HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

이 절차의 전반적인 목표는 HIV-1 감염 세포의 엑소좀 단백질체를 특성화하는 것입니다. 이 방법은 엑소좀 단백질체의 구성에 대한 외부 스트레스의 영향과 같은 엑소좀 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단백질체학 및 엑소좀 생물학에 대한 제한된 배경 지식으로도 배울 수 있다는 것입니다.

이 방법은 HIV 감염에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 박테리아 감염과 같은 다른 질병 연구에도 적용할 수 있습니다. H9 세포주가 이 실험에 사용되지만, 활발하게 증식하는 단계에 있고 선택한 테스트 조건에 취약한 한 다양한 세포주를 사용할 수 있습니다. 10단계에서 6단계로 9개의 세포를 2개의 세포 배양 플라스크에 각각 2회 파종합니다.

10% 양식화된 FBS, 리터당 100밀리그램 C13 표지 L-라이신, 리터당 100밀리그램 C13 및 N15 표지 L-아르기닌을 포함하는 10밀리리터의 표지된 배지에서 하나의 집단을 성장시킵니다. 10%stylized FBS, L-lysine 및 L-arginine을 사용하여 10ml의 라벨링되지 않은 배지로 다른 개체군을 성장시킵니다. 6배로 세포를 성장시키며, 이 시점에서 표지된 배지에 있는 세포의 단백질은 중질 아미노산으로 99% 이상 표지됩니다.

새 미디어를 추가하거나 셀 유형에 따라 일정한 시간 간격으로 미디어를 변경합니다. 라벨링이 끝나면 더 많은 세포의 성장을 수용할 수 있도록 배양량을 30ml로 늘립니다. 표준 HIV-1 감염 프로토콜을 사용하여 표지된 세포를 HIV-1의 NL4-3 균주로 감염시킵니다.

세포에 적절한 양의 바이러스를 첨가하고 48시간 동안 배양하면 표지되지 않은 세포가 HIV-1 감염 없이 표지되지 않은 배지에서 계속 자랍니다. HIV-1 감염이 끝나면 엑소좀 분리를 위해 두 세포 집단의 상층액을 수확합니다. 세포를 피하면서 50ml 원추형 튜브에 배양물의 상층액을 수집합니다.

g과 섭씨 4도의 300배에서 10분간 원심분리기를 하여 남아 있는 세포를 제거합니다. 새로운 50 밀리리터 원뿔 관에 있는 상등액을 모으고 2, 죽은 세포를 제거하기 위하여 000배 g에 10 분 동안 분리기를 모으십시오. 생성된 상층액을 초원심분리를 견딜 수 있는 상업용 로터 호환 튜브로 옮깁니다.

초원심분리기 튜브의 균형을 맞추십시오. 10, 세포 파편을 제거하기 위하여 000배 g에 30 분 동안 관을 분리기로 하십시오. 새로운 초원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다.

100, 000 번 g. 상층액을 버리십시오. 엑소좀이 풍부한 펠릿 각각을 5ml의 새 PBS에 재현탁하고 용액을 새로운 초원심분리 튜브로 옮깁니다.

100, 000 시간 g.에서 70 분 동안 다시 분리기. 마지막 탈수 후 상등액을 버립니다. 이제 세포 펠릿을 단백질을 추출할 준비가 되었습니다.

이 절차를 시작하려면 분리된 각 엑소좀 펠릿을 100-200마이크로리터의 fer-pa-lai-ses 및 추출 완충액에 용해시켜 모든 범위의 프로테아제를 억제할 수 있는 프로테아제 억제제를 추가합니다. 용해된 해결책을 13, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 분리기. 세척된 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

표준 분석법으로 각 샘플의 단백질 농도를 정량화한 후, 라벨링된 샘플과 라벨링되지 않은 샘플에서 동일한 양의 단백질을 혼합합니다. 30 분 동안 4-20 % SDS-PAGE 젤에 동일한 혼합물을 실행하십시오. 젤을 Coomassie blue로 염색한 다음 염색합니다.

면도날을 사용하여 젤에서 샘플 레인을 자른 다음 젤 레인을 10-15 등분으로 자릅니다. 각 조각을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 총 10-15개의 튜브를 만들고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 추출 절차를 계속합니다. 단백질체학 데이터 분석 절차는 시연되지 않지만 이 순서도에 요약되어 있습니다.

추출된 단백질은 먼저 액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분광법으로 분석되고 데이터의 품질이 평가됩니다. 다음으로, 정량화된 펩타이드가 2개 미만인 단백질을 제거하여 데이터를 전처리합니다. 그런 다음 현저하게 상향 조절되고 하향 조절된 단백질이 식별됩니다.

마지막으로, 일관성을 달성하기 위해 유의한 후보의 반복실험을 비교하고 모든 반복실험의 데이터를 병합합니다. 식별된 단백질의 특성 분석을 시작하려면 GenBank 식별 번호 또는 UniProt ID를 사용하여 현재 엑소좀 데이터베이스를 검색합니다. 이 데모에서는 ExoCarta가 사용됩니다.

쿼리를 클릭하고 유전자 또는 단백질 이름 또는 식별 번호를 입력합니다. 엑소좀에 있는 모든 증거는 후보 단백질이 이전에 엑소좀에서 발견되었다는 것을 입증하며, 후보 단백질이 실제로 엑소좀에 있다는 확신을 더해줍니다. 다음으로, HIV-1 및 인간 단백질 상호 작용 데이터베이스에서 후보 물질을 검색합니다.

protein domain name 항목에서 후보의 이름 또는 식별 번호를 입력하고 search를 클릭합니다. 검색 결과는 HIV-1과 단백질 후보 물질 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 어떤 후보 물질이 실제로 HIV-1과 관련이 있는지 제안할 수 있습니다. 세 번째 단계는 fun-brich와 같은 유전자 온톨로지 또는 GO 분석 소프트웨어를 사용하여 후보 물질에 대한 글로벌 통찰력을 얻는 것입니다.

보강 분석에서 데이터 세트 추가를 클릭하고 후보의 GenBank 가입 번호 또는 UniProt ID를 업로드한 다음 차트 유형을 선택하여 GO 분석을 시각화합니다. GO 분석 결과는 생물학적 과정, 세포 구성 요소 및 분자 기능 영역에서 후보 단백질에 대한 정보를 제공하는 파이 차트 형태로 시각화됩니다. 다음 단계는 DAVID 분석을 통해 통계적으로 과대 대표된 GO 용어를 식별하는 것입니다.

기능 주석 도구를 클릭하고 후보 목록을 입력한 후 UniProt ID와 같은 유전자 식별자를 선택하고 유전자 목록을 선택하고 검색합니다. 검색이 완료되면 gene ontology 범주 아래의 주석 요약 결과 페이지를 클릭하여 enriched GO terms, p-values 및 기타 매개변수를 확인합니다. 마지막으로, 공개적으로 액세스할 수 있는 STRING 데이터베이스를 사용하여 잠재적인 단백질-단백질 상호 작용 및 가능한 생화학적 경로를 조사합니다.

지정된 검색 상자에 단백질 ID 또는 염기서열을 입력하고 분석에 적합한 종을 선택합니다. 검색을 클릭합니다. 결과는 직접 및 간접 연관성에 대한 정보를 제공합니다.

결과에 표시된 엑소좀 후보에 대해 알려진 상위 10개의 일치 항목은 중요한 후보 선택에 대해 고려되어야 합니다. 14개 단백질 세트에 대한 DAVID 분석의 대표적인 결과가 표시됩니다. 생물학적 과정 농축은 세포 사멸 관련 과정이 상당히 풍부하다는 것을 나타냅니다.

세포 성분 농축은 세포 내 기원을 가진 많은 단백질을 보여주며, 분자 기능 농축은 대부분의 후보 물질에 대한 단백질 결합의 역할을 확인했습니다. L-젖산 탈수소효소 B 사슬 또는 LDHB가 가장 유의미한 후보로 선택되었으며, STRING 분석을 통해 LDHB의 상위 10개 상호 작용 파트너를 식별했습니다. LDHB 파트너의 대다수는 HIV-1의 엑소좀과 기능적으로나 위치적으로도 관련이 있었습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 온도와 조건에서 각 단계를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 생물 정보학 분석의 예측을 확인하기 위해 친화성 분리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 엑소좀 분야의 연구가 생물학에서 HIV-1 감염과 관련된 엑소좀 단백질체의 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 배양에서 엑소좀을 분리하고, 단백질체를 분석하고, HIV와의 연관성을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. HIV 또는 기타 감염원에 대한 작업은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.