오징어로부터 색소를 추출하는 방법 Doryteuthis의 pealeii

이 절차의 전반적인 목표는 갓 절개된 오징어인 Doryteuthis pealeii chromatophores의 나노 구조 과립 내에 위치한 색소를 추출하는 방법을 설명하는 것입니다. 두족류는 피부 색에 빠르고 적응력 있는 변화를 겪는 복잡한 해양 동물입니다. 그리고 피부 색에 대한 적응 적 변화.

그러나 이러한 시스템의 작동 방식에 대해서는 아직 알려지지 않은 것이 많습니다. 이 기술의 주요 장점은 크로마토포어 기관의 나노 구조 과립을 특이적으로 표적으로 한다는 것입니다. 이를 통해 연구자들은 나노 스케일에서 발생하는 색상 변화 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

두족류 생물학에 대한 통찰력 외에도 사전 패키징된 착색 나노 입자를 사용하여 두족류에 표시되는 적응형 색상의 동적 범위를 모방하도록 구축된 합성 시스템의 설계에 정보를 제공할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 주변 조직과의 근접성으로 인해 순수한 크로마토포어 조직을 수집하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪습니다. 당사의 방법은 이러한 오염 물질을 줄이기 위해 최적화되어 있습니다.

해부를 시작하려면 먼저 약 250ml의 여과된 바닷물을 해부 팬에 붓습니다. 팬에 표본을 넣고 스테인레스 스틸 직선 가위를 사용하여 배쪽 맨틀 바닥에서 동물의 뒤쪽을 따라 지느러미 영역에서 끝납니다. 해부 겸자로 부드럽게 들어 올리고 가위를 사용하여 결합 조직을 절단하여 모든 내부 장기를 제거합니다.

장기는 표본 주머니에 넣어 버리십시오. 해부 T 핀을 사용하여 맨틀 핀 쪽을 위로 향하게 하여 해부 패드에 고정합니다. 겸자로 불투명한 표피 피부층을 조심스럽게 제거하고 크로마토포어가 함유된 피부층은 그대로 유지합니다.

표피층을 검체 백에 버립니다. 다음으로 크로마토포어 층을 제거합니다. 크로마토포어 조직을 1cm x 1cm의 작은 절편으로 자릅니다.

절편을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 각 튜브를 절개된 조직으로 반쯤 채웁니다. 마지막으로 튜브에 여과된 해수 500마이크로리터를 추가합니다. 안료 과립을 고립시키기 위하여는, 첫번째 14, 000 x g에 5 분 동안 chromatophore 조직 단면도를 분리기

바닷물의 최상층을 버리십시오. 500마이크로리터의 파파인 콜라겐분해효소 용액을 샘플에 첨가하고 가장 높은 설정에서 1-2분 동안 와류에 넣습니다. 다음으로, 40kHz에서 5분 동안 샘플을 초음파 처리하여 주변 조직에서 세포를 해리합니다.

14, 000 x g에서 5분 더 원심분리기를 한 다음 상층액을 버립니다. 원심분리를 두 번 더 반복하고 매번 상등액을 버립니다. 그런 다음 콜라겐 분해 효소에 재현탁액을 추가합니다.

계속하기 전에 집게를 사용하여 소화되지 않은 나머지 큰 조직 부분을 수동으로 제거합니다. 시작 과립 용액의 순도는 안료 추출에 영향을 미칩니다. 따라서 시작 크로마토포어 물질이 완전히 소화되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

우리는 약 1cm의 조직 절편이 가장 순수한 과립 집단을 수집하는 데 최적이라는 것을 발견했습니다. 150ml 나사 캡 튜브를 사용하여 적절한 양의 HEPES, 염화마그네슘, 아스파르트산칼륨 및 디티오트레이톨을 첨가하여 균질화 완충액을 준비합니다. 프로테아제 억제제의 시판되는 미니 정제 1개를 추가하십시오.

눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 탈이온수 100ml를 측정하여 균질화 염이 들어있는 튜브에 추가합니다. 용액이 투명해질 때까지 튜브를 소용돌이치게 합니다. 조직 샘플을 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.

각 튜브에 500마이크로리터의 균질화 완충액을 추가하고 와류를 2분으로 만들어 완전히 혼합합니다. 샘플을 40kHz에서 30분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 다시 원심분리하십시오.

상층액을 버린 후 균질화 첨가, 초음파 처리 및 원심분리를 2-3회 반복하여 세포외 조직의 완전한 소화를 보장합니다. 마지막으로, 튜브에는 밝은 노란색 상층액과 분리된 색소 과립으로 구성된 빨간색 펠릿이 포함되어야 합니다. 상등액을 버리십시오.

먼저 메탄올 5ml와 진한 염산 25mcL를 첨가하여 스크류 캡 유리 샘플에서 추출할 산성 메탄올을 준비합니다. 용액을 부드럽게 휘저어 섞습니다. 1개의 표본 관을 옆으로 두십시오, 이것은 끝 반작용한 과립 처리일 것입니다.

과립이 들어 있는 두 번째 튜브에서 균질화 완충액을 제거합니다. 나머지 튜브에 산성 메탄올 용액 500mcL를 넣고 3-4분 동안 와류를 일으킵니다. 샘플을 40kHz에서 10분 동안 초음파 처리한 다음 14000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.

마이크로피펫을 사용하여 원드램 스크류 탑 유리 바이알에 상층액을 수집합니다. 이것은 안료이며 색이 짙은 빨간색으로 나타나야 합니다. 산성 메탄올 첨가, 초음파 처리 및 원심분리 단계를 4-5회 반복하여 더 이상 색이 추출되지 않을 때까지 상층액을 수집합니다.

나머지 무색 펠릿은 색소 추출 과립입니다. 이미징을 위해 과립 샘플을 준비하기 위해 먼저 미반응 과립 분취액과 추출된 색소 과립을 모두 14000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 각 펠릿을 95% 에탄올 1ml에 재현탁합니다. 전사 피펫을 사용하여 각 과립 현탁액 2-3방울을 별도의 알루미늄 SEM 스터브에 놓습니다.

샘플을 데시케이터에 넣어 진공 상태에서 밤새 건조시킵니다. 스퍼터링은 15나노미터 코팅을 얻기 위해 3분 동안 금 백금 코팅으로 스터브를 코팅합니다. 주사 전자 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.

다음으로, 분광 광도계를 사용하여 미반응 과립, 추출된 과립 및 추출된 안료에 대한 흡광도 프로파일을 수집합니다. 깨끗한 큐벳에 탈이온수 1ml를 추가하여 과립 샘플에 대한 빈 측정을 수행합니다. 블랭크는 쓰레기통에 버리십시오.

다음으로, 미반응 색소 과립을 함유하는 현탁액을 큐벳에 첨가합니다. 과립 샘플에 대한 UV VIS 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 1mL의 산성 메탄올과 깨끗한 큐벳을 사용하여 추출된 안료에 대한 두 번째 blank 측정을 수행합니다.

마지막으로, 색소에 대한 UV vis 흡수 스펙트럼을 취한 다음 각 샘플의 최대 파장을 측정합니다. 주사 전자 현미경은 색소 추출 과정이 과립의 평균 직경을 감소시킨다는 것을 밝혔습니다. 추출 전 과립의 평균 직경은 527.3nm입니다.

산성 메탄올 처리 후 이 크기는 약 202.6nm로 크게 감소합니다. 색소 추출로 인한 것으로 생각되는 감소. 산성 메탄올이 첨가되면 미반응 과립과 관련된 색상도 눈에 띄게 감소합니다.

이 가설의 확인은 분광 광도법을 사용하여 얻어졌습니다. 이 그래프는 사전 추출된 과립에 대한 광범위한 흡광도 프로파일과 추출된 후 과립에 대한 유사하게 넓지만 더 낮은 강도 프로파일을 보여줍니다. 대조적으로, 용해성 추출 안료는 약 500nm에서 lambda max와 약 380nm에서 뚜렷한 shoulder를 나타냅니다.

총체적으로, 이러한 데이터는 과립에서 가시적인 색의 성공적인 추출을 시사합니다. 이 기술을 완전히 익히면 처음부터 끝까지 약 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 추출 및 분석을 방해할 수 있는 반사 단백질 혈소판이 포함된 조직을 완전히 제거해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

표피 조직은 또한 균질화 단계와 색소 추출을 방해할 수 있습니다. 이 절차에 따라 박층 크로마토그래피 및 질량 분석법과 같은 다른 방법을 사용하여 안료를 추가로 정제하고 조성을 특성화할 수 있습니다. 이러한 단계는 두족류의 착색에 대한 분자 기여도를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법은 해양 생물학자, 화학자 및 엔지니어를 위한 다음과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 그들은 피부 chromatophore 기관 내의 나노 구조 과립의 기능과 구조에 어떻게 기여합니까? 이 비디오를 시청한 후에는 갓 해부된 오징어, doryteuthis pealeii chromatophores에서 색소를 추출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.