Name: Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 제브라피쉬에서 간성 스테로이드 생성 세포를 검출하는 전마운트 효소 활성 분석법을 통해 내분비선 발달 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 유전자 및 화학 스크리닝에 강력한 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S843 : LI1과의 Tg (EGFP kdrl) : 우리는 Tg가 (GFP wt1b)를 증여에 대한 교수 크리스토프 Englert 교수 디디에 Stainier 감사합니다 균주 각각과의 Tg (kdrl을 : mCherry) 제공하는 대만 Zebrafish의 핵심 시설 C15- 카르을. 이 연구는 102-, 과학 기술 (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 대만의 정부에서 보조금에 의해 지원되었다 2321-B-400-018).

윤리 정책 : 제브라 피쉬의 모든 실험 절차는 동해 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (IRB 승인 NO 101-12합니다.) 및 승인 된 지침에 따라 수행 하였다. 3β-HSD 효소 활성 염색 1. 재고 솔루션 <ol><li> 트랜스 dehydroandrosterone [디메틸 술폭 사이드 (DMSO)에 10 ㎎ / ㎖]를 준비한다. </li><li> β - 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 수화물 (0.1 M 인산염 완충액에서 1.2 ㎎ / ㎖, pH를 7.2)을 준비한다. </li><li> 니코틴 준비 (비타민 B3,을 50mg / ㎖의 H 2 O). </li><li> 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 (50 ㎎ / ㎖ 70 % 디메틸 포름 아미드)를 준비한다. </li><li> -20 ° C에서의 미세 원심 분리 튜브에 나누어 저장하는 모든 이러한 구성 요소. 참고 : 우리의 경험, 반복 동결 모든 상기 용액의 분취 량의 해동에서 3β-HSD 활동 염색의 강도에 영향을주지 않습니다. </li></ol> 2. W홀 마운트 3β-HSD 활동 염색 참고 : 3β-HSD 효소 활성이 빠르면 28시간 게시물 수정 (HPF)와 같은 경우 배양 hsd3b1 2,7의 mRNA 발현의 발병과 일관성이 28.5 ° C,에서 제브라 피쉬 배아에서 감지 할 수 있습니다. 이 연구에서 전체 마운트 3β-HSD 활성 염색 프로토콜은 전술 한 방법 (8)에 기초하고 최대 7 일 후 시비 9 현상 제브라 성공적인 것으로 측정되었다. interrenal steroidogenic 조직의 혈관 미세 환경을 분석, 3β-HSD 활동 염색을 전체 마운트하는 것은 이러한 Tg는 같은 내피 세포 고유의 형광을 발현하는 형질 전환 라인 (kdrl : EGFP)에 적용해야합니다은 : C15- 카르 (15) (14)과의 Tg (mCherry kdrl를) S843 . 제브라 신장 개발을 고려 interrenal steroidogenic 조직을 분석, 3β-HSD 활성 염색 될 수 애플리LI1 물고기 (16), 사구체 및 pronephric 세관의 형성이 묘사되어 Tg가 (GFP wt1b)에 에디션. <ol><li> 색소 형성을 억제하기 위해, 12, 24 HPF 사이의 단계에서 시작, 달걀 물에 0.03 %의 페닐 티오 요소 (Phenylthiourea)에서 (탈 이온수에 0.06 ㎎ / ℓ 암초 소금)을 배양하여 개발 제브라 피쉬를 취급합니다. </li><li> 밤새 실온 (RT) 또는 (B) 2 % PFAT에서 1 시간 동안 0.1 % 트윈 20 (PFAT)으로 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (A) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에 dechorionated 배아 또는 유충 해결 4 °의 C 또는 실온에서 4 시간 뒤에 4 ° C에서 2 시간에 대해. 주의 : PFA는 흡입 및 피부 접촉에 의해 독성. 그것은 피부, 점막, 눈, 상부 호흡기에 파괴. </li><li> PBS는 RT에서 0.1 % 트윈 20 (PBST)가 보충 10 분간 배아 4X 씻는다. 주 : 세탁 솔루션을 변경하면서 샘플을 건조하지에 중요합니다. </li><li> 갓 역을 준비반응 전에 ining 용액 (표 1). 준비, 소용돌이, 분리 튜브에서 원심 분리 부 A 및 B. 참고 : 바로 하나의 튜브에 모든 구성 요소를 추가하면 심한 침전을 일으킬 것입니다. </li><li> 부분 (B)의 전체 용액 A 부분의 전체 용액을 첨가 염색 용액을 제조 잘 혼합하고 즉시 고정 세정 배아를 포함하는 각 미세 원심 분리 튜브에 1 ㎖에 배포한다. </li><li> 회 전자 또는 실온에서 진탕 부드러운위한 락 플랫폼 중 하나에 빛과 장소에서 그들을 보호하기 위해 알루미늄 호일로의 microfuge 튜브를 감싸. </li><li> 경험적으로 현미경을 통해 발색 신호를 모니터링함으로써, 반응 시간을 결정한다. 시간이 지남에 따라 개발한다 약간의 침전; 그러나, 이들은 반응 과정을 방해하지 않을 것이다. 참고 : 배아가 4 시간 동안 25 ° C에서 28 HPF, 염색 고정을 위해 interrenal 조직에서 명확한 신호를 생성한다. </li><li> PBST에서 10 분 동안 4 배를 세척하여 반응을 정지. 나는F 더 이상 면역 조직 화학 (IHC) 분석이 필요하지 않습니다, 이후 수정 실온에서 60 분 동안 4 % PFAT와 스테인드 배아를. 그렇지 않으면 더 사용할 때까지 4 ° C에서 세척 된 배아를 저장합니다. </li><li> 전체 마운트 현미경 들어, PBS에 50 % 글리세롤로, 염색 후 고정, 세척 배아를 취소 슬라이드에이 위를 향하도록 몸 윗면로 방향을, 밝은 필드 조명 아래 직립 현미경을 이용하여 관찰한다. 참고 : 권장 interrenal 조직 형태의 고해상도 이미지의 3β-HSD 활동 염색 및 deyolked 배아의 분석을 평면 마운트 확인하십시오. interrenal steroidogenic 조직이 바로 난황 위에 위치로, interrenal 조직의 복부 평면 마운트 분석은 interrenal 형태 (17)의 직접적이고 명확한 관찰 할 수 있습니다. </li></ol> 3β-HSD 활동 묻은 태아의 3 IHC 분석 주 : steroi의 혈관 미세 환경 분석을위한dogenic 조직은 형질 전환 내피 특정 형광 기자와 3β-HSD 활동 묻은 배아는 vibratome 절편 이후 IHC 분석 12, 18, 20, 22를 횡단하기 위해 실시한다. <ol><li> 후 고정 <ol><li> 4 ° C에서 1 시간 동안 1 % 트리톤 X-100 보충 2 % PFA와 3β-HSD 활동 염색 및 세척 배아를 포스트 - 수정 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 PBS에서 10 분 동안 배를 씻어 (PBSTx) RT에서. </li></ol></li><li> 퍼가기 <ol><li> 4 %가 95 ° C, 4-8 ℃에서의 microfuge 튜브로 나누어지는 및 매장에서 PBS에서 아가로 오스를 용해하여 아가 로스 저 융점 준비합니다. </li><li> 10 분 동안 70 ° C에서 아가로 오스 4 % 저 융점의 나누어지는 용융 한 후 47 ° C에서 나누어지는을 유지합니다. 각각의 배아를 포함 용융 4 % 금형 역할을하는 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브의 분리 된 모자 아가로 오스 저 융점, 고체까지 냉각 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> Vibratome 단면 <ol><li> 건조 페이지에 종이 테이프의 조각 스틱vibratome의 latform. </li><li> 면도날에 의해 금형에서 경화 아가로 오스 블록을 제거합니다. 플랫폼에 종이 테이프에 순간 접착제를 적용하고 위를 향 샘플의 앞쪽면, 종이 테이프에 아가로 오스 블록을 수정합니다. 각각 약 4mm 상부 및 하부면 양쪽에 8mm로, 사다리꼴 프리즘 형상 아가 블록 낸다. </li><li> 스포이드를 사용하여 0.5 % 트리톤 X-100 (0.5 % PBSTx) 보충 차가운 PBS로 샘플을 함유 아가로 오스 블록을 씻어. </li><li> vibratome의 사용 설명서에 따라 100 μm의 섹션으로 아가로 오스 블록을 슬라이스. 계속해서 건조를 방지하는 아가 블록을 헹군다. 각 슬라이스 절단되기 때문에, 26 G 주사기 바늘을 이용하여 vibratome에서 제거하고, 차가운 0.5 % PBSTx (500 μL / 웰)를 포함하는 스폿 플레이트에 옮긴다. </li><li> 해부 현미경 하에서 검사하여 3β-HSD 활성 양성 조직 절편을 수집하고, PI에 의한 부분 전송추운 0.5 % PBSTx (150 μL / 웰)를 포함하는 96 웰 플레이트에 끝 차단 (개방에서 약 1mm 내경)와 pette 팁. 조직 샘플은 통상적으로이 공정 후의 아가 블록으로부터 해리. </li></ol></li><li> Permeabilization 및 세척 <ol><li> PBS에서 10 분, 1 % 소 혈청 알부민 / 1 % DMSO / 0.1 % 트리톤 X-100 (PBDTx)로 보충을위한 슬라이스 RT에서 0.5 % PBSTx 15 분간 PBS에서 10 분, 4 배 6 배 씻는다. </li></ol></li><li> 블로킹 <ol><li> RT에서 1 시간 PBDTx 2 % 소 태아 혈청 (FCS)을위한 슬라이스 부화. </li></ol></li><li> 차 항체 반응 <ol><li> 차 항체를 함유하는 PBDTx 1.5 일 동안 인큐베이션 슬라이스 (예를 들어 토끼 다 클론 항 - 인간 피브로넥틴 및 마우스 항 - 인간 국소 부착 키나아제) 4 ℃에서. </li></ol></li><li> 세탁 <ol><li> 조각은 실온에서 PBDTx에서 10 분 동안 6 배 씻으십시오. </li></ol></li><li> 블로킹 <ol><li> PB에 2 % FCS에서 1 시간 동안 조각을 품어RT에서 DTX. </li></ol></li><li> 차 항체 반응 <ol><li> 4 ° C에서 차 항체 (형광 결합 염소 항 - 토끼 또는 항 - 마우스 IgG)를 포함 PBDTx 1.5 일 동안 조각을 품어. </li></ol></li><li> 세탁 <ol><li> 조각은 실온에서 PBST에서 10 분 동안 10 RT에서 PBDTx에서 분 및 4 배에 대한 6 배 씻으십시오. , 공 초점 현미경 분석을 위해 PBS에 50 % 글리세롤로 샘플을 취소 : 참고. </li></ol></li></ol> 4. 공 촛점 분석 <ol><li> 전체 마운트 배아 및 10X / 0.5 20X / 0.75 대물 렌즈가 장착 된 공 초점 현미경으로 단면을 관찰한다. </li><li> 다음 형광 및 3β-HSD 염색을 동시에 검출 들어, 멀티 모드를 설정 488nm의 아르곤 레이저 및 GFP의 검출 505-530 nm의 대역 통과 필터; 543 nm의 헬륨 - 네온 레이저 mCherry 감응 560-615 nm의 대역 통과 필터; 및 3β-HSD의 얼룩의 검출을위한 광 채널 전송된다.핀홀 크기는 1 Airey 부이고, 해상도가 1024 X 1024 픽셀이다. </li><li> 3 차원으로 투영 (6 μm의 간격)의 Z 스택을 조립하고 이용함으로써, 돌기와 시야 병합 내장 촛점 소프트웨어. </li></ol>

<ol><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros%3A+differential+control+by+wt1+and+ff1b%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li>
<li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li>
<li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li>
<li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome%3A+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li>
<li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551(1992).</li>
<li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta5-delta4+isomerase+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li>
<li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function%2C+expression%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li>
<li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts%3A+morphology%2C+histology%2C+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997(2014).</li>
<li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li>
<li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li>
<li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li>
<li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040(2012).</li>
</ol>

저자는 선언할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

3β-HSD 활동의 신호 강도는 반응의 과정을 통해 증가. 3β-HSD 활동의 명확한 신호는 이후 28 HPF에서 단계에 대한 반응 4 시간 후에 발견되었다. 그러나, 반응 시간은 분석의 목적에 따라 경험적 결정이 필요하다. 염색 밤새 처리 요구의 경우, 약간 엷은 배경 샘플을 개발하는 경향이있다. 이 문제는 HSD-3β 활성 염색 전에 고정 지속 시간 (예를 들어, RT에서 4 % PFAT에서 4 시간)의 증가에 의해 극복 될 수있다. 이러한 실온에서 4 % PFAT와 밤새 고정으로 대비, overfixation에 의해, 매우 분명 배경에 연결됩니다. 그러나, 더 긴 시간은 상기 신호의 원하는 강도를 얻기 위해 요구된다. 우리는 3β-HSD 활동 염색하기 전에 밤새 2 %보다는 4 % PFAT와 샘플을 고정하는 것은 일반적으로 후속 형광 기자의 관찰 또는 I에서 더 바람직한 결과를 얻을 것으로 나타났습니다HC 분석. 그러나, 4 % PFAT와 배아를 고정하기 (1 일 이내에 완료)를 3β-HSD 활성의 신속한...

부신은 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축의 중요한 구성 요소, 스테로이드를 분비하고 스테로이드 항상성과 스트레스에 대한 신체 반응을 조정한다. 부신은 카테콜아민을 합성 ㄱ 영역 별 방식으로 스테로이드를 분비 바깥 쪽 피질, 및 내부 수질를 포함한다. 경골 어류의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 상대이며, 부신 피질과 수질, 각각 1-3의 기능적 등가물이다 steroidogenic interrenal과 크롬 친화 세포로 구성되어있다. 제브라 피쉬 모델을 사용하여 수행 연구는 모두 steroidogenic 및 크롬 친화 세포의 계보가 매우 포유류 1, 2에서와 유사한 분자 및 세포 메커니즘에 의해 형성되는 것으로보고있다. 따라서, 제브라 피쉬는 유전 질환, 신경 내분비 조절하고, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 (interrenal) 축 시스템 생물학 연구를위한 잠재적으로 강력한 모델이다. 4,5에서 17α-hydroxypregnelolone에서 프레 그네 놀론, 17α-hydroxyprogesterone에서 프로게스테론의 변환 및 안드로 스텐 디온을 촉매. 3β-HSD 호르몬 스테로이드, 즉 황체 호르몬, 글루코 코르티코이드, 무기질 코르티코이드, 안드로겐과 에스트로겐의 모든 클래스를 생합성을 위해 필수적이다. 두 사람의 3β-HSD는 HSD3B1을 동질 효소와 HSD3B2는 차동 (6) 표현된다. HSD3B2가 신피질 생식선에서 발현되는 반면 HSD3B1는 태반 및 말초 조직에서 발현된다. 인간 HSD3B1 및 HSD3B2는 interrenal 조직과 성인 생식선에서 표현되는 제브라 피쉬 hsd3b1, 공동 orthologs이다; 제브라 피쉬 hsd3b2 누구의 성적 기관 형성 칠하기 전에 사라질 모체 표현 유전자이다. 제브라 피쉬의 전체 마운트 3β-HSD 효소 활성 분석의 프로토콜, 레비의 방법을 수정하여 개발 된밀라노 등의 알에 의해 설명 s의. 여덟 경골 종 (8)의 동결 절편에. 때문에 조직 투과성 현상 지브라 피쉬의 광학 투명성, 3β-HSD 조직 화학 성공적 고정 제브라 배아와 유충에 사용할 수있는 전체 마운트 구체적 차별화 interrenal 조직을 서술. 이 민감하고 신속한 분석은 interrenal dysmorphogenesis의 다른 유형을 보여주는 다양한 돌연변이 morphants 적용되었다. interrenal 3β-HSD 활성은 interrenal 조직 명세가 Ff1b 전사 인자의 특정 녹다운을 중단하고 interrenal 분화가 Ff1b의 coregulator Prox1 9,10-의 최저 의해 영향으로 감소 된 배아 부재. 특히, 3β-HSD 활동과 같은 하나 아이드 핀 머리 심한 초기 결손 돌연변이 체에서 검출 될 수 있고, 여기서 H-3β, 곁눈질SD 조직 화학은 interrenal 세포 이동 (11)를 어떻게 영향을 받는지 묘사. interrenal 조직의 분화에도 혈액과 혈관의 완전한 부재에 손상되지 않습니다. 따라서, 내피 세포 유래 신호를 형성하는 방법을 개발 interrenal 기관은 12, 13를 측정 할 수있다. 전반적으로,이 조직 화학적 분석은 성공적으로 제브라 피쉬 모델의 사양, 차별화, 그리고 steroidogenic 세포의 이동을 연구에 사용되었다. 따라서, 효율적이고 부신 및 interrenal 장기 장애를 타겟팅하는 유전자 또는 화학 스크린에 대한 신뢰할 수있는 도구를해야한다.

<table><tbody><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td>LSM510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D8418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>USB</td><td>US16374</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 태아 송아지 세럼&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30073</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 수화물</td><td>시그마</td><td>N1636</td><td></td></tr><tr><td>4-니트로 블루 테트라졸륨</td><td>Promega</td><td>S380C</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>페닐티오우레아</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마</td><td>P4417-100Tab</td><td></td></tr><tr><td>PYREX 스폿 플레이트</td><td>코닝</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>암초 소금</td><td>AZOO</td><td>AZ28001</td><td></td></tr><tr><td>트랜스 디하이드로 안드로스테론</td><td>시그마</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>비브라톰</td><td>라이카</td><td>VT1000M</td><td></td></tr></tbody></table>

interrenal steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

이 프로토콜은 간단한 전체 마운트 효소 활성 분석을 통해 분화된 신간 스테로이드 생성 세포를 검출하는 방법을 소개합니다. 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) 활성 양성 세포의 발색 조직화학적 염색을 통해 분화된 스테로이드 생성 조직을 식별하는 것은 포유류와 teleosts에서 각각 부신피질 및 신간 조직의 형태와 분화를 모니터링하는 데 중요합니다. 제브라피시 모델에서는 발달 중인 배아와 유충의 광학적 투명도와 조직 투과성으로 인해 3β-Hsd 활성의 전체 마운트 염색이 가능합니다. 발달 중인 신경계 세포와 내피 세포를 표시하는 형질전환 형광 리포터 라인에서 수행되는 이 염색 프로토콜은 신장 및 주변 혈관 구조 외에도 스테로이드성 신간 조직을 검출할 수 있습니다. 진동 절편, 면역조직화학 및 컨포칼 현미경과 함께 신장 내 스테로이드 생성 조직의 혈관 미세환경을 시각화하고 분석할 수 있습니다. 3β-Hsd 활성 분석법은 현재까지 제브라피시 스테로이드 생성 세포를 표지하는 데 사용할 수 있는 적절한 항체가 없기 때문에 제브라피시 신내선의 세포 생물학을 연구하는 데 필수적입니다. 또한, 이 분석법은 빠르고 간단하여 부신(신간) 유전 질환을 표적으로 하는 돌연변이 스크리닝을 위한 강력한 도구를 제공할 뿐만 아니라 제약 또는 독성학 연구에서 스테로이드 생성에 대한 화학 물질의 파괴 효과를 결정하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

pronephric 신장 사구체 및 초기 혈관과 steroidogenic interrenal 조직 codevelops에서, 3β-HSD 효소 활성 분석은 이중 형질 전환의 Tg (wt1b : GFP)에서 수행 된 방법을 결정하려면 LI1, Tg는 (kdrl : mCherry) C15- 카르 배아를 34 HPF에서 (그림 1). 이 단계에서, 3β-HSD 활동을 양성 steroidogenic 조직을 바로 중간 선에 위치하고 있으며 일부 steroidogenic 세포가 중간 선에서 마이그레이션을 시작하고 지느러미보기에서 돌출 가장자리를 형성하는 반면 즉시 pronephric 신장 사구체에 꼬리 지느러미. steroidogenic 조직은 밀접하게 지느러미 대동맥 (DA) 및 후방 추기경 정맥 (PCV)와 연결되어 있습니다. <p class="jove_content" ...

제브라 피쉬의 interrenal 선은 포유 동물의 부신의 teleostean 대응이다. 효소 활성 분석, 개발 제브라 피쉬에서 차별화 된 steroidogenic 세포를 감지,이 프로토콜은 3-β-하이드 록시 탈수소 효소 (3β-HSD Δ 5-4 이성화 효소)를 수행하는 방법을 소개합니다.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 간단한 전장 효소 활성 분석(whole-mount enzymatic activity assay)을 통해 발달 중인 제브라피쉬의 분화된 인터레날 스테로이드 생성 세포를 검출하는 것입니다. 이 염색법은 인터레날 샘의 형성 및 기형과 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 염색 분석의 주요 장점은 신속하고 간단하며 신뢰할 수 있다는 점으로, 제브라피쉬의 유전적 또는 화학적 스크리닝을 위한 강력한 도구가 됩니다.이 절차는 신장과 혈관이 표시된 형광 리포터 형질전환 라인에서 수행할 수 있어, 동일한 배아 내의 여러 조직을 분석하는 것이 가능합니다. 바이브라톰 절편 제작, 면역조직화학 염색 및 공초점 현미경 관찰과 병행하면, 간신 조직의 혈관 미세환경 또한 시각화할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 3$\beta$-HSD 활성 염색을 위한 표준 용액을 준비한 후, 발달 중인 제브라피시 배아를 색소 형성을 억제하기 위해 0.03% PTU가 포함된 egg water에 넣습니다.탈난막 처리된 배아 또는 유충을 0.1% Tween 20이 포함된 PBS 내의 2% 또는 4% PFA, 또는 PFAT로 고정합니다. PBST를 사용하여 배아를 10분씩 4회 세척하며, 세척 단계 사이에서 시료가 마르지 않도록 주의합니다. 염색 반응 전, A물질과 B물질을 각각 별도의 튜브에 새로 준비한 후, 용액을 볼텍싱하고 원심 분리합니다.파트 A와 B는 반드시 별도의 튜브에 준비해야 합니다. 모든 구성 성분을 하나의 튜브에 바로 넣으면 즉시 심한 침전이 발생합니다. 파트 A 튜브 전체를 파트 B 튜브 전체에 넣으십시오. 잘 혼합한 후, 고정 및 세척된 배아가 들어 있는 각 마이크로원심분리 튜브에 1 mL씩 즉시 분주하십시오.알루미늄 호일로 튜브를 감싼 후, 완만하게 흔들어주는 로테이터(rotator) 또는 로킹 플랫폼(rocking platform)을 사용하여 상온에 둡니다. 현미경으로 발색 신호를 모니터링하여 반응 시간을 경험적으로 결정하십시오. 시간이 지남에 따라 약간의 침전물이 형성될 수 있으나, 이는 반응 과정에 영향을 주지 않습니다.PBST를 사용하여 배아를 10분씩 4회 세척하여 반응을 중단시킨 후, 4% PFAT를 사용하여 상온에서 60분 동안 염색된 배아를 후고정합니다. 전체 마운트 현미경 관찰을 위해 PBS에 50% glycerol을 섞어 배아를 투명화합니다. 그 다음, 배아의 등쪽이 위를 향하도록 방향을 잡은 후, 정립 현미경의 명시야 조명 하에서 시료를 관찰합니다.배아의 난황을 제거하고 이를 사용하여 평면 표본(flat mount)을 준비합니다. 그런 다음, 간신 조직(interrenal tissue) 형태의 고해상도 이미지를 캡처합니다. 스테로이드 생성 조직의 혈관 미세환경을 분석하기 위해, 염색된 배아를 2% PFA로 후고정합니다.4°C에서 1% Triton X-100으로 1시간 동안 처리한 후, 실온에서 PBST-X를 사용하여 배아를 10분씩 4회 세척합니다. 배아를 임베딩하기 위해, agarose를 PBS에 녹여 95°C에서 4% low-melting agarose를 준비합니다. 그 후, 마이크로원심분리 튜브에 소분하여 4~8°C에서 보관합니다.4% 저융점 아가로스 분취액을 70 °C에서 10분 동안 녹인 후, 해당 분취액을 47 °C로 유지합니다. 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브의 분리된 캡을 몰드로 사용하여 배아를 녹은 아가로스에 매립하고, 응고될 때까지 식힙니다. 바이브라톰 절편 제작을 위해 바이브라톰의 건조한 플랫폼에 종이 테이프 한 조각을 부착합니다.그런 다음, 면도날을 사용하여 몰드에서 굳어진 아가로스 블록을 제거합니다. 플랫폼의 종이 테이프에 순간접착제를 바르고, 샘플의 앞면이 위를 향하도록 하여 아가로스 블록을 종이 테이프 위에 고정합니다. 다음으로, 아가로스 블록을 상단 및 하단 면의 각 측면이 각각 약 4~8mm가 되도록 사각뿔대 모양으로 다듬습니다.0.5% Triton X-100이 포함된 차가운 PBS를 채운 스포이드를 사용하여 아가로스 블록을 헹굽니다. 그 다음, 제조사의 지침에 따라 진동 절편기(vibratome)를 사용하여 100 µm 두께의 절편을 준비합니다. 26게이지 바늘을 사용하여 진동 절편기에서 절단된 절편을 제거하고, 웰당 500 µL의 차가운 0.5% PBST-X가 들어 있는 스폿 플레이트로 옮깁니다.해부 현미경으로 확인하여 beta-Hsd 활성이 양성인 조직 절편 3개를 수집하고, 피펫 팁을 사용하여 해당 절편들을 차가운 0.5%PBST-X가 담긴 96-well 플레이트로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 절편을 추가로 염색하고 이미징합니다. 스테로이드 생성 인터레날(interrenal) 조직이 전신 kidney 사구체 및 초기 혈관과 어떻게 공동 발달하는지 결정하기 위해, kidney 특이적 및 내피 세포 특이적 형광을 모두 발현하는 이중 형질전환 제브라피쉬 배아에서 세 가지 beta-Hsd 효소 활성 분석을 수행하였습니다.여기에서 보시는 바와 같이, 3 beta-Hsd 양성 스테로이드 생성 조직 세 개가 정중선 오른쪽에 위치하며 원신 kidney 사구체에 바로 인접해 있습니다. 일부 스테로이드 생성 세포들은 정중선을 가로질러 이동하기 시작합니다. 내피 GFP를 발현하는 형질전환 배아에서 얻은 이 vibratome 절편들에 3 beta-Hsd 분석을 실시하였으며, fibronectin과 그 하위 작동 인자인 인산화된 focal adhesion kinase를 검출하기 위해 면역조직화학법으로 분석하였습니다.등쪽 대동맥 주변의 피브로넥틴 침착은 간신혈관의 성장을 지원하는 데 필수적입니다. 어류 배아 또는 자어의 경우, 적절하게 수행한다면 전장 조직화학 염색을 하루 안에 완료할 수 있습니다. 이 염색 방법은 간단하고 빠르지만, 스테로이드 생성 경로의 단일 효소만을 검출한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.간신 조직의 발달 분석을 목표로 하는 경우, 본 분석과 더불어 스테로이드 생합성에 관여하는 다른 주요 유전자의 발현을 검출하기 위해 in situ 하이브리다이제이션을 수행해야 합니다.

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

여기 우리는 성인 zebrafish에서 역전사 궤도 주사를하는 방법을 보여줍니다.

성인 Zebrafish에서 레트로 - 궤도 분사

zebrafish의 신장은 모두 신장과 조혈 성인 줄기 / 전구 세포의 고향이며, 척추 모델 생물에서 이러한 세포 유형과 그들의 자손을 공부하기 위해 우수한 기회를 나타냅니다. 여기, 우리는 세포 분리, 이식 및 신장 및 / 또는 혈액 세포 집단의 표현 연구와 같은 애플 리케이션에 사용할 수있는 성인 zebrafish의 신장을 확인하고 수술 제거하는 연구자 수 있도록 상세한 해부 절차를 보여줍니다.

성인 Zebrafish의 신장의 해부

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

여기에 기재된 방법은 초점 및 평면 드리프트를 보정하는 광학 절편 및 재조정 간단한 전략을 수행 할 해부 현미경 형광을 사용하여 제브라 피쉬 배아 장기 발전 경과 분석을 허용한다.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

이 프로토콜은 vasculature를 시각화하고 Xenopus tropicalis 의 복잡성을 정량화하기위한 형광 기반의 방법을 보여 줍니다 . 혈관은 생체 내에서 심혈관 질환 발달을 연구하기 위해 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작 후 배아의 박동 심장에 형광 염료를 주입 한 후 수분 내에 영상화 될 수있다.

의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

속눈썹 개발 적절 한 organogenesis에 생명 이다입니다. 이 프로토콜 레이블을 하 고는 제 브라의 ciliated 셀을 시각화 하는 최적화 된 방법을 설명 합니다.

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

여기, 우리는 방법 프로토콜 neoangiogenesis 및 구조적인 변화에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 논의.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.

브라이트필드 현미경을 사용하여 애벌레 제브라피시의 간 크기 정량화

배우세요 제브라피쉬에서 간성 스테로이드 생성 세포를 검출하는 전마운트 효소 활성 분석법을 통해 내분비선 발달 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 유전자 및 화학 스크리닝에 강력한 도구입니다.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

더 많은 동영상 탐색