챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

이 절차의 전반적인 목표는 객담 및 항생제에 대한 반응으로 생물막의 변화를 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 연구자들이 가래의 존재에 의해 박테리아 생물막에 대한 다양한 항생제의 효능이 어떻게 영향을 받을 수 있는지와 같은 주요 질문을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법론의 주요 이점은 개인이 다양한 요인에 대응하여 생물막에서 발생하는 변화를 볼 수 있다는 것입니다.

실험을 시작하려면 이전에 얻은 가래 샘플의 부피를 기록합니다. 인산염 완충 식염수 또는 PBS를 추가하고 샘플 부피의 2배를 추가합니다. 다음으로, 전사 피펫을 사용하여 샘플을 완전히 혼합합니다.

샘플을 가장 높은 설정에서 1분 동안 소용돌이하여 완전히 혼합합니다. 혼합물 1ml를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 그런 다음 튜브를 스핀다운합니다.

원심분리 후 상층액을 저장하고 펠릿을 버립니다. 필터는 0.22미크론 필터를 통해 상층액을 살균하고 깨끗한 미세원심분리기 튜브에 수집합니다. 나중에 사용할 수 있도록 가래 상등액을 섭씨 80도에서 보관하십시오.

40마이크로리터의 미리 준비된 배양액을 4밀리리터의 신선한 루리아 육수 또는 LB 배지에 넣고 박테리아를 성장시켜 600나노미터에서 0.55의 광학 밀도를 가진 배양액을 얻습니다. 다음으로, 0.5 OD 배양 100 마이크로 리터를 LB에서 준비된 10 % 가래 여과액 400 마이크로 리터로 희석한다. 200마이크로리터의 희석액을 사용하여 슬라이드 챔버의 우물에 씨를 뿌립니다. 박테리아가 섭씨 37도에서 흔들리지 않고 4시간 동안 부착하도록 합니다.

4시간 후 매체를 제거하고 1X fresh LB로 바이오필름을 부드럽게 세척합니다. 나머지 매체를 200마이크로리터의 새 LB로 교체합니다. 생물막이 흔들리지 않고 섭씨 37도에서 자라도록 합니다. 생물막이 현미경 검사를 위해 준비될 때까지 세척하지 않고 12시간마다 배지를 교체하십시오. 부착된 박테리아를 방해하지 않도록 슬라이드를 부드럽게 세척하는 것이 매우 중요합니다.

성장한 후 챔버 웰에서 매체를 제거하고 300마이크로리터의 멸균 PBS로 각 챔버를 두 번 부드럽게 세척합니다. 다음으로, 생물막 염색 혼합물을 준비하기 위해 생존도 키트에 제공된 각 염료 1마이크로리터를 필요한 용액 1ml에 첨가하고 용액을 혼합합니다. 최적의 염료량과 염색 시간은 각 유기체에 대해 경험적으로 결정됩니다.

200마이크로리터의 염색 혼합물을 챔버 커버 유리의 각 웰에 추가합니다. 커버 유리를 배양합니다. 배양 후 챔버에서 염색 혼합물을 제거하고 300마이크로리터의 멸균 PBS로 각 웰을 세척합니다.

PBS를 새 용지로 교체합니다. 마지막으로 컨포칼 현미경을 통한 시각화를 진행합니다. Burkholderia cepacia complex(BCC 임상 분리물)의 대표적인 이미지는 배지만 사용하거나 10%의 가래 여과액이 있는 상태에서 챔버 커버 유리에서 48시간 동안 성장한 후 이들의 존재가 생물막의 구조를 변화시킬 수 있음을 보여줍니다.

이미지는 Comstat 소프트웨어로 분석하여 10%의 가래로 처리했을 때 증가된 생물막의 평균 두께를 포함한 주요 생물막 매개변수를 얻었습니다. 생물막 성장에 대한 다양한 요인의 효과를 평가하기 위해 임상 분리물을 배지에서만 또는 가래와 함께 성장시키고 항생제를 투여하거나 사용하지 않고 처리했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 챔버 커버 유리에서 생물막을 형성 및 처리하는 방법과 염색 및 컨포칼 분석을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.