성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 체외 연구를 위해 성체 마우스 척수에서 1차 혼합 신경교세포 배양을 확립하는 것입니다. 이 방법은 신경병성 통증 및 다발성 경화증과 같은 척수 내 병리학적 변화를 포함하는 신경 질환에서 신경교세포의 역할을 조사할 수 있는 체외 시스템을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 성체 쥐의 척수에서 신경교 배양을 준비하여 생체 내 조건을 보다 정확하게 반영하는 시스템을 제공한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Jennifer Malon입니다. 조직 배양 후드에서 작업하면서 4개의 마우스 척수를 HBSS의 페트리 접시로 옮깁니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여 각 척수를 작은 조각으로 자릅니다.

그런 다음 파파인 DNAse 효소 혼합물이 들어 있는 50mm 원뿔형 튜브에 조각을 옮깁니다. HBSS를 효소 혼합물로 옮기면 효소의 성능이 저하될 수 있으므로 피하십시오. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해서는 조직 조각을 잘 소화하는 것이 중요합니다.

그러나 과도하게 소화되면 생존 가능한 세포가 줄어듭니다. 각 실험실은 세포에 가장 적합한 것을 기반으로 정확한 분해 시간을 결정하기 위해 파일럿 테스트를 수행해야 합니다. 다음으로, 튜브를 부드럽게 와류로 일으킨 다음 섭씨 37도에서 1시간 동안 분당 150회 회전하는 궤도 흔들기로 배양합니다.

배양 후 튜브를 소용돌이치게 한 다음 5mm 피펫을 사용하여 조직을 격렬하게 분쇄하여 추가 해리를 촉진합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300 x g 동안 원심분리합니다. 원심 분리하는 동안, 300 마이크로 리터의 재구성 된 알부민 오보 뮤코이드 억제제 용액을 멸균 튜브에 2.7 밀리리터의 ABSS로 넣고 잘 혼합한다.

그런 다음 150마이크로리터의 DNAse 용액을 추가합니다. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 갓 제조된 알부민 오보뮤코이드 억제제 및 DNAse 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포 펠릿을 깨뜨리기 위하여 우물을 소용돌이치십시오.

그런 다음 DNAse가 없는 재구성된 알부민 오보뮤코이드 억제제 용액 3ml를 세포 현탁액에 추가합니다. 실온에서 6분 동안 70 x g의 세포를 원심분리합니다. 스핀 후, 멤브레인 파편을 포함하는 상등액을 제거하고 펠릿을 유지합니다.

해리된 척수 세포에서 미엘린을 제거하려면 먼저 8ml의 실온 20% 구배 밀도 매체를 세포 펠릿이 들어 있는 튜브에 넣고 부드럽게 와류를 일으킵니다. 다음으로, 800 x g에서 세포를 깨지지 않고 실온에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 대부분 미엘린과 상층액을 포함하는 파편의 최상층을 조심스럽게 흡인하여 펠릿을 떠납니다.

남아 있는 밀도 구배를 제거하려면 HBSS로 희석된 8ml의 cDMEM으로 펠릿을 재현탁하여 세포를 세척합니다. 세포를 400g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 이전과 같이 희석된 cDMEM으로 세포를 세척합니다.

상등액을 제거한 후, 펠릿은 세포를 파종할 때까지 얼음에 보관할 수 있습니다. 도금 준비가 되면 2-메르캅토에탄올을 보충한 14ml의 cDMEM에 세포를 재현탁합니다. 그리고 12웰 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 세포 현탁액을 추가합니다.

웰당 평균 세포 수와 배양의 미세아교세포 함량을 결정하는 데 사용할 수 있는 여분의 플레이트. 세포가 플레이트링되면 섭씨 35.9도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 플레이팅 다음 날인 1일차에 매체를 변경합니다.

일부 세포는 배양 플레이트에 부착되어 있지만 여전히 대부분 둥글습니다. 또한 많은 떠 다니는 세포와 상당한 파편이 있습니다. 그 후 3-4일 동안 세포가 12일에서 14일 사이에 치료를 받을 준비가 될 때까지 배지 변경을 반복합니다.

성체 C57 블랙 6 마우스의 혼합 신경교세포를 섭씨 37도 또는 섭씨 35.9도에서 배양하고 유세포 분석을 통해 분석했습니다. 보시다시피, 이러한 온도에서 전체 세포 개체군에는 명백한 차이가 없습니다. 이러한 대표적인 플롯은 이전에 표시된 전체 세포 집단에서 분리된 CD45 양성 CD11b 양성 미세아교세포 집단을 보여줍니다.

이 그림은 혼합 아교세포를 섭씨 37도가 아닌 섭씨 35.9도에서 배양할 때 더 높은 미세아교세포 함량을 얻을 수 있음을 보여줍니다. 성체 척수, 혼합 신경교 배양은 C67 블랙 6 마우스에서 준비되었습니다. 1일, 4일, 8일, 12일에 배양된 세포의 대표 이미지가 표시됩니다.

미디어의 중요성을 보여주는 것뿐만 아니라 문화의 전형적인 진보를 보여주는 이미지는 포스트 컬처 확립 첫날부터 변화합니다. 일단 마스터하면 혼합 신경교세포 배양의 초기 설정은 적절하게 수행될 경우 약 4시간 내에 완료될 수 있습니다. 혼합 신경교세포 배양이 확립된 후, 고갈된 미세아교세포 및 미세아교세포 농축 배양은 이 초기 혼합 집단에서 얻을 수 있습니다.

그러나, microglia 농축 세포의 수율은 배양을 확립하기 위해 많은 수의 척수를 사용하지 않는 한 제한될 것입니다. 이 기술은 처음에 신경병성 통증이 발생하는 동안 신경교세포의 역할을 조사하기 위해 고안되었습니다. 그러나 성인 척수 내의 병리학적 변화를 포함하는 다른 신경 질환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.