Name: 자외선 VI와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 학습하세요 금 나노입자 기반 면역분석 플랫폼 제조법을 UV-Vis와 라만 분광학으로 검증하는 방법을. 기능화가 광학 특성에 미치는 영향과 맞춤형 연구 적용 가능성을 탐구합니다.

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이 연구는 유타 주립 대학의 Research Catalyst Award의 지원을 받았습니다. 저자는 Annelise Dykes, Cameron Zabriskie, Donald Wooley의 기여에 감사를 표합니다.

버퍼의 1. 준비 <ol><li> 인산염 완충 식염수 (PBS) <ol><li> 배속 PBS 농도를 만들기 위해 450 ㎖의 HPLC 등급 물 10 배 PBS 50 mL로 희석. 살균 필터 0.22 μm의 필터 솔루션. </li><li> 실온에서 보관 솔루션입니다. </li></ol></li><li> 트리스 완충 식염수 + 트윈 20 (TBST)의 제조 <ol><li> 배속 농도를 만들기 위해 450 ㎖의 HPLC 등급 물 배 트리스 완충 식염수 (TBS)의 50 mL로 희석. 트윈-20의 0.05 % (v / v)의 위해 트윈-20의 250 μl를 추가합니다. 살균 필터 0.22 μm의 필터 솔루션. </li><li> 실온에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 인간 혈청 알부민의 제조 (HSA) 차단 솔루션 <ol><li> HSA 솔루션의 v / w는 3 %를 만들기 위해 멸균 여과 1X PBS 15 ml의에 HSA의 0.45 g을 달아. HSA까지 소용돌이 용액을 완전히 용해시킨다. </li><li> 4 ℃에서 보관 HSA 솔루션입니다. 참고 : 소 혈청 알부민(BSA)도 차단 용액으로서 사용될 수있다. </li></ol></li><li> PEG 화 된 항체의 제조 (PEG-AB) 용액 참고 : 항체 솔루션을 결합 부위의 n 히드 록 (NHS)에 대한 경쟁에 의해 접합 반응을 방해하는 등의 BSA와 같은 캐리어 또는 안정화 단백질에서 무료로해야합니다. 항체는 트리스 나 글리신 완충액 온 경우, NHS 공액 반응 간섭 아민 또는 암모늄염을 방지하기 위해 버퍼 교환을 거쳐야한다. 항체는 동결 건조 된 형태 인 경우, 1 내지 10 ㎎ / ㎖의 농도로 제조자의 권고에 따라 재현 탁 될 수있다. <ol><li> 트리스 나 글리신 완충액 항체, 탈염 컬럼을 사용하여 100 mM의 나트륨 바이 카보네이트로 버퍼 교환을 수행한다. 공액 반응 속도를 약 8.5로 pH를 높이기 위해 100 mM의 버퍼를 사용합니다. </li><li> 100 밀리미터의와 수화물 오르 피리 딜 이황화-PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS)1 ㎎ / ㎖ 이상의 농도로 한 용액의 부피로 비난의 중탄산. 참고 : OPSS-PEG-NHS는 신선한 만든 약 20 분 이내에 사용해야합니다. OPSS-NHS-PEG의 NHS 기의 pH 8.5의 수용액에서 약 20 분의 반감기를 갖는다. </li><li> 1 비율 (PEG : 항체) 2의 항체 용액 OPSS-PEG-NHS 추가 결합 비는 시험 샘플에 사용한다. 상기 제어를 위해 사용되는 접합 한 비율 : 마이크로 원심 분리 튜브에, 2의 항원 용액 OPSS-PEG-NHS를 추가한다. 주 : 2 : 1의 비율이 50 %의 결합 효율을 가정하고있다. 목적은 하나의 PEG 체인 각 항체 레이블을하는 것입니다. 이 단계에서, 과잉 표지 밑에 표시보다 낫다. OPSS-PEG-NHS 및 항체 용액의 적절한 양을 결정하기 위해 다음 식을 사용하여 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> V는 볼륨이고, C는 분자 또는 표현 농도는ml의 당 tibodies. 첨자 PEG와 순이는 각각 OPSS-PEG-NHS 항체이다. 최종 부피는 약 250 ㎕를해야한다. </li><li> 8 시간 또는 밤새 4 ° C에서 PEG-Ab의 솔루션을 품어. 동결 해동 사이클을 제한하고 낮은 바인딩 튜브를 사용할 수 있는지 확인하기 위해 -20 ° C에서 약 25 μL의 분취 작업에 보관 솔루션입니다. </li></ol></li></ol> 2. 준비 UV-비스 / 라만 프로브 <ol><li> 베어 AuNP 솔루션을 준비 <ol><li> ml의 당 약 1 × 10 (11) 입자의 농도 AuNPs의 2 ml의 솔루션을 준비합니다. <ol><li> AuNPs가 집중해야하는 경우, 20 분 동안 또는 상등액가 선명해질 때까지 5,000 XG에서 2,000 재고 AuNP ㎕의 원심 분리기와 낮은 결합 원심 분리기 튜브를 입력합니다. AuNP 펠렛을 방해하지 않도록주의, 피펫으로 상층 액을 제거합니다. </li><li> 하나의 튜브에 남아있는 AuNP 솔루션을 결합하고 집중하고 추정자외선 비스 측정을 획득하고,이 선형 관계로 알려진 농도의 값을 비교하여 기. </li></ol></li></ol></li><li> 적절한 라만 리포터 표지 비율을 결정 <ol><li> 메탄올 라만 기자의 작업 솔루션을 준비합니다. 이 농도는 사용 된 기자에 의존 할 것이다. 본 연구에서는 200 μM의 작동 용액에 3,3&#39;- diethylthiatricarbocyanine오다 이드 (DTTC)를 준비합니다. </li><li> 각 웰에 100 ㎕의 최종 부피를 가정하면, 라만 리포터 0.2 μM 내지 10 μM까지 농도의 범위이다되도록 96 웰 플레이트의 첫 번째 행의 각 웰에 작용 리포터 용액만큼 추가한다. 볼륨이 80 μl의 것을 각 웰 등 충분한 HPLC 등급 물을 추가합니다. 각 웰에 각각 100 μL의 최종 볼륨을 잘 만들기 위해 AuNP의 20 μl를 추가합니다. 일례가 표 1에 제공된다. </li><li> 자외선 마주 스펙트럼을 400 내지를 측정판 읽기 UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 700 nm의. 적절한 농도는 UV-비스 스펙트럼에 대한 정의 봉우리와 가장 높은 농도이다. AuNPs에 라만 기자의 높은 농도 비율까지 농도를 증가의 단계를 반복 2.2.2 발견된다. 참고 : 염료 및 AuNP 모양, 크기, 제조자는 적절한 농도에 영향을 미친다. 따라서 나와있는 단계는 사용되는 구성 요소에 따라 평가 변경해야합니다. 이 프로토콜은 양전하 염료의 사용을 포함했다. 이와 같이, AuNP 리포터 간의 바인딩 AuNPs 음전하를 이용하여 향상되었다. 이것은 시트르산 AuNPs 캡핑을 사용하여 수행 하였다. 자세한 내용은 토론 섹션을 참조하십시오. </li></ol></li><li> 라만 기자와 PEG-Ab의 바인딩 AuNP하기 <ol><li> 라만 리포터 실온에서 30 분 동안 AuNPs에 결합 할 수 있도록 미리 결정된 농도 AuNP 라만 리포터 두 1.5ml의 배치를 준비한다.</li><li> 입자에 항체 : 1 비율로 (200)를 만들 수있는 AuNP 및 라만 기자 솔루션 중 하나 배치에 PEG 화 항체 (PEG-순이)를 추가합니다. 이 용액을 시험 샘플에 대한 것이다. 컨트롤로서 사용되는 입자에 항체 : 1의 비율로 개별 마이크로 원심 튜브에, 200에서 AuNP 라만 리포터 용액의 다른 배치를 PEG 화 항원을 추가한다. 실온에서 30 분 동안 용액을 인큐베이션. 주 : 입자에 항체의 비율이 AuNPs 특정 사용하고 염료 및 각각의 경우에 대해 최적화되어야한다. AuNP 프로브 입자의 응집을 방지하면서 결합하기 위해 여기 목적은 항체의 가장 높은 비율을 가지고있다. 함께 추가 적절한 양을 결정하기 위해 다음 식을 사용하여 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> V는 볼륨이고, C는 ㎖의 당 입자 또는 항체로 표현 농도이다. 핀알 부피는 약 1.5 ml를해야한다. </li></ol></li><li> 블록은 MPEG-SH와 AuNP 표면에 사이트를 나머지. <ol><li> 물을 사용하여 200 μM 농도로 고체 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 티올을 용해시켜 MPEG-SH를 준비한다. MPEG-SH가 완전히 용해 될 때까지 용액을 소용돌이. </li><li> 단계 2.3에서 만든 AuNP-PEG-Ab의 솔루션 : 1 비율로 40,000 MPEG-SH를 추가합니다. 금 나노 입자의 나머지 사이트 차단을 보장하기 위해 10 분 동안 실온에서 용액을 인큐베이션. 함께 추가 적절한 양을 결정하기 위해 다음 식을 사용하여 <img alt="방정식" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> V는 볼륨이고, C는 ㎖의 당 입자 또는 항체로 표현 농도이다. 최종 부피는 약 1.5 ml를해야한다. </li></ol></li><li> 작용 라만 프로브를 복구 할 수 있습니다. <ol><li> 낮은 바인드 C에서 20 분 동안 5,000 XG에 원심 분리기 입자entrifuge 튜브 또는 상등액가 선명해질 때까지. AuNPs을 방해하지 않도록주의 피펫 팅하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 이전되었다 1X PBS 용액 1 ㎖로 재현 탁 입자. 용액 (3 μL)의 소량의 UV-비스 측정을 취함으로써 AuNP 농도를 추정하고 공지 AuNP 농도에서 측정하여 결과를 비교. 최종 용액 ㎖의 당 적어도 1 × 10 (11) 입자가되도록 볼륨을 조절합니다. </li><li> 4 ℃에서 저장 솔루션 이것은 면역 플레이트의 기능화를 위해 사용될 때까지. 1 주일 이내에 솔루션을 사용합니다. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> 볼륨은 각 구성 요소의 추가합니다 (㎖) </td></tr><tr><td> DTTC 최종 농도 (mM)을 </td><td> DTTC 작업 용액 (200 mM)을 </td><td> AuNP </td><td> 물 </td></tr><tr><td> 0.2 </tD&gt; <td> 0.1 </td><td> (20) </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 0.3 </td><td> (20) </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> (20) </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 1.0 </td><td> (20) </td><td> 79 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 2.5 </td><td> (20) </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> (7) </td><td> 3.5 </td><td> (20) </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> (10) </td><td> 5.0 </td><td> (20) </td><td> (75) </td></tr></tbody></table> 표 1. DTTC 희석 예. DTTC의 다양한 희석과 주식 DTTC, 금 나노 입자 용액, 물 관련 볼륨. 3. 면역 플레이트 준비 <ol><li> 면역 측정법 판에 원하는 항원을 결합한다. <ol><li> 폴리스티렌 웰을 채울 정도로 희석 된 항원 (50 μg의 / ml)로 준비한다. 솔루션 와동바로 판 우물에 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 항원을 실온에서 1 시간 동안 플레이트에 결합 할 수있다. </li></ol></li><li> 언 바운드 항원을 씻으십시오. <ol><li> 처분 용기에 솔루션을 덤핑 및 종이 수건이 덮여 탁상에 대해 판을 쳐서 여분의 항원 용액을 제거합니다. </li><li> 전술 한 바와 같이 동일한 방식으로 세척 한 후 표면을 씻어 제거 웰에 추가 TBST. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. </li></ol></li><li> 블록 비특이적 결합을 방지하기 위해 플레이트 상에 남아있는 결합 부위. <ol><li> 플레이트의 각 웰에 HSA 블로킹 용액 70 μl를 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 분리 단계 3.2에 규정 된 동일한 절차를 사용하여 플레이트를 헹군다. 더 사용할 준비가 될 때까지 4 ° C에서 플레이트 및 저장 건조를 커버. </li></ol></li><li> 면역 플레이트 기능화. <ol><li> t의 70 μl를 추가그는 96 웰 플레이트의 첫 번째 열에 섹션 2에서 제조 된 나노 입자 프로브 및 1 사용 이후의 열을 희석 : 2 시리얼 희석. 플레이트는 적어도 1 시간 동안 배양 할 수 있습니다. 면역 측정법 판을 제조하는 방법의 예는도 3에 주어진다. </li><li> 적절하게 AuNPs 폐기해야하고, 단계 3.2에 설명 된대로 TBST로 5 회 접시를 씻으십시오. 최종 세척 한 후, 각 웰에 1X PBS의 70 μl를 추가하고 플레이트 씰 커버. 주 : 제어 샘플은 명확해야한다. 비특이적 결합이 발생한 경우, 대조 시료는 시험 시료와 유사한 색상을 가질 것이다. </li></ol></li><li> UV-VI와 라만 분광법에 의한 시험 분석 감도. <ol><li> 각 웰의 경우, UV-마주 스펙트럼 판 읽기 UV - 마주 분광 광도계를 사용하여 400에서 700 nm의 범위를 측정한다. </li><li> 반전 라만 현미경을 사용하여 AuNP 프로브를 갖는 웰의 표면 상에 대물 초점. 산부인과웰의 라만 스펙트럼을 주석 박. 1,800cm -1 400cm 범위의 스펙트럼을 수집 -1. 모든 우물에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 스펙트럼 적절한 소프트웨어를 사용하여, UV-비스 스펙트럼에 대한 라만 스펙트럼에 대한 11 번째 오더 다항식 기준선 보정 및 3 차 차 다항식을 수행한다. </li><li> 적절한 소프트웨어를 사용하여 스펙트럼, 라만 및 UV-비스 스펙트럼 정규화. (1) 최대 값을 설정하고 그에 따라 다른 값을 스케일링. 라만 스펙트럼을 정상화하기 위해 고유 한 폴리스티렌 피크를 선택하고 동일한 1로 설정하고 그에 따라 다른 값을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 스펙트럼 적절한 소프트웨어를 사용하여, 각각의 스펙트럼 피크의 적분을 수행한다. 라만 스펙트럼의 경우, 라만 리포터를 나타내는 피크는 폴리스티렌 피크의 존재 영역에 있어야한다. 피크 적분을 수행하기 위해, 원하는 피크 적분 경계를 지정하고 컨트롤을 포함하여 모든 샘플에 대해 원하는 피크 면적을 기록한다. </li><li> 경기 수관련 표준 편차를 나타내는 각 포인트에 대한 오차 막대와 AuNP 농도의 로그 함수로서 관심의 평균 피크 면적 오티. 4 매개 변수 물류 곡선이 교정 점을 맞 춥니 다. </li><li> 빈 샘플에 대한 관심의 피크의 면적의 평균을 블랭크의 평균값을 결정한다. 이 분야의 표준 편차를 결정하고; 이는 블랭크의 표준 편차이다. </li><li> 이전 단계에서와 동일한 분석 피크 최저 농도에 대한 피크 면적의 표준 편차를 발견. </li><li> 대표 결과 섹션에 명시된 검출 빈과 하한의 한계를 계산합니다. AuNP 농도의 관점에서 LLOD를 결정 4PL 교정 곡선이 값을 사용한다. </li></ol></li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

자세한 프로토콜에서 해결하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 한 가지 문제는 라만 기자와 금 나노 입자의 선택입니다. 프로토콜은 개인 사용에 적합하도록 작성되었지만, 라만 리포터 DTTC 예로서 사용 하였다. DTTC는 양전하 기자 부정적인 같은 시트 레이트 출장 AuNPs로 표면을 충전하기 위해 결합한다. 이 프로토콜은 양의 표면 전하와 금 나노 입자를 사용하여 음으로 하전 기자 적응 될 수있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 이민 (PEI) 캡핑 AuNPs은 양의 표면 전하를 제공하고, 더 음전하 기자 바인딩. 단백질 및 나노 입자들 사이의 균형을 유지하는 것은이 프로토콜의 중요한 단계이다. 이 밸런스 (200)의 금 나노 입자 비율 최적화 된 PEG 화 항체에 항체를 첨가하여 달성된다 : 1. PEG 화 항체는 생보다 상당히 높은 비율로 금 나노 입자 용액에 첨가하면의 이온에 의한 입자의 응집이 발생할 수 있습니다. 대안 적으로, 비율이 너무 작에서 단백질 응집 및 불...

일반적인 샌드위치 면역 간접적 두 항체를 사용하여 항원의 존재를 검출한다. 포획 항체는 고체 표면에 결합 된 적절한 항원에 근접하여 항체 - 항원 복합체를 형성 할 때이다. 검출 항체는 도입 항원에 결합한다. 도 1a에 설명 된대로 세척 한 후, 항체 / 항원 / 항체 착물은 유지 및 표지 검출 항체에 의해 검출된다. 일반적인 검출 폭 넓은 스펙트럼 피크 2,3로 인해 10 분석에 다중화을 제한, 형광 또는 비색 검출기에 의해 수행된다. 반면에, 라만 기반 시스템은 최대 100 2,3- 분석 동시 검출을 주장 소스 향상 다중화 기능의 결과로 더 좁은 발광 피크를 가지고있다. 많은 문학 소스는 면역과 관련된 중요한 측면을 커버 할 수 있습니다 4-6 등 단계별로자세한 내용은 개인 ELISA 키트를 만들 수 있습니다. 불행하게도,이 프로토콜은 사용자 면역의 다중화 기능을 제한, 형광 또는 비색 검출을위한 것입니다. 이러한 필요를 해결하기 위해, 우리는도 1b에 도시 된 바와 같이 직접 면역을 위해 이전에 7 일 공개 된 UV-비스 / 라만 면역을 제조하는 구체적인 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 기능화 된 금 나노 입자 기반 프로브의 제조,도 2에 도시를 포함한다. 금 나노 입자의 표면 (AuNPs)에 라만 기자 결합에 의해 시작 라만 / UV-마주 프로브를 확인하는 절차를. AuNPs 후, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 관련된 항체로 관능 화된다. AuNPs에 남은 결합 부위는 분석시 이후의 비 특이 적 결합 방지하기 위해 AuNPs에 메 톡시 폴리에틸렌 글리콜 티올 (MPEG-SH)를 결합에 의해 차단됩니다. 준비된 AuNP 프로브는 항원에 결합함으로써 테스트도 1b에 도시 된 바와 같이 폴리스티렌 플레이트의 웰에 고정시켰다. 관련 라만 기자는 라만 분광법 검출하는 동안 접시를 세척시, AuNP 프로브는 UV-마주 분광법을 사용하여 검출된다. UV-VI와 라만 스펙트럼 데이터를 결합하여이 면역의 기능을 향상 분석하는 두 가지 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>60nm 금 나노 입자</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>이들은 구연산염 뚜껑이 있는 금 나노 입자입니다. 라만 리포터와 AuNP 표면 전하의 관계 및 AuNP 및/또는 라만 리포터의 적절한 선택에 대한 중요성에 대한 논의를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수(10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>병 상단 여과 장치</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20(폴리소르베이트 20)</td><td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>세척 단계의 유화제로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 10x 농축액, pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>단백질 LoBind 튜브 2.0&nbsp; ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431102</td><td>LoBind tube는 단백질과 AuNP가 튜브 표면에 결합하는 것을 방지합니다.</td></tr><tr><td>단백질 LoBind 튜브 0.5&nbsp; ml</td><td>Eppendorf Tubes</td><td>22431064</td><td>LoBind tube는 단백질과 AuNP가 튜브 표면에 결합하는 것을 방지합니다.</td></tr><tr><td>Microplate Devices UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>기능화된 플레이트를 밀봉하고 보관하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>분석 플레이트, 저증발 뚜껑 포함, 96 웰 플랫 바닥</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman reporter</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1&nbsp; 그램</td><td>레이산 바이오, Inc.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA에는 NHS 말단이 있습니다.</td></tr><tr><td>마우스 IgG, 전체 분자 제어</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>항원</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>항체</td></tr><tr><td>인간 혈청 알부민 차단 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td><td>소 혈청 알부민을 대신 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광광도계</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>탈염 컬럼</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>자체 제작 785&nbsp; nm 도립 라만 현미경 장치</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>도립 라만 현미경은 웰 플레이트의 표면에 적절한 초점을 맞추는 데 가장 적합합니다. 그렇지 않으면 96웰 플레이트의 높이 때문에 매우 낮은 배율이 사용됩니다. 공급업체에서 구입하는 것보다 저렴하기 때문에 자체 구축 시스템을 사용했습니다. 그러나 상업적으로 이용 가능한 모든 도립 라만 현미경 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

자외선 vi와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

면역은 관련된 항체의 존재 여부에 따라 단백질을 검출하기 위해 사용된다. 때문에 연구와 임상에서의 광범위한 사용으로, 면역 기기 및 재료의 대형 인프라 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 96 및 384 웰 폴리스티렌 플레이트를 상업적으로 사용할 수있는 다양한 제조업체의 자외선 - 가시 광선 (UV-비스) 분광 시스템을 수용하기 위해 표준 디자인을 가지고있다. 또, 효소 면역 분석법 (ELISA)과 같은 면역 맞춤 설계를위한 면역 글로불린을 검출 태그 및 차단제 다양한 가능하다. 기존 인프라에도 불구하고, 표준 ELISA 키트는 비용과 시간이 소모 될 수 개별적인 면역 개발을 요구하는 모든 연구의 요구를 충족하지 않는다. 그들은 일반적으로 형광 또는 COL에 의존하는 예를 들면, ELISA 키트 (한 번에 하나 이상의 분석 물을 검출) 기능이 낮은 다중화검출 orimetric 방법. 색도계 및 형광 기반의 분석은 광범위한 스펙트럼 피크에 의한 다중화 기능을 제한하고있다. 반면, 라만 분광법 기반의 방법 때문에 좁은 방출 피크에 다중화 훨씬 더 큰 능력을 가지고있다. 라만 분광기의 또 다른 장점은 라만 리포터 형광 태그 (1)에 비해 훨씬 적은 광표백을 경험한다는 것이다. 라만 기자는 형광과 색채 태그를 통해 가지고 있다는 장점에도 불구하고, 프로토콜은 라만 기반 면역이 제한된 제작합니다. 본 연구의 목적은 UV-비스 분석, 라만 분광법으로 분석 물을 직접 검출을위한 폴리스티렌 플레이트와 함께 사용하는 기능화 프로브를 제조하는 프로토콜을 제공하는 것이다. 이 프로토콜은 미리 설정된 인프라를 활용하면서 연구자가 미래 다 분석 검출 할 - 그것 - 자신의 접근 방식을 취할 수 있습니다.

본 연구에서는, 60 nm의 금 입자의 UV-비스 분광기를 사용 하였다. UV-비스 오픈 소스 스펙트럼 분석 소프트웨어 8을 사용하여 결정 하였다 AuNP 각 농도에 대한 400 내지 700 nm의 수거하고, 피크 면적으로부터 흡수 스펙트럼. 통합 피크 이전에 수집 된 스펙트럼은 3 점 다항식을 이용하여베이스 라인 보정을 시행 하였다. 피크 영역은도 4에서 설명한 바와 같이 대수 보정 곡선을 생성하는데 사용되었다. 또한,도 4 및도 5는, 대수 보정 곡선을 포함하는 것이 주목되어야한다. 비선형 보정 곡선의 사용은 상당히 분석법의 동적 범위를 확장 할 수 있으며, 낮은 범위 검출 기능 9,10 필요 다양한 면역 대한 허용 실시되고있다. 정량 분석의 민감도, 블랭크 (LOB)의...

나노 입자 기반 광학 프로브는 라만 및 UV-Vis 분광법을 사용하여 항원을 검출하기 위한 매개체로 설계되었습니다. 여기에서는 향후 다중화 기능을 통합하는 방식으로 UV-Vis/Raman 분광법 면역분석을 위해 이러한 프로브를 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

자외선 VI와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 UV-Visible 및 라만 분광법(Raman Spectroscopy)을 이용한 분석이 가능한 맞춤형 금 나노 입자 기반 면역 분석법의 개발을 시연하는 것입니다. 두 가지 광학적 방법을 사용함으로써 분석의 내부 검증을 제공하고 분석법의 유연성을 높일 수 있습니다. 이 방법은 금 나노 입자 기반 면역 분석법의 개발과 관련된 핵심 질문들에 대한 답을 제시합니다.또한, 이 분석법에서 나노 입자의 기능화가 광흡수 및 광산란에 어떻게 영향을 미치는지 설명합니다. 이 프로토콜은 일반적인 연구실에서 찾을 수 있는 재료를 사용하여 개별 연구 필요에 맞게 맞춤 설정 가능한 면역 분석 플랫폼을 제작한다는 점에서 독특합니다. 해당 면역 분석은 UV-Vis 및 라만 분광법을 기반으로 합니다.라만 분광법을 사용하면 대역폭이 더 좁아 여러 생체지표를 동시에 검출할 수 있으므로, 형광 또는 비색법보다 더 유리합니다. 우선, 이중 기능성 가교제 또는 pyridyl disulfide PEG-NHS를 100 mL 중탄산나트륨에 녹여 수화시킵니다. ortho pyridyl 말단은 금 나노입자 표면에 결합하며, NHS 말단은 활성화된 후 단백질 표면의 1차 아민과 반응하게 됩니다.가교 결합 솔루션은 사용하기 약 20분 전에 조제하십시오. 다음으로, 2:1의 접합 비율로 이작용성 가교제를 항체 솔루션에 첨가하십시오. 항체 솔루션에 반응을 방해할 수 있는 운반 단백질이 포함되어 있지 않은지 확인하십시오.별도의 마이크로원심분리기 튜브에 대조군에 사용할 것과 동일한 비율로 이중 기능성 가교제를 항원 용액에 첨가합니다. 2:1 비율은 접합 효율을 50%로 가정한 것입니다. 목적은 각 항체에 단일 PEG 체인을 표지하는 것입니다.이 단계에서는 라벨링을 부족하게 하는 것보다 과하게 하는 것이 더 바람직합니다. 마지막으로, 페길화된 항체 용액을 4 °C에서 8시간 동안 배양하십시오. 동결-해동 주기를 제한하기 위해 용액을 25 µL씩 저결합 튜브에 나누어 -20 °C에 보관하십시오.각 분주액을 필요에 따라 사용하십시오. 라만 프로브를 준비하려면, 먼저 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 농도를 결정한 라만 리포터 기반의 금 나노 입자 1.5 mL 배치를 2개 만듭니다. 이는 라만 리포터와 금 나노 입자 용액을 혼합한 후 실온에서 30분 동안 결합하도록 하여 수행합니다.그다음, 페길화된 항체 용액을 리포터가 결합된 금 나노 입자 용액 중 하나에 추가하여 항체와 입자의 비율이 200:1이 되도록 합니다. 이 용액은 테스트 샘플용으로 사용됩니다. 별도의 마이크로원심분리 튜브에, 페길화된 항원을 다른 리포터 결합 금 나노 입자 용액에 항원과 입자의 비율이 200:1이 되도록 추가하여 대조군으로 사용합니다.두 용액을 실온에서 30분 동안 반응시킵니다. 다음으로, 나노 입자 표면의 남은 부위를 블로킹합니다. 이를 위해, 먼저 고체 methoxypolyethylene glycol thiol을 HPLC water를 사용하여 200 µM 농도로 용해합니다.티올(thiol)이 완전히 녹을 때까지 용액을 볼텍싱(vortex)합니다. 그런 다음, 나노 입자가 결합된 PEG 항체 용액에 티올 용액을 40,000:1 비율로 첨가하고, 금 나노 입자의 나머지 부위가 확실히 차단되도록 실온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 상층액이 투명해질 때까지 low bind 원심분리 튜브에 담긴 입자들을 원심분리하여 기능화된 라만 프로브(Raman probes)를 회수합니다.피펫팅으로 상층액을 제거하되, 나노 입자가 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 그런 다음, 1 mL의 PBS로 나노 입자를 재현탁합니다. 용액 약 3 µL의 UV-visible 측정을 통해 금 나노 입자의 농도를 추정하고, 이 관계가 선형적이므로 기지의 금 나노 입자 농도 결과와 비교하십시오.나노 입자가 충분히 블로킹되지 않으면 입자 간 부착력으로 인해 응집이 발생하며, 이는 시약이 잘못된 농도로 첨가되었음을 시사합니다. 일반적으로 용액은 진한 붉은색을 띠지만, 응집이 일어나면 회색 빛을 띱니다. 최종 용액의 농도가 최소 1 × 10¹¹ particles/mL가 되도록 부피를 조절하고, 아미노 분석 플레이트를 기능화하는 데 사용할 때까지 용액을 4 °C에서 보관하십시오.이 용액들은 1주일 이내에 사용하십시오. 먼저, 폴리스티렌 웰을 채울 수 있는 충분한 양의 희석된 항원을 준비합니다. 그다음, 용액을 볼텍싱하고 즉시 플레이트의 웰에 용액을 첨가하십시오.항원이 플레이트에 결합할 수 있도록 상온에서 1시간 동안 둡니다. 그 다음, 용액을 버리고 플레이트를 종이 타월이 깔린 테이블 상판에 가볍게 쳐서 과량의 항원 용액을 제거합니다. 웰에 TBST를 넣어 표면을 세척한 후, 다시 용액을 버리고 플레이트를 종이 타월이 깔린 테이블 상판에 쳐서 세척액을 제거합니다.다음으로, 플레이트의 각 웰에 70 µL의 HSA 블로킹 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 플레이트의 나머지 결합 부위를 차단함으로써 비특이적 결합을 방지합니다. 그 후, 블로킹 용액을 제거하고 앞서 설명한 대로 TBST로 플레이트를 3회 세척합니다. 마지막 세척액을 제거한 후, 플레이트를 덮어 4 °C에서 건조 상태로 보관하며 다음 단계까지 사용하지 않습니다.미리 준비한 프로브 나노 입자 140 µL를 96웰 플레이트의 첫 번째 열에 추가합니다. 테스트 나노 입자를 처음 다섯 행에 배치하고, 컨트롤 나노 입자를 마지막 세 행에 배치합니다. 나머지 모든 열에는 70 µL의 PBS를 추가합니다.각 컬럼을 1 대 2 연속 희석하여 희석합니다. 먼저 첫 번째 컬럼에서 70 µL를 취해 두 번째 컬럼과 섞습니다. 그다음 두 번째 컬럼에서 70 µL를 취해 세 번째 컬럼에 추가하며 이 과정을 반복합니다.플레이트를 최소 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 결합되지 않은 나노 입자 프로브를 제거하고 이전에 설명한 대로 TBST로 플레이트를 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 각 웰에 PBS 70 µL를 첨가하고 플레이트 실로 플레이트를 덮습니다.대조군 샘플이 투명한지 확인하십시오. 비특이적 결합이 발생한 경우, 대조군 샘플이 시험 샘플과 유사한 색을 띠게 됩니다. 각 웰에 대해 플레이트 리딩 UV-Visible 분광광도계를 사용하여 400에서 700 nanometers 범위의 UV-Visible 스펙트럼을 측정하십시오.도립 라만 현미경을 사용하여, 금 나노 입자 프로브가 있는 웰의 표면에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다. 해당 웰의 라만 스펙트럼을 얻습니다. 1800 cm⁻¹에서 400 cm⁻¹ 범위의 스펙트럼을 수집하고, 각 웰에 대해 이 과정을 반복합니다.마지막으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜의 최종 섹션에 있는 단계를 따라 설정된 장치의 민감도를 결정하십시오. 60 nm 금 입자가 이 비디오에 설명된 대로 준비되었습니다. 그 후 UV-Visible 분광법과 라만 분광법을 사용하여 분석되었습니다.각 금 나노 입자 농도에 따른 피크 면적을 오픈 소스 분광 분석 소프트웨어를 사용하여 측정하였으며, 이를 바탕으로 여기에 표시된 것과 같은 로그 보정 곡선을 생성하였습니다. 이 데이터를 기반으로 분석한 결과, 검출 한계는 UV-Vis 검출 시 3.5 picomolar, 라만 분광법 사용 시 1.7 picomolar로 나타났습니다. 이 영상을 시청한 후에는 UV-Vis 및 라만 분광법을 이용한 나노 입자 프로브 기반 면역 분석법의 최적화 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

이 동영상에서는 특정 표적 항원을 검출하기 위한 라만 분광법 기반 직접 면역분석 방법에 대해 설명합니다. 라만 프로브에 부착된 금 나노 입자의 표면에 흡착된 항체는 표적 항원과 상호 작용하여 특정 라만 스펙트럼을 생성하고, 이 스펙트럼은 이후에 검출됩니다.

특정 항원을 검출하기 위한 Raman 분광법 기반 직접 면역분석

우리는 나노 구조 기질과 고정화된 단백질 및 압타머와 인터페이스하는 나노 생물학적 시스템의 제조 및 특성화를 설명합니다. 나노 구조 기판의 리소그래피 제작, 생체 기능화 및 표면 강화 라만 분광법(SERS) 특성화와 관련된 관련 실험 단계가 보고됩니다. 표면 고정 단백질의 SERS 검출 및 단백질-리간드 및 압타머-리간드 결합의 프로빙이 입증되었습니다.

표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

제조 및 화학적 오염 물질 (예를 들어, 농약 ferbam 항생제 암피실린)의 검출을 위해 라만 분광 (SERS) 분석 향상된 필터 기반의 표면을 행하는 방법이 제시된다.

화학 오염 물질의 신속 검출을위한 라만 분광 분석 향상된 필터 기반의 표면

우리는 구체적 방법은 면역 분석법의 개발에 사용하기위한 입체 종이 기반의 미세 유체 소자를 제작한다. 장치 어셈블리에 대한 우리의 접근 방식은 다층의 종류, 첨가제 제조입니다. 우리는 종이 기반 디바이스의 이러한 유형의 대표적인 결과를 제공하는 샌드위치 면역 분석을 보여준다.

면역 측정법에 대한 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치의 제작

이 프로토콜에서 작동 하기 쉬운 여러 핵 산의 비주얼 검색 적용 될 수 있는 작은, 준비-사용 카세트의 제작을 설명 합니다. 이 방법에서는, 모 세관 배열 멀티플렉스 및 고효율 검출 조합 목표의 사용 되었다.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

이 프로토콜은 단일 세포 분해능을 달성할 수 있는 통합 된 라만 분광법 질량 분석법 (MS) 플랫폼을 제공합니다. 라만 분광법은 약물에 대한 세포 반응을 연구하는 데 사용할 수 있으며 MS는 약물 섭취 및 신진 대사의 표적 및 정량 분석에 사용될 수 있습니다.

단일 세포 약물 섭취, 신진 대사 및 효과를 연구하기 위한 통합 라만 분광법 및 질량 분광법 플랫폼

전기 습윤 기반 디지털 미세 유체는 마이크로 리터 볼륨 액적의 명백한 접촉 각도에서 전압 구동 변화를 활용하여 조작을 용이하게하는 기술입니다. 이를 기능화된 자기 비드와 결합하면 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 병원균의 시료 준비 및 식별을 위한 여러 실험실 단위 작업의 통합이 가능합니다.

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

이 논문은 세포외 소포 하위 집합의 특성화를 위해 처리량이 증가한 차세대 다중 매개변수 분석 플랫폼을 제안합니다. 이 방법은 마이크로어레이 바이오칩에 갇힌 소포 표적을 검증하기 위해 원자력 현미경에 의한 도량형 및 형태역학적 분석과 라만 분광법의 결합을 기반으로 합니다.

세포외 소포 하위 집합 분석을 위한 Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip의 다중 모드 분석 플랫폼

여기서는 라벨 없는 표면 증강 라만 분광법(SERS)을 사용하여 개별 작은 세포외 소포(sEV)를 분석하는 프로토콜을 제시하여, 최소 침습 질환 진단과 sEV의 치료 전달 매개체 평가를 가능하게 합니다.

질병 진단 및 치료에 개별 sEV의 표면 강화 라만 산란 기반 생체감지 적용 탐구

학습하세요 금 나노입자 기반 면역분석 플랫폼 제조법을 UV-Vis와 라만 분광학으로 검증하는 방법을. 기능화가 광학 특성에 미치는 영향과 맞춤형 연구 적용 가능성을 탐구합니다.

자외선 VI와 라만 분광학 면역 플랫폼 제조

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