Name: Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: 학습하세요 유한요소해석(FEA)을 활용하여 Danio rerio 턱의 생체역학을 시뮬레이션하는 방법을. 이 기술은 골격 발달과 세포 행동에 대한 통찰을 제공하며, 다른 생물학적 구조에도 적용 가능합니다.

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LHB는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 동적 셀 박사 프로그램에 의해 투자되었다; KAR은 MRC 프로젝트 교부금에 의해 투자되었다 MR / L002566 / 1 (EJR과 CLH에게 수여) 및 CLH는 우리는 또한 이미징 조언 울프슨의 Bioimaging 시설을 감사드립니다 ARUK 부여 19479.에 의해 투자되었다.

프로토콜 내의 모든 단계는 대학 브리스톨의 동물 보호 및 복지 가이드 라인과 영국 홈 오피스의 사람들의하십시오. 근골격계 해부학 1. 시각화 참고 : 근육을 정량화하고 근육 첨부 파일의 정확한 위치를 식별하기 위해, 골격 요소의 모양을 시각화하기 위해, 발현 사이 (섹션 1.1) (근육을 계시) 골격 미오신에 해당하는 나이에 물고기와 유형 II 콜라겐 (시각화 연골). 대안 적으로, 콜라겐 A1 기자 col2a1로 형질 전환 형광 기자 라인을 사용하여 근골격계 해부학을 시각화 : mCherry (13, 14)을 연골과 느린 마이 오신 중쇄 기자 smyhc를 시각화 : GFP (15)는 근육 첨부 (1.2 절)의 위치를 시각화 할 수 있습니다. 연골과 근육을 표시 대체 라인은 동일하게 작동 할 수 있습니다. <ol><li> 형광 Immunostaining <ol><li> 1 시간 동안 인산염 - 완충 염수 (PBS)에 과량의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 유충을 수정. 0.1 % 트윈 20 (PBT)를 PBS로 세척하고 각각 5 분 동안 PBT 50 % 메탄올 (MeOH 중), 100 % 메탄올 탈수. 주의 : PFA는 독성 및 물질 안전 시트에 따라 처리해야합니다. 주 : 필요한 유충까지 100 % 메탄올에 저장 될 수있다. </li><li> 5 분 동안 PBT 50 % MeOH 중 유충 재수. 5 분 동안 PBT에 씻으십시오. </li><li> 5-6 분 동안 얼음에 PBT에서 0.25 % 트립신의 유충을 Permeabilize 하시려면. 5 분마다 4 배 PBT에 씻으십시오. </li><li> PBT에서 5 %의 혈청에서 2 ~ 3 시간 동안 차단합니다. </li><li> 실온에서 1 시간 또는 밤새 4 ° C에 대한 PBT에서 5 % 혈청 토끼 항 제 2 형 콜라겐과 마우스 항 - 미오신 항체의 권장 희석 애벌레를 품어. 주 : 권장 희석 범위는 항체의 데이터 시트에 일반적이다. 서로 다른 종에 대해 제기하고 또한 diffe되어 있습니다 항체를 선택조직에 임대. </li><li> PBT에서 15 분 동안 유충의 6 배를 씻으십시오. </li><li> PBT에서 5 %의 혈청에서 1-2 시간 동안 차단합니다. </li><li> 어둠 속에서 이차 항체에 품어. 특정 항체에 대한 5 %의 혈청 및 PBT에서 적절한 희석에 형광 표지 된 항 마우스 (550) 및 항 - 토끼 (488) 차 항체를 사용합니다. </li><li> 가능한 한 빨리 10 배의 공 초점 현미경에 PBT 및 이미지 10 분씩 세척 6X. </li></ol></li><li> 영상 근골격계 형상 <ol><li> Danieau의 솔루션 (16)에 미지근한 0.3 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스의 커버 슬립에 복부 애벌레를 탑재합니다. 참고 : 형질 전환 물고기는 장착하기 전에 및 이미징 동안 0.02 %의 MS222 (Tricaine의 메탄, pH가 7)에 진정해야합니다. </li><li> 10 배 대물 렌즈와 약 2.5 배 디지털 줌을 사용하여 관심 영역의 공 초점 이미지 스택을 가져 가라. 488 nm의 561 N을 사용하여 녹색과 적색 채널의 이미지를 준비합니다m은 각각 레이저. 1.3 μm의 3 라인 평균의 Z 평면 사이의 간격을 512 X 512 픽셀 해상도에서 이미지. 얻어진 스택은 약 100 Z 슬라이스로 포함 할 것이다. </li><li> 티파니 시리즈로 데이터를 보냅니다. 5dpf 제브라 피쉬 유충의 근육과 연골 요소의 최대 예측은 그림 1에 나타내었다. </li></ol></li></ol> 2. 3D 표면을 생성 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 3, 4, 5 DPF에서 각 시점에 대한 대표적인 데이터 집합을 선택 (복수 샘플의 시각화 후 선택). </li><li> 3 차원 티파니 스택을 열고 분석 소프트웨어의 모든 채널을 선택합니다. 오른쪽 연골 채널을 클릭하고 이미지 필터와 평활 선택 가우스 (그림 2B)를. </li><li> 프로젝트보기에서 바로 &#39;새 레이블을 편집&#39;을 여과 이미지를 클릭하고 &#39;이미지 분할&#39;을 선택합니다. 각각의 재료, 즉, 연골와 j에 대한 새 레이블 만들기OINT. 마법 지팡이 도구를 사용하여 이미지의 연골 영역 (그림 2C, 흰색 신호, 보라색 개요)을 선택합니다. 윤곽 노이즈를 제거하기 위해 브러시 도구를 사용합니다. 참고 : 마법의 지팡이 도구를 사용하는 경우, &#39;모든 조각&#39;을 클릭합니다. </li><li> 브러시 도구를 사용하여 공동 지역을 선택하고 공동 구성 요소에 할당 (그림 2C, 블루 개요) </li><li> 상단 메뉴와 부드러운 라벨에 분할을 선택하여 한 번에 부드럽게 여러 조각. 오른쪽 3 차원 표면이 성분 (그림 2D)의 렌더링 생산하기 위해 표면을 생성하는 이미지를 클릭하여 선택합니다. </li><li> 표면을 클릭하고 메쉬 소프트웨어로 가져 오기위한 hmascii 파일로 데이터를 저장합니다. </li></ol> 3. FE 모델에 사용되는 근육의 힘을 계산 <ol style="margin-left: 40px;"><li> smyhc의 공 초점 이미지에서 근육 섬유의 수를 계산 : GFP 형질 전환 제브라 피쉬 (그림 1A, 화살촉, 1C)과 DIAM을 측정섬유 라 미터는 그 단면적을 계산 (πr 2). </li><li> 문헌에서 근육의 단위 면적당 적절한 힘을 확인합니다. 유생 제브라 골격근 (40 윈 / μm의 2)에 대한 단위 면적당 발생하는 최대 근력 17을 사용 하였다. </li><li> 단위 면적당의 힘에 의해 섬유의 수와 면적을 곱하여 각 해부학 근육 그룹의 힘을 계산한다. 표 1을 참조하십시오. </li></ol> 4. 메쉬 생성 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 유한 요소 메쉬를 생성 할 수있는 소프트웨어 패키지에 부 (2) (위)에서 생성 된 3 차원 모형을 가져. </li><li> 2 차원 메뉴의 수축 포장 도구를 사용하여 연골과 관절면의 A2D 메쉬를 생성합니다. 적절한 요소 크기를 선택합니다. 주 : 1.5 ~ 2.5 사이의 요소 크기를 사용합니다. 필요하다면, 상이한 크기의 2 차원면의 범위 차원 메쉬 최적화 (제 4 실시 메쉬를 생성한다.4). </li><li> &#39;&gt; 2D 도구&gt; 요소 확인&#39;을 아래에 메쉬 품질 검사를 수행 메쉬에서 중복 요소를 삽입하고 침투를 확인하기 위해 패널을. 모델 트리에서 유틸리티 탭을 사용하여 면각 각도를 수정합니다. </li><li> 3 차원&gt; Tetramesh 부속 패널을 사용하여 요소 크기를 서로 다른의 2 차원 표면 메쉬에서 3D 메쉬를 생성합니다. 주 : 다른 메쉬 크기의 결과를 비교 한 후 상기 시뮬레이션 수렴 및 기능의 정의를 손상하지 않는 최저 메쉬 크기의 FE 모델을 선택한다. 그림 3의 예는 아래턱의 연골에 대한 150 만 사면체 요소를 포함하고 2.0의 2D 요소 크기를 가지고 있었다. </li><li> 턱 모델은 형상&gt; 거리 부속 패널을 사용하여 공 초점 스택에 따라 확장 할 수 그래서 메쉬를 변환. 참고 : 연골을 확인하고 공동 구성 요소가 병합 된 모델을 수출하거나 관계를 사용하여 모델로 연결된다. </li></ol> 5. 유한 요소 모엘 건설 <ol><li> 상용 유한 요소 소프트웨어를 사용하여, FE 모델을 생성한다. 차원 근육 가이드로 부 (1)에서 생성 된 연골 표지 촛점 스택을 사용하여 근육의 어태치먼트 포인트에 대응하는 노드를 할당한다. 각 근육의 기원과 삽입을 나타내는 두 개의 노드 (그림 3) 사이의 벡터를 생성합니다. </li><li> 유형 &#39;역사&#39;의 부하 집 만들기 각 근육에 대한 &#39;C로드&#39;를 적용합니다. (단계 3.3에서 계산) 뉴턴의 크기를 지정하고 관련 벡터를 할당 할 수 있습니다. 3은 내전 mandibulae (AM), 각도기 hyoideus (PH) 및 intermandibularis (IM)에 대한 접속 지점을 보여줍니다. 주 :이 턱 근육 최대 수축력 각 부하의 50 %의 각 부위에 도포 될 수 있도록 삽입 원점 사이에 분배된다. </li><li> 문헌의 결정에 따라 적절한 탄성 등방성 재료의 특성을 할당합니다. 연골 영률이 모델의 영역 간은 각각 1.1 MPa의 0.25 MPa로했고, 푸 아송의 비율은 모두 18, 19 0.25이었다. </li><li> 모델에 초기 제약 조건을 적용하는 유형 &#39;경계&#39;의 부하 수집기를 만듭니다. 탭 분석&gt; 제약으로 이동하여 생성 서브 패널에, 당신은 제한하고자하는 모델의 노드를 선택합니다. 자유도 (DOF) 모션의 자연 범위의 가장 근사치에 모델의 한계 운동을 선택합니다. 참고 :도 3의 모델이 모션 모든 축에 구속되었다 모델의와의 중간 점에서 공간을 고정하기 ceratohyal에서 (DOF 1, 2, 3은 각각 X, Y 및 Z를 나타낸다) palatoquadrate는 제브라 피쉬 해골의 나머지 부분 (그림 3, 표 1)에 연결되는 지점에서 Y 및 Z 축. 이 모델은 적어도 하나의 노드에 세 DOF에 제한해야합니다. </li><li> 당신이 SIMUL하고자하는 운동의 각 유형에 대한 &#39;로드 단계를&#39;만들기분석 메뉴에서 (즉, 개방, 폐쇄)를 먹었고,이 운동을 시뮬레이션 (5.4 절 제)과 제약 (5.2 절에서 만든) 모든 관련 하중을 선택합니다. 이 나타나면 드롭 다운 메뉴에서 &#39;정적&#39;를 선택합니다. </li><li> 이 경우 &quot;.INP &#39;형식의 적절한 파일 형식으로 메시, 부하, 제약 및 재료 특성을 포함하여 수출 모델. </li><li> FE 분석 소프트웨어에로드 모델입니다. 만들기 및 작업 모듈을 사용하여 모델에 대한 작업을 실행합니다. </li><li> 결과 탭 및 시각화 메뉴에 등 응력, 변형, 변위에 대한 출력을 분석 (그림 4, 5). </li></ol> 턱 변형 / 변위 거리 6. 확인 <ol><li> 형질 전환 제브라 피쉬 : 3-6의 Tg (mcherry Col2a1aBAC)을 선택합니다. </li><li> 그들은 터치 그러나 그들의 마음은 여전히 ​​박동하는 응답이 중지 될 때까지 가볍게 0.02 %의 MS222와 애벌레를 마취시키다. </li><li> 산측면 미지근한 1 % LMP 아가로 오스의 커버 슬립에 (마취 상태에서) (Danieau의 솔루션에서 만든) 애벌레. </li><li> 머리 주위에서 아가로 오스를 제거하고 집게와 턱. </li><li> 정상 입의 움직임이 재개 될 때까지 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취를 제거하는 유충의 머리 (아무 MS222)와 신선한 Danieau의 솔루션을 플래시합니다. </li><li> 입의 움직임의 밝은 필드 고속 비디오를 촬영하는 동영상 캡처 소프트웨어를 사용합니다. 높은 프레임 속도 미소 기간 주위의 동영상을 취하거나, 충분한 조 개구의 다수의 사이클을 기록. </li><li> 최대 변위에 열려 턱을 보여 프레임을 선택합니다. 멕켈의 연골의 앞쪽 끝과 μm의에서 위턱 (사골 판의 끝) 사이의 거리를 측정한다. </li><li> 여러 물고기 애벌레의 평균 변위를 계산합니다. </li><li> 모델에서 변위 데이터의 압축을 풉니 다. (모델 변위 동작을 확인하기 위해 6.8에서 계산 된 평균 변위를 사용하여 <strong&gt; 그림 4). 이 모델은 순차적으로 재료의 특성과 근육의 부하를 변경하여 예상 실행 민감도 분석에서 벗어나면. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어. 도 3-5의 일부 데이터가 J.Biomech, 48 (12), 브 런트 등.에서 재 인쇄 된, 유한 요소 모델링으로 인해 턱 개발, 3112-22에서 근육 긴장의 손실 관절 모양과 세포 행동의 변화를 예측하고있다. 2015 년, 엘스 비어 (15)의 허가와 함께.

유한 요소 모델은 그 뼈 형성을받은 10 균주하에 골격 요소의 영역을 연관시키는뿐 아니라 연골 내 골화 관절 형태 형성 중에 변형 8,12,21 아래 영역을 매핑하는 데 사용되어왔다. 다른 연구도 공동 개발 (11, 12) 중 변경 사항을 복제하는 이론적 인 성장 모델을 적용 할 수 있었다. 여기에서 우리는 비교적 간단한 시스템, 제브라 피쉬 턱 (20)에 대한 FE 모델을 구축하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 여러 조직을 공부하는 등 CT 스캔 (22), 유전자 변형 라인의 공 촛점 이미징 또는 면역 염색 제브라 피쉬와 FE 모델, 원시 이미지를 수집하는 다른 방법을 달리 할 수 있습니다. 이 때문에, 연골 관련 근육 어태치먼트 포인트에 대한 직접적인 정보를 제공 할 수있다. 척추 동물 모델 중 제브라 피쉬는 유전 및 약리 조작에 특히 의무가 있습니다. 제브라 대한 FE 모델 생성두개 안면 연골 이제 공동 형태 형성에 생체 역학과 유전학 사이의 상호 작용의 추가 연구의 가능성을 열어. Fe 계 모델을 만드는 과정에 중요한 단계들이있다; 제 시스템의 정확한 삼차원 표현을 생성한다. 이 명확하게 경계를 정의하기 위해 충분히 높은 해상도의 영상을 필요로한다. 심지어 고해상도 이미지로 좋은면 하나가 일부 지역을 원활하게 할 수 있도록합니다. 다른 중요한 단계는 부하 올바른 제약의 정확한 위치를 정의한다. 불충분 구속 모델은 해결하기 위해 실패하고 부하의 잘못된 배치는 비정상적인 움직임의 원인이됩니다. 원시 데이터로부터 생성 된 표면 (그림 2B)를 메쉬하기 어려울 것 같은 원시 데이터의 일부 처리 (그림 2)이 필요하다. 우리는 가우시안 필터를 이용하여 데이터 (도 2c 필터링 </strong&gt;) 우리는 3 차원 표면으로 변환 될 수 깨끗한 윤곽선의 세트를 생성하기 위해서 곡선의 일부 수동 평활화를 수행 하였다. 너무 많은 스무딩는 많은 기능을 잃었다는 &quot;녹&quot;표면을 생성 할 수 있습니다. 올바른 요소 크기를 선택하면 요소 크기가 계산 집약적 너무 큰 메쉬를 만들어 너무 작은 선택하는 것과 반복적 인 과정이다. 그러나, 너무 큰 소자 크기를 선택하는 것은 구조체의 정확한 형상을 요점을 되풀이 실패 메쉬를 생성 할 것이다. 올바른 메쉬 턱의 정확한 형상을 포착하여 정확한 솔루션 수렴 최소 요소 크기를 가졌다 턱 변위를 이용하여 검증 하였다. 다른 연령과 종 실질적으로 다른 특성을 가질 것 같이 또한 더 정확한 변위를 모방하기 위해 재료의 특성 또는 부하 계산을 수정해야 할 수 있습니다. 항상 가상의 모델과에 제한이 있다는 것을 기억하는 것이 중요하다ssumptions는 FE 모델을 실행했다. 오직 하나의 샘플 수가 적은 모델링 때 개인 사이의 작은 변화 될 가능성이 있기 때문에 대표 샘플이 선택되도록하는 것이 중요하다. 단지 턱 요소 및 근육의 일부가 포함 된 바와 같이, 모델은 제브라 안면 근골격계 시스템의 간략화 된 버전이다. 따라서, 제약 모델링 턱 요소가 두개골의 나머지 부분과 연결하는 것 인 고려하여 배치 할 수 있었고, 모델은 인위적으로 &#39;공간&#39;에서 그것을 해결하기 위해 중앙에 제약을 받았습니다. 이 인공 제약은 자체 분석하지 않은 ceratohyal으로 모델에서 도출 해석에 영향을주지 않았다. 두개 안면 구조의 이상 포함은, 예를 들면 sternohyals와 연결된 연골 (23) 등 특히 다른 턱 개방 근육이 모델에 추가 할 수 있지만 제한은 유한 요소 소프트웨어에서 실행하는 데 더 큰 모델의 기능이 포함됩니다. S = &quot;jove_content는&quot;&gt; 또 다른 제한이 스프링 (8)의 삽입에 의해 달성 될 수 있지만, 우리는 인대 삽입을 모델화하지 않은 점이다. 이 경우 제 또 다른 가정은 모델이 선형으로 동작한다고 하였다. 모델에 균주의 크기는 게시 된 모델에 필적했고 균주가 3,500 이하 및 제약과 근육의 부착 점에서 떨어져 -5,000 μɛ 이상되는으로, 체외 세포 10, 24에 적용. 따라서, 모델의 해당 영역에서의 변형은 선형 모델에 대한 허용 가능한 범위 내에있는 것으로 간주 하였다. 연골 선형 재료로 완전히 동작하지 않고, 이전 모델 (25) 내의 유체의 거동 분석을 사용하도록 설정된 poroelastic 재료로 모델링되었다. 로컬 노드의 클러스터 사이에 근육 어태치먼트 포인트 확산하여 피크 힘을 분산하고보다 정확하게 특정 근육 대 근육 삽입을 나타내는 것이다. ENT는 &quot;&gt; FE의 사용은 구조에 작용하는 긴장과 스트레스의 평가를 할 수 있습니다.이 자주 정형 외과, 고생물학 및 최근 발생 생물학 등 많은 생명 과학 분야에서 사용되는 기법으로. 여기에 우리가 제브라 피쉬에 대한 FE에 구축하는 방법에 대해 설명합니다 아래턱. 향후이 모델은 미각을 포함, 전체 턱을보고하도록 확장 될 수있다. 유사 기술은 지금까지 대부분의 운동에 의해 연구되어왔다 물고기 척추 생체 역학을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

유한 요소 모델링 계산 계산 구조 (1)에 작용하는 스트레인의 크기와 위치를 매핑 할 수 공학 기술이다. 모델은 &quot;유한 요소&quot;의 메쉬로 표시되는 3 차원 구조로 구성하고, 분석의 최종 결과는 메쉬, 기계의 크기와 위치의 소자의 구조와 개수를 포함한 다수의 인자에 의해 지배되고 하중과 재료 특성. 재료 특성은 부하의 특정 유형에 따라 재료의 행동의 특정 측면을 설명; 샘플 연신시 포아송 비는 길이 재료의 폭에 비례 한 감소를 설명하면서, 영률 (E)은 재료의 탄성을 설명한다. FE 모델링 &#39;구조에 대한 계정에 고유 한 입력 데이터를 고려하여 모델의 변위, 응력, 변형 및 압력 작용 등 다양한 변수를 계산하기 위해 사용될 수있다;의 모양, 위치 및 하중의 크기와 특정 재료의 특성. FE 모델링 널리 공학 2 점차 (3) 정형 외과 및 생물학적 응용 프로그램 (4)에 사용됩니다. 개발 역학적 힘 세포 반응 5-8를 활성화하는 많은 세포에서 자극의 역할을하는 것으로 알려져있다하고 기관계 개발 내의 상대 위치 및 기계적 자극의 크기를 모두 예측하기 위해 유용하지만, 현재 FE 모델링은 거의 사용되고 제브라 피쉬의 개발. 두 연골 및 뼈 mechanosensitive 물질로 밝혀졌다. 예를 들어, 시험 관내 압축 장력 9 골 형성에 필요한 것으로 밝혀졌다 반면 연골 경로를 활성화하는 것으로 밝혀졌다. FE 분석 (FEA)을 기용 뼈 동안 골격 요소에 작용을 포함하여, 생물학적 시료에 작용하는 균주를 모델로 활용하고있다rmation 10. 이 이론 생체 역학적 힘 (11, 12)에 노출 된 경우와 병아리 무릎 관절 형태 형성 8시 본 균주의 패턴을 표시 한 후 다른 개발 응용 프로그램은 관절의 모양을 예측하는 사용을 포함한다. 이 프로토콜은 조직 현상의 메커니즘을 이해하는 도면으로 공 촛점 이미지로부터 3 차원 표면 메시와 유한 요소 모델을 생성하는 경험을 공유 할 목적으로한다. 우리는 또한 생체 내에서 실제 공동 변위 정보를 캡처 불구하고 FE 모델의 유효성을 검사하는 방법을 보여줍니다. 우리는 모형으로 제브라 조를 사용하지만 동일한 기술 근골격계의 구조에 3D 정보가 촛점 또는 광자 영상화함으로써 얻어 질 수있는 어떤 작은 생물학적 시스템에서 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II 콜라겐 항체 - 모든 연골을 염색</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>개발 연구 하이브리도마 은행</td><td>A4.1025</td><td>골격 마이소인 항체 - 모든 골격근을 표시합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>시그마&nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>제브라피쉬</td></tr><tr><td>MS222 (에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트)</td> <td>시그마</td><td>E10521-10G</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>샘플 투과변환</td></tr><tr><td>Dylight 488 마우스 IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>보조 항체</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG Thermofisher</td><td>&nbsp;</td><td>84541</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>SP8/SP5 또는 SPE 컨포칼</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>이미징용&nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica 캡처 소프트웨어</td><td>Leica</td><td></td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Aviso(버전 7.0.0)</td><td>FEI 시각화 Science Group</td><td></td><td>3D 이미지 분석 소프트웨어(섹션 2)</td></tr><tr><td>Hyperworks 패키지의 하이퍼메시 부분(버전 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE 모델 생성 소프트웨어(섹션 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus(버전 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE 분석 소프트웨어(섹션 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

골격 형태 형성은 발달 과정에서 엄격하게 조절된 세포 행동을 통해 발생하며, 많은 세포 유형이 기계적 변형에 반응하여 행동을 변경합니다. 골격 관절은 동적 기계적 하중을 받습니다. 유한 요소 해석(FEA)은 재료나 구조가 기계적 입력에 어떻게 반응할지 예측할 수 있는 엔지니어링에서 자주 사용되는 계산 방법입니다. 전체 시스템(이 경우 제브라피시 턱 골격)을 더 작은 '유한 요소'의 메쉬로 분할함으로써 FEA를 사용하여 외부 하중에 대한 구조의 기계적 응답을 계산할 수 있습니다. 결과는 최대 및 최소 주 변형률의 위치를 보여주는 '히트 맵'을 포함하여 여러 가지 방법으로 시각화할 수 있습니다(양수 주 변형률은 장력을 나타내고 음수는 압축을 나타냅니다). 최대값과 최소값은 가장 큰 변형률과 가장 작은 변형률을 나타냅니다. 이는 턱의 어느 부위를 식별하는 데 사용할 수 있으며, 따라서 어떤 세포가 턱 이동 중에 특히 높은 인장 또는 압축 하중을 받을 가능성이 있는지 확인하는 데 사용할 수 있으며, 따라서 기계적 변형과 세포 거동 사이의 관계를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 아래턱을 실제 예로 사용하여 근골격계의 컨포칼 이미지 데이터에서 유한 요소 모델을 생성하는 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 1) 근골격계 구성 요소의 염색, 2) 근골격계 구성 요소의 이미징, 3) 3차원(3D) 표면 구축, 4) 유한 요소의 메쉬 생성, 5) FEA 해결 및 마지막으로 6) 물고기 턱의 움직임에서 볼 수 있는 실제 변위와 비교하여 결과를 검증하는 일련의 단계를 통해 독자를 안내합니다.

근육 (도 1a)과 연골 (도 1b) 또는 트랜스 제닉 리포터 촬상 면역 염색 (도 1C)는 관련된 근육과 함께 턱의 3 차원 구조를 시각화 할 수있다. 고해상도로 촬상하여 턱의 3 차원 형상 (도 2)의 위치 및 부하의 위치 (도 3) 모두를 캡처하는 모델을 구축 할 수 있었다. 고속 비디오 캡처를 통해 본 생체 변위 (도 4)에서 이용 우리 모델의 운동 범위는 실제 범위 내에있는 것을 확인 하였다. 런 번 FE 모델은 응력 (도 5a), 최소 및 최대 주 변형률 (- K도 5b)와 같은 데이터의 범위를 표시 할 수있다. 이러한 결과는 세 희미하다<html> 관련보기 (그림 5 층, 5 세대, 5J, 5K)와 디지털 (그림 5E 구분 &#39;, 5E&#39;를 &#39;5I&#39;, 5I을 얻기 위해 회전하므로 모델은 세부의 미세 패턴 (그림 5E, 5I)를 참조하기 위해 확대 될 수 ensional &#39;&#39;) 표시하는 방법을 모델 전반에 걸쳐 스트레스, 변형 또는 압력 변화의 패턴입니다. 이 모델에서 정량적 데이터를 추출하는 것도 가능하다 (도시하지 않음). 모델을 검증하고 형태를 가장 정확한 재료 특성, 부하를 사용하여 메쉬하여 FE 모델 개발의 기간 동안 세포에 의해 발생되는 기계적인 환경의 최선의 추정치를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 모델의 결과를 직접 셀룰러 동작 및 유전자 발현 (20)의 변화에 비교 될 수있다. <html> 1 다시 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 5 DPF의 제브라 피쉬 아래턱의 근골격계 요소의 대표 이미지 5dpf 유충의 아래턱의 대표 공 초점 스택은 모든 모든 골격 미오신 얼룩 A4.1025에 대한 면역 염색 상단으로 전방 (A) (B)로 표시 유전자 변형 기자의 col2a1을 표현하는 살아있는 유충에서 모든 연골 (C) 스택을 표시 타입 II 콜라겐에 대한 면역 염색 : GFP 느린 근육 (녹색) : mCherry은 연골 (적색)과 smyhc을 표시. IA : intermandibularis 전방, 수소 이온 지수 (pH) : 각도기 hyoideus, AM : 내전 mandibulae, HI : hyoideus 열등, HI : hyoideus 우수한, CH : sternohyoideus, MC : 멕켈의 연골, PQ : Palatoquadrate, CH :. ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오 더 큰 버전 이 그림의.</a> &quot;fo를하기 : 유지-together.within 페이지를 =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> 그림 2 : 공 초점 데이터로부터 3D 표면의 세대 공동 영역의 높은 배율을 가진 제브라 피쉬 아래턱을위한 3D 표면에 공 초점 데이터의 전환을 보여주는 이미지.. (A) 원료 촛점 데이터; (B) 가우시안 필터 적용 후의 데이터 세트; (C) 필터링 개요; (D) 3D 표면. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> 그림 3 : 제약 조건과 힘의 벡터를 보여주는 대표적인 메시 (A) 입 폐쇄와에 대한 5 DPF의 애벌레에 대한 대표 메쉬.(B)의 입 구. 하얀 점은 모델에 대한 구속을 표시하고있는 치수 (예컨대, X 및 Y 또는 X, Y 및 Z). 백색 라인은 흰색 화살표로 표시된 근력의 벡터를 근육의 위치를 ​​나타낸다. 레드 연골을 보여주고 노란색 영역 간. 이 그림은 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판 보충 자료에서 수정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> 그림 4 :. 감도 테스트 다른 연골과 영역 간 영의 계수에 대한 5dpf 제브라 피쉬에 턱 변위를 시뮬레이션 FE-모델입니다. 턱에 표시됩니다 (μm의 폐쇄 개방) 변위를 턱; 컬러 키를 사용하여 기록했다. 각 모델 (A - L)은 연골의 다른 조합 (C = 1.1, 3.1, 6.1 MPa의) 또는 영역 간 (0.25 I = 0.5, 0.75, 또는 1 MPa의) 속성이 있습니다. 가로 검은 색 화살표 (수직 검은 색 화살표로 표시)를 멕켈의 연골의 끝에서 턱 변위의 가치를 강조한다. 남성과 N 애벌레를 보여주는 최소한의 DPF (5)의 동영상에서 스틸은, 즉, 턱 (M) 폐쇄 및 최대, 즉, 턱 겹쳐 두와 (N) 완전 개방은 (O) - O에 흰색 라인 (43 μm의의) 변위를 나타냅니다. 변위가 활어에서 본 0.25 (A) 최고의 경기의 영역 간 1.1이 경우 상대 연골 특성 (O). AL이 그림의 패널은 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 이온. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> 그림 5 : FE 모델에서 대표적인 데이터 유충 DPF 5에 적용된 모든 근육의 FE 모델 시뮬레이션 (A - C).. (A) 폰 미제스 (EMaxmin) (B) 최소 주 변형률 (E 민. P, μɛ) (C) 최대 주 변형률 (E 최대. P., μɛ). 턱 개방시 최대 및 최소 주 균주의 FE 모델 시뮬레이션. (D - K) : 최대 주 변형률 (. E 최대 P., μɛ) (D) 복부 턱보기 및 (E) 복부 공동보기 (E)에서이 멕켈의 연골을 통해 근위 - 말단 부분의 위치를 보여줍니다 관절과 영역 간 (E &#39;) 및 (E&#39; &#39;)에서 각각. (F) : 가로보기를 턱. (G) : 측면 공동 볼 수 있습니다. (H - K) : 최소 주 변형률 (. E 최소 P, μɛ) (H) 복부 턱보기 (I) 복부 공동보기. (I)는 멕켈의 연골 관절을 통해 근위 - 말단 부분의 위치를 보여줍니다 (I &#39;) 및 (I&#39;)는 각각 (J)의 영역 간 : 측면 턱보기를. (K) : 측면 공동 볼 수 있습니다. 이 수치는 이전에 브 런트 등. 15 년에 출판되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 근육 섬유의 개수 </td><td> 근육 섬유의 면적 (㎛의 2) </td><td> 근육 그룹의 면적 (㎛의2) </td><td> 힘 (N) </td></tr><tr><td> 5 DPF intermandibularis 전방 </td><td> (5) </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF 끄는 hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 DPF 내전근 mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> 1 번 테이블: 근육 정량화. 40 윈 / μm의 2 (참조 17에서 찍은 단위 면적당 값)을 사용하여 DPF 5에서 Intermandibularis 전방, 내전근 Mandibulae와 각도기 Hyoideus 평균 근육의 힘을 계산. (Lorga 등., 2011) (N = 3).

Finite Element Analysis는 하중을 받는 구조물의 기계적 성능을 조사하는 데 자주 사용되는 도구입니다. 여기에서 우리는 제브라피시 턱의 생체 역학을 모델링하는 데 그 사용을 적용합니다.

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

이 모델링 기법의 전반적인 목표는 발달 중인 제브라피시 턱이 겪는 기계적 환경을 시뮬레이션하는 것입니다. 이 방법은 기계적 하중 패턴이 시간에 따라 어떻게 변화하는지, 그리고 이러한 하중이 세포 행동을 어떻게 자극하는지와 같이 근골격계 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 기계적 환경의 맥락에서 유전자 발현 패턴과 세포 행동의 변화를 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 골격 발달에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 고등 척추동물의 골격 요소나 심혈관 시스템과 같이 기계적 하중을 받는 다른 모든 생물학적 구조에도 적용될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법이 생소한 개인은 용어와 소프트웨어가 공학적 배경지식을 전제로 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 골격 요소의 형태를 시각화하고, 근육을 정량화하며, 근육 부착 지점을 정확하게 확인하려면, 골격 마이오신(myosin)과 type II 콜라겐에 대해 적절한 연령의 물고기를 면역 염색하십시오. 먼저, 물고기 치어를 4% paraformaldehyde와 PBS에 1시간 동안 고정합니다.그런 다음, PBT로 두 번 세척하여 고정액을 제거합니다. 이어서 유충을 50% methanol과 PBT 혼합액에서 5분 동안 탈수시킨 후, 100% methanol에서 5분 동안 추가로 탈수시킵니다. 이후 유충은 필요할 때까지 100% methanol에 보관할 수 있습니다.필요한 경우, 50% methanol 및 PBT에서 5분 동안 유충을 재수화합니다. 그 다음, PBT로 5분 동안 세척합니다. 이제 얼음 위에서 0.25% trypsin 및 PBT를 사용하여 5~6분 동안 유충을 투과화합니다.그 다음, PBT로 5분 동안 세척하고 PBT 세척을 3회 더 반복합니다. 항체를 처리하기 전, 5% serum과 PBT에서 유충을 2~3시간 동안 블로킹합니다. 그 후, 5% serum과 PBT가 포함된 rabbit anti-type II collagen 및 mouse anti-myosin 항체의 권장 희석액에서 유충을 배양합니다.이 배양 과정을 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 수행합니다. 1차 항체를 처리한 후, PBT로 유충을 총 6회 세척하며 회당 15분씩 세척합니다. PBT 세척 후, 5% serum과 PBT 차단액을 처리하여 1~2시간 동안 블로킹합니다.이제 2차 항체를 처리하며, 이후 준비 과정은 가능한 한 암소에서 진행합니다. 5% serum 및 PBT에 희석된 형광 표지 항-마우스 및 항-토끼 2차 항체를 사용하십시오. 2차 항체 처리 후, 유충을 PBT로 6회 세척하며 각 세척 시간은 10분으로 합니다.설명된 대로 염색되었거나 형광 태그를 발현하는 모든 유충은 다음과 같이 공초점 현미경을 사용하여 이미징할 수 있습니다. 10x 대물렌즈와 약 2.5x 디지털 줌을 사용하여 관심 영역의 공초점 이미지 스택을 획득합니다. 488-nanometer 레이저와 561-nanometer 레이저를 사용하여 녹색 및 적색 채널을 여기시킵니다.그런 다음, 3회 라인 평균(line average)을 적용하여 1.3 µm의 z-평면 간격으로 512-정사각형 픽셀 이미지를 촬영합니다. 약 100개의 z-섹션이 스택을 채우게 됩니다. 데이터를 TIFF 이미지 스택으로 내보냅니다.TIFF 이미지 스택을 열고 적절한 소프트웨어에서 모든 채널을 확인합니다. 연골 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, orthoslice를 선택한 후 create를 누릅니다. 그런 다음, 연골 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Image Processing, Smoothing And Denoising를 선택한 다음, 이미지 필터를 선택하고 smoothing Gaussian을 활성화합니다.프로젝트 뷰에서 필터링된 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 분할(image segmentation)을 선택한 다음, 새 라벨 편집(edit new label)을 선택합니다. 연골 및 관절과 같이 각 재료에 맞는 새 라벨을 생성합니다. 그런 다음 모든 슬라이스(all slices) 토글을 켠 상태에서 마술봉 도구를 사용하여 이미지의 연골 영역을 선택하고, 브러시 도구를 사용하여 외곽선의 노이즈를 제거합니다.다음으로, 브러시 도구를 사용하여 관절 부위를 선택한 후 이를 관절 구성 요소로 지정하고, 관절 전체에 걸쳐 이 작업을 반복합니다. 여러 슬라이스를 한 번에 매끄럽게 처리하려면 상단 메뉴에서 Segmentation을 선택하고 Smooth labels를 선택하십시오. 그런 다음 구성 요소의 3D 표면 렌더링을 생성하려면 이미지 위에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Generate Surface를 선택하십시오.이제 렌더링된 표면을 클릭하고, 메싱 소프트웨어에서 사용할 수 있도록 데이터를 HMASCII 파일로 저장하십시오. 3D 메시 생성은 우수한 모델을 만드는 데 있어 매우 중요한 단계입니다. 모델링하려는 구조의 실제 형상을 나타내는 메시를 구현하면서도, 각도가 너무 작거나 큰 요소와 같이 문제가 될 수 있는 요소가 포함될 정도로 세부 사항이 과도해지지 않도록 적절한 균형을 맞추어야 합니다.메쉬를 생성하려면 3D 모델을 기능이 적합한 소프트웨어 패키지로 가져옵니다. 연골 및 관절 표면의 2차원 메쉬를 생성하려면 2D 메뉴의 shrinkwrap 도구를 사용하십시오. 요소 크기는 1.5에서 2.5 사이로 선택합니다.3D 메시 최적화를 수행하기 위해 다양한 크기의 표면 메시 범위를 생성할 수 있습니다. 관절면과 연골면 사이의 메시가 연속적이 되도록 하려면 경계 상의 모든 요소가 공통 노드를 공유해야 합니다. 이를 위해 관절의 내면을 제거하여 중공 튜브 형태로 남겨둡니다.F2 기능 키를 사용하여 요소 삭제(Delete Elements) 메뉴의 바로가기에 접속하십시오. 삭제할 요소를 선택하십시오. 경계 노드를 조정하여 연골 표면에 맞추십시오.F2, F3, F6 기능 키를 조합하여 각각 노드 삭제, 노드 이동 및 새 요소 생성을 수행합니다. 마지막으로, collector organize components 메뉴를 사용하여 관절 부위의 연골 표면을 복제합니다. F2 기능 키를 사용하여 관절 이외의 모든 요소를 삭제합니다.그 후, Check elements 패널로 이동하여 품질 검사를 수행합니다. 메쉬 내에 중복된 요소, 삽입 및 침투가 있는지 확인하십시오. 해당 사항이 발견되면 Tools 탭을 사용하여 이를 수정하십시오.모델 트리 옵션에 있는 유틸리티 탭을 사용하여 이면각을 확인합니다. 서로 다른 요소 크기의 2D 표면 메시로부터 3D 메시를 생성하려면 Tetramesh 도구를 사용하십시오. 다양한 메시 크기를 비교하고, 추가 시뮬레이션 후 수렴하며 형상 정의를 저해하지 않는 가장 작은 메시 크기의 FE 모델을 선택하십시오.다음으로, 거리 도구(Distance tool)를 사용하여 턱 모델이 실제 크기와 일치하도록 메쉬를 변형합니다. 병합된 모델을 내보내거나 타이(tie) 기능을 사용하여 모델 내의 연골 및 관절 구성 요소가 서로 연결되어 있는지 확인하십시오. 그다음, 턱 기능을 시뮬레이션하기 위해 유한요소(FE) 모델에 하중, 구속 조건 및 재료 특성을 적용합니다.라벨링된 공초점 스택을 가이드로 사용하여 근육을 정의합니다. 먼저 근육 부착 지점에 해당하는 노드를 할당합니다. 그런 다음 노드 사이에 벡터를 생성하여 각 근육의 기점과 정지점을 나타냅니다.모든 근육의 정의가 완료되면, history loadcollector를 생성하고 각 근육에 Cload를 적용합니다. 뉴턴(newtons) 단위로 크기를 지정하고 관련 벡터를 할당합니다. 그런 다음 문헌에서 결정된 바에 따라 적절한 탄성 등방성 재료 특성을 할당합니다.다음으로 경계 하중 수집기(boundary loadcollector)를 생성하고, 모델에 몇 가지 초기 구속 조건을 적용합니다. 구속할 노드들을 선택하고, 해당 노드들로 정의된 근육의 자연스러운 운동 범위와 유사한 자유도 계수를 선택합니다. 이제 시뮬레이션할 각 운동 유형에 대해 하중 단계(load step)를 생성합니다.분석 메뉴에서 지정된 움직임을 시뮬레이션하는 데 관련된 모든 하중과 구속 조건을 선택하십시오. 그런 다음, 드롭다운 메뉴에서 정적(static)을 선택하십시오. 준비가 되면 메쉬, 하중, 구속 조건 및 재료 특성을 포함하여 모델을 적절한 파일 형식으로 내보내십시오.이 경우, INP 형식을 선택합니다. 그런 다음 FE 해석 소프트웨어에 모델을 로드합니다. 해당 소프트웨어에서 모델에 대한 작업을 생성 및 실행하고, 응력, 변형률, 변위 등의 출력을 분석합니다.3~6마리의 형질전환 제브라피시 치어를 선택하고, 촉각에 반응하지 않으면서 심장은 여전히 뛰고 있을 때까지 0.02% MS-222로 가볍게 마취합니다. 그런 다음, Danieau 용액에 포함된 미지근한 1% 저융점 아가로스 내의 커버슬립 위에 치어를 측면으로 고정합니다. 이어서, 핀셋을 사용하여 머리와 턱 주변의 아가로스를 조심스럽게 제거합니다.그다음 Pasteur 피펫을 사용하여 신선한 Danieau 용액을 유충의 머리 부분에 흘려보내 마취제를 제거합니다. 입의 정상적인 움직임이 회복될 때까지 이 과정을 반복합니다. 이제 영상 캡처 소프트웨어를 사용하여 입 움직임의 형광 고속 영상을 촬영합니다.여러 차례의 턱 개구 주기를 기록할 수 있도록 필요한 시간 동안 최고 프레임 속도로 촬영하십시오. 이후 턱의 최대 변위(displacement)를 분석합니다. 턱이 가장 넓게 벌어진 프레임을 선택하고, Meckel's cartilage의 전단 끝부분과 상악 사이의 거리를 측정하십시오.상악점은 사골판의 끝부분에 해당합니다. 근육과 연골에 대한 면역염색 또는 형질전환 리포터의 이미징을 통해 턱의 3D 구조와 관련 근육계를 시각화할 수 있습니다. 고해상도 이미징을 통해 턱의 3차원적 형태를 포착하는 모델을 구축할 수 있었습니다.이 모델은 근육과 연골의 공초점 이미지에서 도출된 배치와 크기의 하중을 통합합니다. 이 모델을 바탕으로 다양한 범위의 재료 특성을 테스트했습니다. 고속 비디오 캡처를 통해 관찰된 생체 내 변위를 활용하여, 해당 가동 범위를 가장 잘 재현하는 하나의 모델을 선정했습니다.가장 정확한 재료 특성, 하중 및 메쉬 형상 데이터를 사용하여, FE 모델을 통해 해당 기간 동안 겪게 되는 기계적 환경의 최적 추정치를 탐색하였습니다. 예를 들어, 응력의 크기를 측정하였습니다. 이 모델은 확대하여 패턴의 세부 사항을 확인할 수 있으며, 디지털 단면으로 분석하여 모든 차원의 세부 정보를 관찰할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 기계적 하중을 받는 생물학적 구조의 생리학적으로 정확한 3D 모델을 구축하기 위해 공초점 이미징을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때, 이것이 선형 탄성 모델이며 연골이 완전히 선형 재료로 작동하지는 않는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 투과성과 같은 다른 재료 특성을 통합할 수 있지만, 이 경우 메쉬에 추가적인 수정이 필요할 수 있습니다.

building-finite-element-models-to-investigate-zebrafish-jaw

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

zebrafish 턱의 수염은 ectodermal, mesodermal 및 신경 크레스트 파생 상품을 포함 외피의 감각 기관이다. 중요한 것은 어른 바벌은 근위 절단 후 재생하실 수 있습니다. 이 동영상은 상악 바벌 개발을 소개하고 바벌의 표본의 수집, 퍼가기 및 다운 스트림 이미지 다음 재생을 유도하는 외과 프로토콜을 보여줍니다.

Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

제브라 피쉬 배아 발달 생물학 연구를위한 훌륭한 모델입니다. 배아 동안, 제브라 피쉬의 샘플 관찰 및 분석을위한 세 가지 차원의 과제를 제시하는 노른자 대량으로 개발할 수 있습니다. 이 프로토콜은 현장 (WISH) 스테인드 제브라 피쉬 배아 표본 전체 마운트의 2 차원 평면 장착 준비를 만드는 방법에 대해 설명합니다.

전체 마운트하여 제브라 피쉬 배아 시편 스테인드 관찰 및 분석을위한 평면 마운트 준비<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.

Zebrafish 치명적인 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동

여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.

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Alcian Blue로 염색한 Zebrafish 두개안면 조직의 해부

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