제거하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질을 투석합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 hMSC를 배양합니다. 도금된 셀을 실온 PBS 2밀리리터로 세척합니다.

그런 다음, 멸균된 양이온화된 마그네토페리틴 용액 1ml를 도금된 세포에 첨가한 후 원하는 기간 동안 배양합니다. PBS로 세포를 세척한 다음 0.5ml의 트립신-EDTA를 첨가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 세포를 수확합니다. 트립신 EDTA를 비활성화하기 위해 1 밀리리터의 배양 배지를 첨가 한 후, 용액을 15 밀리리터 원심 분리 튜브에 옮기고 524 회 G에서 5 분 동안 원심 분리한다.상등액을 버리고 세포 펠렛을 0.5 밀리리터의 자기 분리 완충액에 재현탁시킨다.

다음으로, 멀티 스탠드에 자석을 부착하고 자석에 자기 분리 컬럼을 추가합니다. 컬럼에 사전 분리 필터를 배치합니다. 그런 다음 0.5ml의 자기 분리 버퍼를 사전 분리 필터에 추가하고 필터와 컬럼을 모두 통과하여 세척합니다.

다음으로, 컬럼 아래에 15ml 원심분리 튜브를 놓고 0.5ml의 셀 현탁액을 자기 분리 컬럼의 필터 저장소에 추가합니다. 저장소가 비어 있으면 0.5ml의 자기 분리 버퍼를 추가합니다. 저장소가 다시 비워지면 0.5ml의 자기 분리 버퍼를 더 추가합니다.

총 부피가 1.5ml인 자기 분리 버퍼에 대해 세척을 한 번 더 반복합니다. 이 세척 단계는 컬럼에서 자화되지 않은 모든 세포를 용리합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 새 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다.

그런 다음 컬럼 저장소에서 필터를 제거합니다. 1ml의 자기 분리 버퍼를 저장소에 추가하고 제조업체에서 제공한 플런저를 사용하여 즉시 컬럼을 밀어 넣습니다. 이것은 컬럼에서 원심분리기 튜브로 자화된 세포를 용리시킵니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 철 정량화를 수행합니다. 음성으로 염색된 마그네토페리틴 샘플의 투과 전자 현미경 이미지는 나노 입자가 단백질 케이지 내부에 형성되었음을 보여주었습니다. 제타 전위 측정은 마그네토페리틴이 양이온화 후 양전하를 획득했음을 확인합니다.

인간 중간엽 줄기세포를 양이온화된 마그네토페리틴에 1분 동안 노출시킨 결과, 세포 집단의 92%가 자화되고 세포당 3.6피코그램의 철이 전달되었습니다. 배양 시간을 15분으로 늘리면 전체 세포 집단이 자화되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단백질 용액에 금속염 전구체를 순차적으로 첨가하여 아포페리틴 캐비티 내에서 자성 나노 입자를 합성하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

그런 다음 TMPA 커플 링을 사용하여 단백질을 화학적으로 양이온화하는 방법. 일단 마스터하면 마그네토페리틴 합성, 정제 및 양이온화가 제대로 수행되면 3일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 산소 오염을 피하고 마그네토페리틴 합성 전반에 걸쳐 올바른 온도와 pH를 유지하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 양자점 또는 치료제와 같은 다른 화물을 양이온화된 아포페리틴 케이지에 캡슐화하여 이러한 물질을 세포에 보다 효율적으로 전달할 수 있습니다. 이 기술은 자기 세포 조작 분야의 연구자들이 나노 입자의 흡수가 부족하거나 장기간 나노 입자 노출 또는 높은 나노 입자 농도에 매우 민감한 세포의 자기 표지를 탐구할 수 있는 길을 열 수 있습니다.