해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

이 BABB 염기 조직 투명화 방법의 전반적인 목표는 관심 샘플 내 깊은 곳에서 라벨링된 구조를 비침습적으로 이미징할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 정상적인 관상동맥 형성에 기여하는 세포 또는 분자와 같은 심혈관 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행이 간단하고 값비싼 시약이 필요하지 않으며 다른 조직 제거 방법에 비해 빠르다는 것입니다.

이 기술의 의미는 관상 동맥 심장 질환 치료로 확장되는데, 혈관 형성을 이해하는 것이 질병을 예방하거나 정상적인 심장 기능을 회복하기 위한 치료 전략으로 이어질 수 있기 때문입니다. 시술 당일에는 해부 현미경과 집게를 사용하여 시간이 지정된 임신한 쥐의 진통제 주머니를 조심스럽게 엽니다. 각 배아에서 난황낭을 제거하고 탯줄을 절단합니다.

심장을 제거하려면 스테인리스 스틸 미닛맨 핀을 사용하여 PBS로 채워진 실리콘 엘라스토머가 있는 35mm 페트리 접시에 각 배아를 고정합니다. 그리고 가는 집게를 사용하여 상자를 조심스럽게 열고 큰 그릇의 내부와 심장을 절단하십시오. 겸자로 심장 뒤로 손을 뻗어 후심관을 잡고 부드럽게 당겨 장기를 제거합니다.

PBS가 들어있는 신선한 35mm 페트리 접시에 심장을 넣습니다. 필요에 따라 가는 집게를 사용하여 폐 조직을 잘라내고 심장을 차가운 PBS가 들어 있는 48웰 플레이트의 1웰로 옮깁니다. 심장을 모두 채취하면 끝이 가는 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 우물의 PBS를 흄 후드에 있는 0.5ml의 4% 파라포름알데히드로 교체합니다.

고정 기간이 끝나면 고정제를 제거하고 차가운 PBS에서 심장을 두 번 헹굽니다. 전체 마운트 면역 염색을 위해 심장을 투과화하려면 샘플을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 회전하면서 0.5-1ml의 PBST로 10분 동안 3회 세척하여 조직을 헹굽니다. 세 번째 세척 후 PBST에 갓 준비한 10% 염소 세럼 1ml를 넣고 실온에서 번갈아 가며 심장을 1시간 동안 차단합니다.

그런 다음 혈청을 400-500 마이크로리터의 신선한 차단 완충액에 있는 1차 관심 항체로 교체하여 섭씨 4도에서 밤새 회전합니다. 다음날 항체를 제거하고 실온에서 회전하면서 1ml의 PBST에 1시간 동안 6회 헹궈 심장을 씻습니다. 마지막 세척 후 PBST를 새로운 차단 버퍼로 교체하고 적절한 형광단 접합 2차 항체를 계속해서 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

그런 다음 방금 시연한 것처럼 PBST로 심장을 6번 씻습니다. 컨포칼 현미경 검사를 위해 실리콘 엘라스토머로 코팅된 접시를 준비하려면 흄 후드에서 각 심장에 대해 하나의 광학 유리 바닥 배양 접시 중앙에 4ml 나사 상단 바이알의 뚜껑 하나를 놓습니다. 그런 다음 보안경을 착용하고 각 접시에 실리콘 엘라스토머를 약 0.5cm 깊이까지 채웁니다.

애플리케이터 카트리지를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 적용되는 두 구성 요소를 혼합합니다. 화합물이 최소 24시간 동안 경화되도록 하고 바이알 뚜껑이 각 접시의 중앙에 남아 있는지 확인합니다. 엘라스토머가 설정될 때 플레이트에서 캡을 제거합니다.

심장을 제거하기 전에 호일로 덮인 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 실온에서 PBS 시리즈로 희석된 메탄올 희석을 통해 샘플을 각각 5분 동안 회전시킵니다. 75번의 완벽한 메탄올 회전 후 5분 동안 3회 동안 심장을 100% 메탄올에 담그십시오. 마지막 탈수 회전 후, 각 엘라스토머 웰의 중앙에 배아 13.5일까지 심장을 놓습니다.

해부 현미경 아래에서 샘플을 등쪽이 위로 향하게 합니다. 끝이 가는 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 심장 주위의 메탄올을 제거합니다. 그런 다음 흄 후드에서 새 피펫을 사용하여 50-50개의 갓 준비한 BABB를 메탄올 용액에 첨가하여 심장이 잠길 수 있을 만큼 충분한 양입니다.

하트가 여전히 불투명할 때 방향을 확인합니다. 관상동맥 혈관 또는 기타 관심 구조물의 양호한 이미징을 보장하기 위해 투명화가 완료되기 전에 컨포칼 레이저의 위치에 따라 샘플의 방향을 지정하는 것이 매우 중요합니다. 5분 후, 용액을 흄 후드의 유리 폐기물 병으로 옮기고 샘플이 용액 한 방울 안에 놓이도록 신선한 BABB만 충분히 추가합니다.

샘플은 5분 이내에 투명해져야 합니다. 조직이 깨끗해지면 용액을 최소한의 BABB로 교체하십시오. 이제 샘플을 이미지화할 준비가 되었습니다.

배아 11.5일째에 PECAM1 항체는 주로 심장의 심내막과 유출 혈관을 염색합니다. 그러나 일부 내피 세포는 좌심실 벽에서도 관찰될 수 있습니다. 여기서 대동맥에 근사한 증가된 혈관 구조는 배아 12.5일 심장에서 관찰될 수 있습니다.

이 12 슬라이스 z 투영은 배아 일 12.5 심장의 전체 패리 트렁크 신경총을 보여줍니다. 그러나 일부 혈관은 결국 대동맥의 PECAM1 염색이 심한 충막에 국한되어 있기 때문에 z 스택을 여러 개의 하위 스택으로 분할하면 더 많은 시각적 정보를 얻을 수 있습니다. 배아 15.5일 심장의 이러한 5슬라이스 z 투영은 PECAM1 염색을 통해 대동맥 및 폐 판막의 시각화를 용이하게 합니다.

관상 동맥 모세혈관 네트워크의 분기와 상호 연결로 인해 더 작은 하위 스택 투영에서 더 명확하게 관찰됩니다. 이미징 소프트웨어 분석을 통해 샘플을 수동으로 분할하여 주변 혈관 구조가 있거나 없는 관상 동맥을 강조할 수 있습니다. 전체 배아의 혈관 구조도 PECAM1 염색 및 BABB 청소를 사용하여 검사할 수 있습니다.

BABB 세척 직후 또는 약 2개월 후에 이미지화된 PECAM1로 11.5일째 배아를 추가로 염색한 결과, 투명도 용액에 장기간 보관한 후에도 이미징할 수 있을 만큼 형광 신호가 충분히 강하다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 완전히 익히면 해부부터 이미지 캡처까지 약 일주일 만에 완료할 수 있습니다. 작은 샘플의 세척 및 장착만으로도 30분 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 컨포칼 현미경 이미징을 준비하기 위해 배아 심장을 절개하고, 형광 라벨링하고, BABB 투명 배아 심장을 제거하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 관상동맥 혈관 형성 중 세포 형태와 관련된 추가 질문에 답하기 위해 다광자 이미징과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술을 통해 발생 생물학 분야의 연구자들은 마우스 배아 심장 및 기타 모델 시스템의 혈관 발달을 탐구할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 섬세한 배아 조직이 손상되지 않도록 샘플을 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. BABB와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 장갑 착용과 같은 예방 조치에 따라 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 가운 및 보안경을 착용해야 합니다.