Name: HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 학습하세요 SILAC 기반 단백체 분석을 통해 HIV-1 감염 세포의 엑소좀 특성을 규명하는 방법을. H9 세포주를 활용한 이 기법은 단백질 동역학 연구에 활용 가능합니다.

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이 작품은 BR의 수명 / 술 / 브라운 CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 및 K24HD080539에 ARRA 보충에 의해 지원되었다. 이 작품은 또한 수명 파일럿 연구 기금 (# 701 5857),로드 아일랜드 재단 의학 연구 그랜트 (# 20133969)와 ML에 NIH 코 브레 URI / RIH 파일럿 연구 그랜트 (P20GM104317)에 의해 지원되었다. 우리는 원고와 그림 준비에 도움 제임스 오스트레일리아 산 아카시아와 VY 젠장 감사합니다.

1. 세포 배양 및 HIV-1 감염 참고 : 실험을 시작하기 전에,이 MTT 분석 (12)를 통해 트리 판 블루 염색 (11)를 통해 세포의 생존과 증식을 확인하는 것이 좋습니다. 또한 새롭게 준비 SILAC 매체를 사용하는 것이 중요합니다. 다양한 세포주가 활발하게 증식 단계에 있으며, HIV-1 감염, 또는 원하는 시험 조건에 민감한만큼 사용될 수있다. 이 프로토콜에서, 예로서, H9 세포주를 사용한다. <ol><li> 각 세포 배양 플라스크에 종자 2 × 106 H9 세포. 10 % 투석 된 소 태아 혈청 (FBS), 100 ㎎ / ℓ (13) C (6) L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ 13 15 C 6 N 4 L 아르기닌을 함유하는 RPMI 1640 배지 10ml에 표시된 하나의 그룹으로 성장한다. 투석 FBS 10 %, 100 ㎎ / ℓ의 L- 라이신 및 100 ㎎ / ℓ L- 아르기닌과 함께 10 mL의 표지되지 않은 RPMI 1640 배지에서 다른 그룹 성장. </li><li>큰 아미노산으로 표지 된 배지에서 세포의 단백질이 실질적으로 완전히 분류되는 점을 6 분열 (&gt; 99 %)에 대한 세포 성장. 신선한 매체를 추가 또는 정기적으로 미디어를 변경 (모든 1~3일 세포의 종류에 따라. H9 세포의 경우, 중간 3 일마다 변경). 라벨의 끝에서보다 세포의 성장을 수용하기 위해 배양 부피 (예를 들어 ~ 30 ㎖)을 증가시킨다. 주 : 트립 판 블루 염색법 및 세포 계수를 통해 실험의 시작 시간을 두배 정확한 셀을 결정한다. </li><li> HIV-1 NL4-3 48 시간 동안 표준 HIV-1 감염 프로토콜 13을 사용으로 표시된 세포를 감염. 0.3 주변 감염의 다중성 (MOI)로 바이러스의 적절한 양의 세포를 인큐베이션. 에이즈-1 P24 항원 ELISA 키트를 사용하여 배양 상층 액의 P24 정량에 의해 HIV-1 감염을 확인합니다. 세포의 성공적인 감염을 확인하기 위해 면역 형광 분석 (14)을 수행합니다. KEEp는 HIV-1 감염없이 레이블이없는 배지에서 레이블이없는 세포를 성장. </li><li> 감염의 끝 (2.1 단계)에서 두 그룹의 상층 액을 수확. </li></ol> 2. 엑소 좀 격리 주 : 초 원심 분리의 일련의 단계를 통해, 배양 상청액 분획으로부터 exosomal 15 농축된다. 적어도 100,000 × g으로의 속도에 도달 할 수있는 초 원심 분리기 로터와 4 ° C에서 다음의 모든 단계를 수행합니다. <ol><li> 세포를 피하고, 50 ML 원뿔 튜브의 문화의 상층 액을 수집합니다. 잔여 세포를 제거하기 위해 300 × g으로 10 분 동안이를 원심 분리기. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 튜브의 상층 액을 수집하고 죽은 세포를 제거하는 2,000 XG에 10 분을 원심 분리기. 초 원심을 견딜 수있는 상업 회 호환 튜브에 상층 액을 결과로 전송. </li><li> 초원 심 분리기 튜브의 균형을해야합니다. 제거 10,000 × g으로 30 분 동안 튜브를 원심세포 파편. </li><li> 100,000 x g에서 70 분 동안 초 원심 분리기 튜브의 상층 액을 원심 분리기를 수집합니다. 상층 액을 버린다. </li><li> 신선한 PBS 5ml에 엑소 좀 풍부한 펠릿 재현 탁. 100,000 x g에서 70 분 동안 다시 신선한 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기에 솔루션을 전송합니다. </li><li> 취소 상층 액. 엑소 좀을 장기 저장하려면, -80 ° C에서 PBS와 저장소의 50 μL에 펠렛을 재현 탁. 아래 그림과 같이 다른 방법으로, 단백질 추출에 직접 진행합니다. </li></ol> 3. 단백질 추출 및 준비 <ol><li> 추가 프로테아제 억제제 칵테일 100 ~ 200 ㎕를 RIPA 용해 및 추출 버퍼에 격리 exosomal 알약을 녹여. 버퍼을 pH 7.6에서 25 mM 트리스 - 하이드로 클로라이드, 150mM 염화나트륨, 1 % NP-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.1 % SDS (도데 실 황산나트륨)로 구성된다. 프로테아제 저해제 칵테일은 아프로 티닌, bestatin, L 같은 프로테아제 억제제의 다양한 포함해야eupeptin는 및 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 펩 스타틴, 즉 프로테아제의 전체 범위를 억제 할 수있다. </li><li> 13,000 XG (4 ° C)에서 10 분 동안 용해 된 솔루션을 원심 분리기, 새로운 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 삭제 상층 액을 전송합니다. </li><li> bicinchoninic 산 (BCA) 또는 브래드 포드 분석법 (16)을 이용하여 엑소 좀의 각 샘플의 단백질 농도를 정량화. </li><li> 레이블과 레이블이없는 샘플에서 단백질의 동일한 양 (2 μg의)를 혼합하고 120mA에서 4-20 % SDS-PAGE 겔에 동일한 혼합물을 실행 / 200 V 분 30. </li><li> 쿠마시 블루 염색 된 겔 (17)을 탈색 하였다. </li><li> 면도날을 사용하여 겔로부터 샘플 레인 잘랐다. 그런 다음 10 ~ 15과 동일한 조각으로 겔 차선을 잘라. 10 ~ 15 튜브의 총 신선한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 각 조각을 넣어. </li><li> 50 % 아세토 니트릴, 소용돌이 25 mM의 NH 4 HCO 3 큐브를 체험하고, 상층 액을 버린다. 두 번 반복합니다. 마른진공 농축기 (18, 19)에 큐브. </li><li> 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT), 소용돌이, 그리고 원심 분리기 간단히 큐브를 재수. 1 시간 동안 56 ° C에서 품어. 폐기 뜨는. </li><li> 55 MM의 요오도 아세트 아미드, 소용돌이, 스핀에서 젤 큐브를 담가. 45 분 동안 어둠 속에서 실온에서 인큐베이션. 폐기 뜨는. </li><li> 25 mM의 NH 4 HCO 3, 소용돌이, 스핀 큐브를 체험하고, 상층 액을 버린다. </li><li> 50 % 아세토 니트릴, 소용돌이, 스핀에서 25 mM의 NH 4 HCO 3 조각을 담가. 3.9와 3.10를 반복합니다. </li><li> 진공 농축기에서 큐브를 건조. 25 mM의 NH 4 HCO 3에서 25 ㎕의 서열 등급 수정 트립신을 추가, 30 분 동안 4 ° C에서 배양하고, 초과 솔루션을 폐기합니다. 트립신없이 25 mM의 NH 4 HCO 3 큐브를 담그고, 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 간단히 아래로 큐브를 회전 및 추가 생성 된 펩타이드를 전송새로운 튜브에 중부 표준시. 30 분, 스핀를 들어, 큐브에 50 % 아세토 니트릴 소용돌이를 5 % 포름산의 30 μl를 추가합니다. 추출물에 뜨는을 결합합니다. 이하의 5 μL을 진공 농축기와 펩티드 추출물을 건조. </li><li> LC-MS / MS 분석을 위해 질량 분석기 핵심 기능 샘플을 제출한다. 오픈 소스 소프트웨어에서 생성 할 수있는 MS 분석 데이터는 전형적으로 기탁 식별 된 각각의 단백질 번호 표지 / 비 표지 된 펩티드 및 식별 된 고유의 수를 포함한다. </li></ol> 4. 웨스턴 블로 팅 확인 참고 : 웨스턴 블롯은 질량 분석 결과를 확인하는 것이 좋습니다. <ol><li> 표준 웨스턴 블로 팅 프로토콜에 따라로드되는 각 그룹에서 단백질의 동일한 금액을 보장합니다. MS에 의해 식별 관심의 단백질에 대한 항체 (예를 들어 넥신 A5, 젖산 탈수소 효소의 B 체인)를 사용합니다. 농도계의 analysi와 함께 웨스턴 블로 팅 검출,의, MS 단백질 식별 및 정량이 올바른지 재확인 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 단백체 데이터 분석 참고 : 각 MS 복제에 대한 중요한 단백질 후보의 데이터 품질 평가, 데이터 전처리, 계산 및 결정은 개별적으로 수행됩니다. 상기 분석이 완료되면, 복제에서 분석 된 데이터를 비교하고, (21) 20 (6) 합성. <ol><li> MS 데이터의 품질을 평가한다. <ol><li> 우선, SILAC-MS 스프레드 시트 프로그램 / 정량 단백질 표지 된 비 표지 변환 LOG2. </li><li> 과학적 그래프 통계 소프트웨어 그룹의 비율이 40-100 빈들에 비하고 히스토그램을 생성하기 위해 빈 당 비의 수를 플롯. 히스토그램의 정규 분포는 MS 데이터 (6)의 좋은 품질을 나타냅니다. 모든 MS가 복제에 대해이 단계를 수행합니다. </li></ol></li><li>MS는 펩티드의 비 신뢰성 및 정확성을 높이기 위해 2 개 미만 정량화 펩타이드가 단백질을 제거하는 것을 고려. </li><li> 크게 상향 및 하향 조절 단백질 후보를 결정하기 위해, 의미 (22)을 임계 값 계산하기 위해 다음 단계를 사용하십시오. <ol><li> 과학적 그래프 통계 소프트웨어, 도수 분포 데이터를 비선형 회귀 또는 곡선 맞춤을 생성한다. 이 단계는 컷오프 값을 계산하는데 사용될 수있는 값을 산출한다. 99 % 신뢰 한계에 대해 1.96, 95 % 신뢰 한계에 대한 σ 또는 2.56 σ ± 평균과 한계 값을 계산합니다. 참고 : 컷오프를 계산의 구체적인 세부 사항은 Emmott 등의 알에서 찾을 수 있습니다. 22. </li><li> 중 중간 아래 (크게 과발현) 중간 위보다 1.96 (또는 2.56) 표준 편차 이하보다 1.96 (또는 2.56) 표준 편차 (누구의 비율 인 단백질 후보를 선택크게 아래의 발현). </li></ol></li><li> 일관성을 달성하기 위해 상기 식별 된 중요한 후보의 복제를 비교한다. 그들은이 최종 선택 단계를 통과하기 위해 다음과 같은 기준을 충족하는지 확인하십시오 후보가 일관되게 모든 복제에서 확인되어야한다 그리고 후보의 복제가 규제 자신의 방향으로 일관성이 있어야합니다 (규제 상향 또는 하향 조정 바람직 후보의 3 복제 중 적어도 2 중이어야 함). </li><li> 그 복제의 데이터를 병합하여 상기 언급 된 기준을 충족 후보 데이터 확정. </li></ol> 6. 생물 정보학 확인 및 특성 참고 : 기존의 게놈 및 생물 정보학 정보는 거의 모든 단백질에 대한 풍부한 정보를 제공합니다. 정보에 대한 데이터 마이닝 및 생물 정보학 분석은 중요한 후보자의 재산과 기능에 대한 통찰력의 큰 거래를 확보에 도움이 될 수 있습니다. 이 proce을SS는 적절한 하류 습식 실험실 실험을 설계하는 것이 필요하다. <ol><li> 자신의 GenBank 액 번호 또는 UniProt ID를, 현재의 엑소 좀 데이터베이스에 대해 후보자를 검색 (Exocarta 23 Evpedia 24)를 사용하여 후보 단백질 이전 엑소에서 발견되어 있는지 확인합니다. 이 단계는 후보 엑소 좀에 참으로 신뢰의 레이어를 추가합니다. <ol><li> 액세스 http://www.exocarta.org/는 &quot;조회&quot;입력하거나 유전자 또는 단백질 이름 / 가입 번호를 클릭합니다. 요약 페이지가 나타납니다와 엑소의 증거는 존재하는 경우 제공, 표시됩니다. </li></ol></li><li> 에이즈-1과 인간 단백질 상호 작용 데이터베이스 (25)에 대한 후보를 검색 할 수 있습니다. 대안 적으로, 후보 단백질의 상호 작용 및 테스트 조건에 대한 정보를 제공 할 수있는 특정 데이터베이스를 검색. <ol><li> www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIV에서 데이터베이스에 액세스상호 작용. &#39;단백질 도메인 이름&#39;항목에서 후보자의 이름 또는 가입 번호를 입력하고 검색을 클릭합니다. 검색 결과는 HIV-1 단백질 후보들 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하고, 진정으로 HIV-1이 연관 될 수있는 후보들의 제안 할 수있다. </li></ol></li><li> 오기 GenBank 등록 번호 또는 (예컨대 FunRich 기능적 보충 분석 도구 (26)) GO 분석 소프트웨어로 후보 UniProt ID 및 소프트웨어를 실행. <ol><li> http://www.funrich.org/에서 소프트웨어를 다운로드합니다. 설치 후, 농축 분석에서, 클릭 &quot;데이터 세트 추가&quot;소프트웨어를 열고, 단백질 / 유전자의 목록을 업로드 할 수 있습니다. 다음으로, GO 분석을 시각화 할 수있는 차트 유형을 선택합니다. 참고 : GO 분석 결과는 파이 차트의 형태로 가시화 될 것이다. 이 단계는 (생물학적 프로세스 (BP), 세포 구성 요소의 분야에서 후보자와 관련된 글로벌 통찰력을 얻을 C를 도움이C), 분자 기능 (MF). </li></ol></li><li> 액세스 데이비드는 http://david.ncifcrf.gov/ 27, 자사의 웹 사이트에 &quot;기능 주석 도구&quot;를 클릭합니다. , 예를 들면 &quot;UniProt ID&quot;로 유전자의 &quot;식별자&quot;를 선택, 후보 목록을 입력 &quot;유전자 목록&quot;및 검색을 선택합니다. 농축 GO 조건, P-값 및 다른 매개 변수는 &quot;Gene_Ontology&quot;카테고리에서 &quot;주석 요약 결과&quot;페이지를 클릭하여 확인할 수 있습니다. </li><li> 다른 단백질과 후보자의 잠재적 인 상호 작용을 조사하기 위해, 잠재적 인 단백질 - 단백질 상호 작용이 가능한 생화학 적 경로를 명료하게 공개적으로 액세스 할 수 STRING 데이터베이스 (28)를 사용합니다. 주 : 분석 기능성 주석 (제 6.3-6.4)를 이동도 최신 STRING 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수있다. <ol><li> http://string-db.org/에서 데이터베이스에 액세스 할 수 있습니다. 지정된 S에 입력 단백질 ID 또는 시퀀스earch 상자와 분석에 대한 올바른 종을 선택합니다. &quot;검색&quot;을 클릭합니다. 결과는 모두 직접 (물리적) 및 간접 (기능) 협회에 대한 정보를 제공합니다. exosomal 후보에 대한 상위 10 알려진 경기가 표시됩니다 상당한 후보 선택을 위해 고려되어야한다. 주 : 후보와 관련된 많은 정보는 위의 단계를 사용하여 분석 될 수있다. 가장 중요한 후보 하류 분자 및 생화학 적 분석을 위해 선택 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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저자는 이해 상충이 없다고 선언했습니다.

이 논문에 기재된 절차에서는 호스트 exosomal 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 조사하기 SILAC 기술의 적용을 설명했다. 처음에 감염되지 않은 및 HIV-1에 감염된 세포는 차동 동위 원소 표지입니다. 차등 표지 엑소 좀은 단백질 추출을 수행하기 전에 정제된다. 다음에, 액체 크로마토 그래피 - 탠덤 질량 분석은 exosomal 프로테옴을 분석하기 위해 사용된다. 마지막으로, 생성 된 질량 분석 데이터 및 잠재적 후보 단백질 통계적 정보학을 실시 하류 생화학 해부하기 전에 해석한다. 프로토콜에 걸쳐 중요한 단계는 최적의 결과를 달성하기 위해 따라야 할 필요가있다. 프로토콜의 초기 단계에서, SILAC 라벨링은 세포 유형 및 라벨 매체에 의해 영향을받을 수있다. 건강 높은 증식 세포는 높은 표지 효율을 얻기 위해 사용한다. 비판적, 라벨 medium 갓 투석 소 태아 혈청 (FBS)이 아닌 일반 FBS를 사용하여 제조한다. 투석 된 FBS는 아미노산 및 펩티드의 고...

바이러스 감염을 포함한 많은 인간의 질병은 종종 및 영향을받는 세포 주위에 발생하는 독특한 세포 과정과 연결되어 있습니다. 단백질은 종종 이러한 과정을 중재 궁극적 이펙터 세포로서 작용. 단백질의 분석은 종종 영향을 세포의 지역 환경에 관한 귀중한 정보를 제공하고 질병 발병의 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 있습니다. 다양한 단백질 분석 기법 중 프로테오믹스 특히 큰 약속을 보유하고있다. 강력한 대규모 도구로서 특히 프로테오믹스 기능과 단백질의 상호 작용의 영역에서 세포 과정의 체계적인 이해를 제공 할 수있다. 특정 단백질을 분석하여 조사 부위에서 연구자들은 세포 성분, 특히 단백질의 발현을 모니터링 할 수 있도록 분류 기술의 개발을 간단하게한다. 많은 프로테옴 분석은 세포에서 수행되었지만프로테옴 규모, 세포 내 구획에 단백체 특성화 1 특히 유익한 것으로 판명했다. 이는 HIV-1 감염의 연구에서 잘들 수있다. 엑소 좀 셀 타입 2, 3, 광범위한 분비 30-100 nm의 막 소포 간 통신 및 분자 수송의 중요한 구성 요소이다. 이들은 이전에 HIV-1 신진 공정 4, 5에 중요한 역할을하는 발견되었다. 기능 해부와 단백체 분석을 결합함으로써, 우리는 HIV-1에 감염된 세포에서 방출 엑소 좀은 세포 사멸 및 증식 (6)을 포함하여 수용 세포를 이웃에 휴대 속성에 영향을 미칠 독특하고 정량적으로 다른 단백질 서명과 항구 규제 분자로 구성되어 있음을 발견했다. 방법이 프로토콜에 설명되어즉 SILAC HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀 7 기반 단백체 특성 (세포 배양에서 아미노산에 의해 안정 동위 원소 라벨). 비슷한 접근 방식은 더 나은 특정 구획 또는이자의 일부에 실험 스트레스를 조절하고 설명 된 절차에 필요한 사항을 변경하여 발병하는 동안 다른 세포 내 구획을 이해하고 적용 할 수 있습니다. 정량 프로테오믹스 방법의 최근 발전을 감안할 때, 특정 실험을 위해 가장 효율적인 방법을 선택 할 때 선택할 많은있다. 이 중 화학 기반 iTRAQ (상대 및 절대 정량 동중 태그) (8) 및 라벨없는 MRM (다중 반응 모니터링) (9) 기술이다. 두 방법 모두 강력한 도구이며 특정 설정을위한 좋은 선택입니다. 일반적인 실험실은 주로 세포 라인 작업을 위해, 그러나,이 두 가지 방법이 relativel이Y 높은 비용은 더 많은 시간이 걸리는 SILAC 기반 방법에 비해. SILAC 세포질 단백질로 배양 배지로부터 아미노산의 비 방사성 동위 형태를 포함 대사 라벨링 기반 기술이다. 일반적으로 SILAC 실험 예를 들어 두 개의 세포 집단, 감염 및 감염되지 않은 시작합니다. 전체 라벨이 달성 될 때까지 각각 차등의 특정 동위 원소 환경에서 레이블이 붙어 있습니다. 이러한 세포의 표지 엑소 좀이어서 단백질 추출을 실시한다. 일단 분류 exosomal 단백질 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분광법 (10)를 사용하여 분석된다 추출 하였다. 마지막으로, 질량 분석 결과와 유의 표지 단백질은 통계를 실시하고 정보학 엄격한 생화학 검증뿐만 아니라 분석한다. 이전 조사 보고서 세포주는 일반적되는 것과 SILAC / 엑소 절차, 일차 전지보다 세포주에 더 적합한 것으로 제안효율적인 동위 원소 라벨에 대한 활성 증식 상태,

<table><tbody><tr><td>H9 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-176</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>MTT 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>투석 소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>SILAC 단백질 정량 분석 키트 &ndash; RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher</td><td>89982</td><td>DMEM 버전 (89983)</td></tr><tr><td>L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88434</td> L-Lysine-2HCl, SILAC Thermo Fisher 88431 <td></td></tr> HIV-1 NL4-3 NIH AIDS 시약 <tr><td></td><td></td> 프로그램<td>용 13C6</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>2480</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 항원 ELISA 키트</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>냉장 초고속 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>22628045</td><td></td></tr><tr><td>냉장 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td>100,000 x g</td></tr><tr><td>50mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>에 도달할 수 있어야 합니다.초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti 로터</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>Thermo Fisher</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp; 78430</td><td></td></tr><tr><td>써모믹서&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Biorad</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE 겔 장치</td><td>Thermo Fisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td><td>Novex</td><td>XV04200PK20</td><td></td></tr><tr><td>Gel 염색 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 등급 변형 트립신</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>인간 애넥신 A5에 대한 항체</td><td>Abcam</td><td>ab14196</td><td></td></tr><tr><td>인간 젖산 탈수소효소 B 사슬에 대한 항체</td><td>Abcam</td><td>ab53292</td><td></td></tr><tr><td>그래프 및 통계 소프트웨어</td><td>Systat&nbsp;</td><td>시그마플롯&nbsp;</td><td>또는 GraphPad 프리즘</td></tr><tr><td>정량적 단백질체학 소프트웨어 제품군</td><td>Max Planck Institue of Biochemistry</td><td>Maxquant&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소프트웨어 및 데이터베이스</td><td>Various Vendors</td><td></td><td>자세한 내용은 본문을 참조하십시오.</td></tr></tbody></table>

hiv-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 silac 기반 단백체 특성

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

단백질체학은 단백질의 대규모 분석입니다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)과 같은 단백질체학 기술은 한 번에 수천 개의 단백질을 특성화할 수 있습니다. 이러한 강력한 기술을 통해 특히 세포가 감염, 스트레스 및 특정 테스트 조건과 같은 다양한 자극을 받을 때 세포 변화를 체계적으로 이해할 수 있습니다. 최근의 발전에도 불구하고 엑소좀 단백질체를 분석하는 것은 시간이 많이 걸리고 종종 복잡한 방법론이 필요합니다. 또한 결과적으로 생성된 대규모 데이터 세트는 연구원이 추가 다운스트림 연구를 수행하기 위해 강력하고 간소화된 분석이 필요한 경우가 많습니다. 여기에서는 세포가 HIV-1에 감염되었을 때 엑소좀 단백질체를 특성화하기 위한 SILAC 기반 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 간단한 동위원소 라벨링, 차등적으로 라벨링된 세포에서 엑소좀의 분리, 질량 분석 분석을 기반으로 합니다. 그 다음에는 단백질체 유효 물질에 대한 자세한 데이터 마이닝 및 생물 정보학 분석이 이어집니다. 결과 데이터 세트 및 후보는 이해하기 쉬우며 다운스트림 분석에 유용한 풍부한 정보를 제공하는 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 다른 세포 내 구획 및 광범위한 테스트 조건에 적용할 수 있습니다.

도 1a는 SILAC 라벨링 방법 (21)을 개략적으로 나타내는 흐름도이다. 엑소 좀을 정제하기 위해, 샘플은 원심 분리를 통해 스핀 다운되어야한다. 도 1b는 직렬 초 원심 분리하여 엑소 좀 21 정화 단계를 도시한다. 정제하면 절차에 설명 된 바와 같이, 엑소 좀 실험 단백체 분석 될 수 있습니다. 도 2a는 단백체 데이터 (21)로부터 상당한 단백질 후보를 결정하기위한 흐름도이다. 선택한 후보는 다음 하류 프로테오믹스 분석에 사용됩니다. 도 2b는 SILAC 히스토그램의 예 (이 숫자는 리튬 등의 변형...

여기서는 호스트 exosomal의 프로테옴에서 HIV-1 감염의 효과를 분석하기 위해, 세포 배양 (SILAC)의 아미노산이 안정 동위 원소에 의한 표지의 기술을 이용하여 정량적 프로테오믹스 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 쉽게 다른 스트레스 또는 감염 조건 하에서 세포에 적용 할 수있다.

HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

이 절차의 전반적인 목표는 HIV-1 감염 세포의 엑소좀 단백질체를 특성화하는 것입니다. 이 방법은 엑소좀 단백질체의 구성에 대한 외부 스트레스의 영향과 같은 엑소좀 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단백질체학 및 엑소좀 생물학에 대한 제한된 배경 지식으로도 배울 수 있다는 것입니다.이 방법은 HIV 감염에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 박테리아 감염과 같은 다른 질병 연구에도 적용할 수 있습니다. H9 세포주가 이 실험에 사용되지만, 활발하게 증식하는 단계에 있고 선택한 테스트 조건에 취약한 한 다양한 세포주를 사용할 수 있습니다. 10단계에서 6단계로 9개의 세포를 2개의 세포 배양 플라스크에 각각 2회 파종합니다.10% 양식화된 FBS, 리터당 100밀리그램 C13 표지 L-라이신, 리터당 100밀리그램 C13 및 N15 표지 L-아르기닌을 포함하는 10밀리리터의 표지된 배지에서 하나의 집단을 성장시킵니다. 10%stylized FBS, L-lysine 및 L-arginine을 사용하여 10ml의 라벨링되지 않은 배지로 다른 개체군을 성장시킵니다. 6배로 세포를 성장시키며, 이 시점에서 표지된 배지에 있는 세포의 단백질은 중질 아미노산으로 99% 이상 표지됩니다.새 미디어를 추가하거나 셀 유형에 따라 일정한 시간 간격으로 미디어를 변경합니다. 라벨링이 끝나면 더 많은 세포의 성장을 수용할 수 있도록 배양량을 30ml로 늘립니다. 표준 HIV-1 감염 프로토콜을 사용하여 표지된 세포를 HIV-1의 NL4-3 균주로 감염시킵니다.세포에 적절한 양의 바이러스를 첨가하고 48시간 동안 배양하면 표지되지 않은 세포가 HIV-1 감염 없이 표지되지 않은 배지에서 계속 자랍니다. HIV-1 감염이 끝나면 엑소좀 분리를 위해 두 세포 집단의 상층액을 수확합니다. 세포를 피하면서 50ml 원추형 튜브에 배양물의 상층액을 수집합니다.g과 섭씨 4도의 300배에서 10분간 원심분리기를 하여 남아 있는 세포를 제거합니다. 새로운 50 밀리리터 원뿔 관에 있는 상등액을 모으고 2, 죽은 세포를 제거하기 위하여 000배 g에 10 분 동안 분리기를 모으십시오. 생성된 상층액을 초원심분리를 견딜 수 있는 상업용 로터 호환 튜브로 옮깁니다.초원심분리기 튜브의 균형을 맞추십시오. 10, 세포 파편을 제거하기 위하여 000배 g에 30 분 동안 관을 분리기로 하십시오. 새로운 초원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다.100, 000 번 g. 상층액을 버리십시오. 엑소좀이 풍부한 펠릿 각각을 5ml의 새 PBS에 재현탁하고 용액을 새로운 초원심분리 튜브로 옮깁니다.100, 000 시간 g.에서 70 분 동안 다시 분리기. 마지막 탈수 후 상등액을 버립니다. 이제 세포 펠릿을 단백질을 추출할 준비가 되었습니다.이 절차를 시작하려면 분리된 각 엑소좀 펠릿을 100-200마이크로리터의 fer-pa-lai-ses 및 추출 완충액에 용해시켜 모든 범위의 프로테아제를 억제할 수 있는 프로테아제 억제제를 추가합니다. 용해된 해결책을 13, 000 시간 g 및 4 섭씨 온도에 10 분 동안 분리기. 세척된 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.표준 분석법으로 각 샘플의 단백질 농도를 정량화한 후, 라벨링된 샘플과 라벨링되지 않은 샘플에서 동일한 양의 단백질을 혼합합니다. 30 분 동안 4-20 % SDS-PAGE 젤에 동일한 혼합물을 실행하십시오. 젤을 Coomassie blue로 염색한 다음 염색합니다.면도날을 사용하여 젤에서 샘플 레인을 자른 다음 젤 레인을 10-15 등분으로 자릅니다. 각 조각을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 총 10-15개의 튜브를 만들고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 추출 절차를 계속합니다. 단백질체학 데이터 분석 절차는 시연되지 않지만 이 순서도에 요약되어 있습니다.추출된 단백질은 먼저 액체 크로마토그래피, 탠덤 질량 분광법으로 분석되고 데이터의 품질이 평가됩니다. 다음으로, 정량화된 펩타이드가 2개 미만인 단백질을 제거하여 데이터를 전처리합니다. 그런 다음 현저하게 상향 조절되고 하향 조절된 단백질이 식별됩니다.마지막으로, 일관성을 달성하기 위해 유의한 후보의 반복실험을 비교하고 모든 반복실험의 데이터를 병합합니다. 식별된 단백질의 특성 분석을 시작하려면 GenBank 식별 번호 또는 UniProt ID를 사용하여 현재 엑소좀 데이터베이스를 검색합니다. 이 데모에서는 ExoCarta가 사용됩니다.쿼리를 클릭하고 유전자 또는 단백질 이름 또는 식별 번호를 입력합니다. 엑소좀에 있는 모든 증거는 후보 단백질이 이전에 엑소좀에서 발견되었다는 것을 입증하며, 후보 단백질이 실제로 엑소좀에 있다는 확신을 더해줍니다. 다음으로, HIV-1 및 인간 단백질 상호 작용 데이터베이스에서 후보 물질을 검색합니다.protein domain name 항목에서 후보의 이름 또는 식별 번호를 입력하고 search를 클릭합니다. 검색 결과는 HIV-1과 단백질 후보 물질 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 어떤 후보 물질이 실제로 HIV-1과 관련이 있는지 제안할 수 있습니다. 세 번째 단계는 fun-brich와 같은 유전자 온톨로지 또는 GO 분석 소프트웨어를 사용하여 후보 물질에 대한 글로벌 통찰력을 얻는 것입니다.보강 분석에서 데이터 세트 추가를 클릭하고 후보의 GenBank 가입 번호 또는 UniProt ID를 업로드한 다음 차트 유형을 선택하여 GO 분석을 시각화합니다. GO 분석 결과는 생물학적 과정, 세포 구성 요소 및 분자 기능 영역에서 후보 단백질에 대한 정보를 제공하는 파이 차트 형태로 시각화됩니다. 다음 단계는 DAVID 분석을 통해 통계적으로 과대 대표된 GO 용어를 식별하는 것입니다.기능 주석 도구를 클릭하고 후보 목록을 입력한 후 UniProt ID와 같은 유전자 식별자를 선택하고 유전자 목록을 선택하고 검색합니다. 검색이 완료되면 gene ontology 범주 아래의 주석 요약 결과 페이지를 클릭하여 enriched GO terms, p-values 및 기타 매개변수를 확인합니다. 마지막으로, 공개적으로 액세스할 수 있는 STRING 데이터베이스를 사용하여 잠재적인 단백질-단백질 상호 작용 및 가능한 생화학적 경로를 조사합니다.지정된 검색 상자에 단백질 ID 또는 염기서열을 입력하고 분석에 적합한 종을 선택합니다. 검색을 클릭합니다. 결과는 직접 및 간접 연관성에 대한 정보를 제공합니다.결과에 표시된 엑소좀 후보에 대해 알려진 상위 10개의 일치 항목은 중요한 후보 선택에 대해 고려되어야 합니다. 14개 단백질 세트에 대한 DAVID 분석의 대표적인 결과가 표시됩니다. 생물학적 과정 농축은 세포 사멸 관련 과정이 상당히 풍부하다는 것을 나타냅니다.세포 성분 농축은 세포 내 기원을 가진 많은 단백질을 보여주며, 분자 기능 농축은 대부분의 후보 물질에 대한 단백질 결합의 역할을 확인했습니다. L-젖산 탈수소효소 B 사슬 또는 LDHB가 가장 유의미한 후보로 선택되었으며, STRING 분석을 통해 LDHB의 상위 10개 상호 작용 파트너를 식별했습니다. LDHB 파트너의 대다수는 HIV-1의 엑소좀과 기능적으로나 위치적으로도 관련이 있었습니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적절한 온도와 조건에서 각 단계를 수행하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 생물 정보학 분석의 예측을 확인하기 위해 친화성 분리와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 엑소좀 분야의 연구가 생물학에서 HIV-1 감염과 관련된 엑소좀 단백질체의 변화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 세포 배양에서 엑소좀을 분리하고, 단백질체를 분석하고, HIV와의 연관성을 조사하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. HIV 또는 기타 감염원에 대한 작업은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자에서 엑소좀을 분리하는 그래디언트 절차를 설명하는 기술을 설명합니다. 이 절차는 HIV에 감염된 사람의 인간 혈장에 있는 HIV 입자로부터 엑소좀을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리된 엑소좀은 사이토카인/케모카인 함량을 분석했습니다.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

이 프로토콜은 EV 강수량, 밀도 그라데이션 초원심분리 및 입자 포획을 통합하여 고효율 및 수율을 가진 비리온으로부터 세포외 소포(EV)를 분리하여 간소화된 워크플로우와 시동 감소를 허용합니다. 모든 EV 연구에서 사용할 수 있는 재현 가능한 준비를 할 수 있습니다.

바이러스로부터 멀리 떨어진 고수율 세포 외 소포 제제의 정제

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.

다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화

여기에서는 특히 HIV-1 감염에 중점을 두고 소포체(ER) 스트레스 및 풀린 단백질 반응(UPR) 활성화를 측정하기 위한 몇 가지 확립된 방법에 대해 설명합니다. 이 기사에서는 또한 ER 스트레스/UPR이 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에 미치는 영향을 조사하기 위한 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.

HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

학습하세요 SILAC 기반 단백체 분석을 통해 HIV-1 감염 세포의 엑소좀 특성을 규명하는 방법을. H9 세포주를 활용한 이 기법은 단백질 동역학 연구에 활용 가능합니다.

HIV-1에 감염된 세포에서 엑소 좀의 SILAC 기반 단백체 특성

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