Name: 천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 탐색하세요 Staphylococcus aureus 바이오필름 억제 화합물을 선별하는 새로운 플랫폼을 통해 생존율, 바이오매스, 매트릭스 분석을 결합하여 천연 화합물 라이브러리의 효능을 평가하고 신약 개발을 가속화합니다.

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저자는 자신의 실험실에서 촬영 과정에서 그의 지원을위한 교수 폴 감옥과 LMPH, 앤트워프 대학, 벨기에 감사합니다. 이 작품은 핀란드 프로젝트 아카데미 (272266 및 282981 프로젝트) 및 스웨덴어 Tekniska Vetenskapsakademien 나는 핀란드에 의해 투자되었다. 석사 야니 Kujala의 기술적 기여가 인정된다.

1. 박테리아 성장 <ol><li> 사전 문화 (220) rpm으로는 (16 ~ 18 시간)을 흔들어 37 ° C에서 트립신 콩 국물 (TSB)에서 하룻밤 박테리아. </li><li> 신선한 TSB에 (여기에서, 1000 배 S. 구균에 이용되는 박테리아의 성장 속도에 따라) 및 (이 급성장 도달하도록 37 ° C, 200 rpm에서 성장 광하게 예비 배양을 100-1,000 배 희석 0.2 및 0.6) 사이의 595 nm의 (OD 595)에서 밀도. 참고 :이 단계는 균주 별 최적화가 필요합니다. </li></ol> 2. biofilm 형성 : 사전 및 사후 노출 <ol><li> (이 밀리리터 당 약 106 콜로니 형성 단위 (CFU / ㎖)와 동일)가 기하 급수적으로 성장한 배양 100 배 희석. </li><li> 노광 전 프로토콜 <ol><li> 처리되지 않은 대조군 샘플의 경우, 멸균 96 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 희석 세균 배양 200 μl를 추가합니다. </li><li> 시험 화합물 또는 제어 4 μl를 추가항생제 (50 배 원액) 잘 당 희석 세균 배양의 196 μL. </li><li> 18 시간 동안 200 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 37 ° C에서 그것을 품어. 참고 : 여기에 우리가 2mm 궤도와 쉐이커를 사용합니다. </li></ol></li><li> 노광 프로토콜 <ol><li> 모든 샘플의 경우, 멸균 96 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 희석 세균 배양 200 μl를 추가합니다. </li><li> 18 시간 동안 200 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 37 ° C에서 그것을 품어. 참고 : 여기에 우리가 2mm 궤도와 쉐이커를 사용합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 생물막을 건드리지 않고 조심스럽게 전체 플랑크톤 솔루션을 제거합니다. </li><li> 시험 화합물 또는 제어 항생제 (50 배 원액) 잘 당 TSB 196 ㎕를 4 μl를 추가합니다. </li><li> 추가로 24 시간 동안 200 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 37 ° C에서 그것을 품어. 참고 : 여기에 우리가 2mm 궤도와 쉐이커를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 레사 주린 염색 Protoco바이오 필름의 생존 능력 평가를위한 리터 <ol><li> 멸균 PBS 0.1 ㎎ / ㎖ 레사 주린 (0.4 밀리미터)의 주식 솔루션을 준비합니다. 빛 노출로부터 보호 멸균이 주식을 유지하고, 4 ℃에서. </li><li> 20 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)으로 레사 주린 스톡 1:50 희석. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 별도의 깨끗하고 96 웰 플레이트에, 기포를 생물막을 터치하거나 생성하지 않고 조심 (웰에 생물막을 떠나는) 전체 용액 플랑크톤을 전송. </li><li> 물론 당 200 μl를 추가하여 멸균 PBS로 한 번 생물막을 씻으 조심스럽게 멀티 채널 피펫을 사용하여 제거합니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 생물막 플레이트의 웰 당 희석 레사 주린 200 μl를 추가합니다. </li><li> 처리되지 않은 생물막 제어 균등 핑크 때까지 약 20 분 동안 진탕, 실온 (RT), 200 rpm에서, 어둠 속에서 그것을 품어. </li><li> 의 형광을 측정EXC = 560 nm이고, λ 안에 플레이트 리더 (상단 읽기)와 590 nm의 = λ. </li></ol> 4. 크리스탈 바이올렛 염색 의정서는 바이오 필름의 바이오 매스 정량화를위한 ​​3 단계에서와 같은 플레이트를 사용하여 <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 우물에서 조심스럽게 레사 주린 얼룩을 제거합니다. </li><li> 15 분 동안 메탄올 200 μL와 생물막을 수정합니다. </li><li> 10 분 동안 접시에 건조 공기를 보자. </li><li> 신중하게 멀티 채널 피펫을 사용하여, 크리스탈 바이올렛 용액 (탈 이온수에 희석 부피 / 부피) 0.02 %의 190 μl를 추가합니다. 피펫 동안 얼룩 웰의 측면에 손이 닿지 않도록 취출을 완료 피펫을 누르지 않으면 기포의 형성을 방지한다. </li><li> RT에서 5 분 동안 그것을 품어. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 얼룩을 제거합니다. </li><li> 탈 이온수 (각 시간 μL 200)와 함께 두 번 씻으십시오. </li><li> 우물은 실온에서 5 분간 건조하자 나머지 얼룩을 용해96 % 에탄올 또는 33 % 아세트산이다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 그것을 품어 및 595 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol> 5. 바이오 필름과 동일한 샘플 플레이트를 사용하여 플랑크톤 박테리아에 살균 효과를 평가 <ol><li> 3.3에서 플랑크톤 솔루션 판의 595 nm에서의 탁도를 측정한다. </li><li> 레사 주린 주식의 10 μl를 첨가 당 잘하여 레사 주린와 플랑크톤 박테리아를 얼룩. 피펫으로 잘 섞는다. </li><li> 처리되지 않은 컨트롤이 고르게 핑크 때까지 약 5 분 동안 실온에서 어둠 속에서 그것을 품어. </li><li> λ의 EXC = 560 nm에서의 형광을 측정하고 λ 안에 590 nm의 =. </li></ol> 매트릭스 정량 및 바이오 필름의 형광 현미경 이미징 6. 밀 배아 응집소 염색 <ol><li> 매트릭스 정량화 <ol><li> 멸균 PBS에서 WGA 프로브의 5 μg의 / ㎖ 솔루션을 준비합니다. </li><li> 병렬 샘플 괞 찮아를 사용하여이 염색에 대한 테. 우물에서 플랑크톤 솔루션을 제거하고 조심스럽게 바이오 필름을 건드리지 않고 멀티 채널 피펫을 사용하여, 멸균 PBS (물론 당 200 μL)로 한 번 씻는다. </li><li> 물론이 염색되는 당 WGA 용액 200 μl를 추가합니다. </li><li> 2 시간 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 품어. </li><li> PBS 3 회 200 μL로 우물을 세척하여 언 바운드 얼룩을 제거합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 접시를 건조 할 수 있습니다. </li><li> 웰 당 200 μL를 사용하여 33 % 아세트산 바운드 얼룩을 녹인다. </li><li> 스트립 캡 우물을 밀봉하고 실온에서 30 초, 40 kHz에서의 물 목욕 초음파기를 사용하여 초음파 처리. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 접시를 품어. </li><li> 초음파 단계를 반복합니다. 웰은 초음파 단계 사이에 밀봉 된 상태로 유지 할 수 있습니다. </li><li> λ의 예 = 495 nm에서의 형광을 측정하고 λ 그들은 플레이트 리더 (상단 읽기)와 520 nm의 =. </li></ol></li><li> 매트릭스와 시각화형광 현미경 <ol><li> 단계 6.1.6 때까지 위와 같은 프로토콜을 사용합니다. </li><li> 건조 공정 후, FITC 필터 (또는 다른 적절한 녹색 여기 필터)를 사용하여 형광 현미경으로 샘플을 시각화. </li></ol></li></ol> 형광 현미경 및 녹색 - 투 - 붉은 비율에 대한 신호의 정량화 (G / R)와 이미징의 바이오 필름 내에서 7. 염색 유력한와 죽은 세포 <ol><li> 형광 현미경과 영상 <ol><li> 제조자의 지침에 따라, 각 프로브 (염색 한 생세포 다른 하나 염색 사균)의 용액을 준비한다. </li><li> 우물에서 플랑크톤 솔루션을 제거하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 (물론 당 200 μL) 멸균 PBS로 한번 씻어. </li><li> 물론 당 염색 액의 6 μl를 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 어둠 속에서 접시를 품어. </li><li> 현미경 전에 초과 액체 m를 제거anually 멀티 채널 피펫을 사용. </li><li> 인스턴스에 대한 FITC 필터 (녹색 형광 들면 생세포) 또는 TRITC 필터 (적색 형광 사균)를 이용하여 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐. </li></ol></li><li> 녹색 - 투 - 붉은 형광 비율로 신호의 정량화 (G / R) <ol><li> 단계 7.1.1과 7.1.2에서와 동일한 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 물론 당 염색 액 200 μl를 추가하고 어둠 속에서 15 분 동안 그들을 품어. </li><li> 여기 / 방출 파장 녹색과 적색 형광을위한 535분의 485 nm의 635분의 485, 각각 (상단 읽기)에서 플레이트 리더로 형광을 측정한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

동시에 생존, 바이오 매스 및 생물막 행렬의 화합물의 효과를 측정 할 수있는 하나의 방법은 없다. 따라서, 바람직하게는 일차 스크리닝 단계에서 세 개의 엔드 포인트에 영향을 검출하기 위해 분석을 조합이 필요하다. 레사 주린는 산화 환원 프로브의 첨가로 이루어지는 매우 간단한 염색 프로토콜이다. 그러나, 레사 주린과 생물막 최적의 배양 시간을 설정하는 것은 상기 분석의 성공에 중요하다. 다른에서 몇 시간 19 지속될 수 있지만 일부 균주에서 분홍색 형광 레조 루핀 (resorufin)으로 레사 주린 프로브의 감소는 매우 신속하게 발생한다. 또한, 동일 균주 내에서, 또한 플랑크톤 박테리아와 바이오 필름 사이에 상당한 차이가있을 수 있습니다. 플랑크톤 박테리아는 일반적 쉽게 세균 밀도 생물막 PO보다 플랑크톤 집단 낮고 주로 때문에 도달반응의 빠른 회전율을 촉진 pulations. 생물막 생존 염색법 프로브 게시 비교하여, 레사 주린이 가장 정확하고 사용이 간...

박테리아는 생물막이 가장 일반적인 예입니다있는 두 개의 매우 다른 생활 양식, 플랑크톤 및 정착, 사이를 전환 할 수 있습니다. 생물막에서 세균은 자체 제작 매트릭스 1에 포함 된 구조화 된 사회를 형성한다. 이 자동 생성 행렬은 세균 및 외부 환경 사이에 장벽이며, 근접을 유지하면서 균체를 보호한다. 생물막 매트릭스의 조성 사이에도 종 내에서 변화하지만, 대부분은 리포 폴리 사카 라이드, 세포 DNA와 단백질의 긴밀한 네트워크로 구성된다. 행렬은 유해한 제제의 입사를 억제하는 물리 장벽으로서 역할뿐만 아니라 탈수 생물막을 보호하고, 전지 (2)을 빠져 나가는 영양분을 방지한다. 바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 항생제 내성 감염 (3)의 80 % 이상에 대한 소문에 책임이 있습니다. 그들은 DISP습도, 삼투압, 기계적 응력 4, 열, 자외선 5, 살균제, 항균제, 호스트 면역 체계 1 : 외부 위협에 대한 본질적으로 높은 내성을 배치합니다. 예를 들어, 바이오 필름을 죽이기 위해 필요한 필요한 항균제의 농도는 플랑크톤 박테리아를 죽이기 위해 요구되는에 비해 최대 1000 배 높은 것으로 밝혀졌다. 이 높은 허용 오차에 대한 설명은 다 인성 것으로 보인다. 매트릭스는 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 바이오 필름 내의 세포 표현형 다양하다; 이들은 의한 바이오 필름 (6)의 내측 및 외측 부분 사이의 산소, 영양소 및 대사 산물의 존재 구배 다른 대사 상태 사이에서 전환. 따라서, 이러한 핵심으로 일부 생물막 지역에서, 박테리아는 산소와 영양분을 박탈되며 대사 덜 활성 또는 완전히 휴면 상태에 살고 <suP&gt; 7. 완전 휴면 세포는 세포 persister 지칭되며, 이들은 통상적 인 항균 치료 8에 민감하지 않다. 따라서, 생물막 탄력성이 현재 제안 및 다른 아직 알려지지 않은 메카니즘의 조합으로부터 발생하는 것으로 보인다. 황색 포도상 구균 종. 심한 흔히 생물막 관련 감염 4 일으키는 가장 문제 그람 양성균 중 계속된다. 모든 박테리아의 최대 99 %가 그 주된 세균의 라이프 스타일 3 만들기, 생물막 내에서 연관되는 것이 좋습니다. 그러나, 현재 존재하는 모든 항생제는 단일 셀 (플랑크톤) 박테리아에 대해 개발되어왔다. 지금까지 분자의 매우 제한된 레퍼토리는 선택적 성숙한 생물막에 작용할 수있는. 이러한 상황은 방지 생물막에 대한 검색이 더 눈에 띄는 자리를 차지하도록 촉구되어있는 신약 개발의 진보적 인 패러다임의 변화를 주도하고있다. methodolog에서생물막 방식에만 한정 표준 제정기구 화학적 라이브러리의 고 - 처리량 스크리닝에 적용 특히 개발 한 것처럼 iCal의 관점 추가적인 어려움이 존재한다. (하나만 제외)의 모든 표준 분석법 생물막 반응기에 기초하여,이 방법은 일반적으로 초기 임상 단계 9-12 동안 사용할 수없는 큰 작동 부피 및 시험 될 화합물의 대용량을 필요로한다. 유일한 기존 표준 스크리닝 적용 분석은 시판 최소 생물막 제거 농도 (MBEC) 시스템이 개발되었다 13-15되는 소위 캘거리 생물막 장치이다. 그러나 이러한 분석의 한계는 생물막이 쐐기 상에 성장되고, 모든 박테리아 종 또는 동일한 종의 균주 내에서조차하지이 장치에 바이오 필름을 형성 할 수 있다는 것이다. 또한, 특히 천연 화합물의 탐색에 적용 할 수있는 방법은필요로했다. 천연 제품은 지난 세기 16 세 이상의 항균 신약 개발의 혁신의 주요 원천이되어왔다. 또한 persister 세포에 효과적 작용 고유 메커니즘 신규 항 생물막 화합물을 제공 할 수있다. 따라서, 자연과 자연에서 영감을 라이브러리의 탐사 유망 독특한 안티 바이오 필름 리드를 생산의 높은 가능성을 가지고있다. 여기서는 포도상 구균 생물막의 생존 총 미생물, 매트릭스에 대한 효과를 측정하기 위하여 세 가지 분석법을 이용하여 항 - 생물막 화합물의 화학적 스크리닝 개발 된 분석법의 플랫폼의 실험 세부 사항을 제시한다. 첫번째 분석은 생물막의 생존 능력을 측정하고,이를 레사 주린 염색에 기초한다. 레사 주린은 산화 된 상태에서 파란색과 비 형광 및 박테리아의 대사 활동에 의해 감소 ​​할 때 핑크, 높은 형광 레조 루핀 (resorufin)으로 변 산화 환원 얼룩입니다. 그것은 매우 간단하고 빠른 m이다기본 검진 17 ~ 20에 적합 ethod. 두 번째 분석은, 크리스탈 바이올렛 염색을 기준으로 총 생물막 질량을 측정한다. 크리스탈 바이올렛은 바이오 필름 19,21-23에서 세균과 박테리아를 연구하는데 널리 사용되는 얼룩입니다. 상기 분석은 저렴한 시약에 기초한 간단한 흡광도 포인트 판독 갖는다. 마지막으로 세 번째 분석은 포도상 구균 생물막 (24)의 매트릭스에 존재하는 N의 아세틸 글루코사민 잔기 (PNAG)을 폴리 데 특이 적으로 결합 밀 배아 응집소 통해 생물막 (WGA)의 세포 외 고분자 물질 (EPS) -matrix 타겟팅. WGA는 형광 강도 리더 (25)를 사용하여 검출 될 수있는 형광 물질로 접합된다. 우리는 여기에 근거하고 우리는 응용 프로그램의 예를 포함, 개발 플랫폼의 세부 사항을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Resazurin</td><td>시그마 알드리치</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마 알드리치</td><td>HT90132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>밀 배아 Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD BacLight&nbsp;</td><td>분자 프로브</td><td>L7012</td><td>SYTO 9 생존 세포 염색 용 녹색 및 프로피듐 요오드화물 염색 죽은 세포 적색</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염</td><td></td><td></td><td></td></tr>수 <tr><td>트립톤 콩 한천</td><td>Lab M, Neogen</td><td>LAB011</td><td></td></tr><tr><td>트립틴 콩 국물</td><td>Lab M, Neogen</td><td>LAB004</td><td></td></tr><tr><td>F96 웰 플레이트 폴리스티렌 멸균 투명 평면 바닥</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>161093</td><td></td></tr><tr><td>브랜드 캡, 8 스트립</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BR781413-300EA</td><td></td></tr><tr><td>Branson CPX 시리즈 초음파 수조</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z769428-1EA</td><td></td></tr><tr><td>멀티피펫</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멀티드롭 디스펜서</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomek 3000</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varioskan 플래시 멀티플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>25923</td><td></td></tr></tbody></table>년

천연 화합물 라이브러리의 탐험에 적합 안티 바이오 필름 분석 실험의 플랫폼

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 잠재적으로 항생제 내성 감염의 80 %에 대한 책임이 있습니다. 바이오 필름은 인성 생각된다 화학 요법에 대한 매우 높은 공차를 표시하고있다. 예를 들어, 행렬은 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 생물막 내에서 세포 표현형 다양하다. 가능성, 생물막 탄력성이와 다른, 아직 알려지지 않은 메커니즘의 조합에서 발생한다. 현재 기존 항생제 모두 단일 세포 (플랑크톤) 박테리아에 대해 개발되어왔다. 따라서, 지금까지 분자의 매우 제한된 레퍼토리는 선택적 성숙한 생물막에 작용할 수있는. 이러한 상황은 방지 생물막에 대한 검색이 더 눈에 띄는 자리를 차지하도록 촉구되어있는 신약 개발의 진보적 인 패러다임의 변화를 주도하고있다. 추가 과제는이 때문이다매우 생물막 연구를위한 표준화 된 방법, 화학 라이브러리의 대규모 스크리닝에 사용될 수있는 특히 수를 제한했다. 여기, 화학 검사에 대한 실험 안티 바이오 필름 플랫폼이 제공됩니다. 폴리 N의 아세틸 글루코사민, PNAG의 그것은 밀 배아 응집소를 사용하여 생물막 (레사 주린 염색과) 가능성, (크리스탈 바이올렛 염색) 총 바이오 매스 및 바이오 필름 매트릭스 (측정하는 세 가지 분석을 사용 WGA-형광 기반의 염색 , 분수). 모든 분석은 모델 박테리아 포도상 구균을 사용하여 개발 하였다. 플랫폼 일차 스크리닝뿐만 아니라 식별 항 생물막 히트 기능적 특성화에 사용될 수있는 방법의 예를 제시한다. 이 실험 순서는 또한 측정 된 엔드 포인트에 기초하여 히트 분류 할 수 있습니다. 또한 특히 단기 화학 요법의 효과에 비해 장기에, 행동의 자신의 모드에 대한 정보를 제공합니다. 따라서, 매우 ADVA은다양한 생명 의학 애플리케이션을위한 출발점을 제공 할 수 고품질의 히트 화합물의 빠른 식별을위한 ntageous.

제안 된 플랫폼에서, 생존, 바이오 매스 및 바이오 필름 행렬에 미치는 영향은 정량화된다. 작업 시퀀스 (도 1)에서, 하나의 샘플 플레이트를 동시에 세균 생물막의 생존과 총 생물막 미생물에 대한 영향을 평가하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 레사 주린과이어서 염색된다. 이 레사 주린과 제 염색 크리스탈 바이올렛 플레이트 사이의 최대 신호 흡광도 단위의 비교를 위해 크리스탈 바이올렛 염색 결과 (p = 0.4149에 유의 한 효과가 없었다 별도로 염색 이전 것이 입증 되었기 때문에 두 분석은 동일한 플레이트에서 연속으로 수행 될 수있다 레사 주린 - 염색, N = 20) (26) 후. 박테리아 플랑크톤에 대한 영향을 동시에 평가 될 수있다. 안타는 생존 또는 바이오 매스 기반 분석 중 하나에서 발견...

생물막 감염은 화학요법에 대한 내성이 높습니다. 단일 분석법으로 생물막의 복잡성을 파악할 수 없습니다. 대신, 보완적인 분석이 필요합니다. 우리는 생존력, 바이오매스 및 생물막 매트릭스에 대한 분석을 결합한 스크리닝 플랫폼(S. aureus를 위해 개발됨)을 제시합니다. 이를 통해 장기적인 화학 요법 효과 평가를 포함한 항생물막 약물 발견을 할 수 있습니다.

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

이 분석 플랫폼의 전반적인 목표는 새로운 항생물막 화합물의 식별 및 특성화를 위해 세 가지 관련 종말점, 생존력, 바이오매스 및 생물막 매트릭스를 결합한 의미 있는 스크리닝 작업 흐름을 제공하는 것입니다. 이 플랫폼은 항생제제 발견 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있으며, 단기 화학 요법 효과와 장기 화학 요법 효과를 빠르고 호환 가능한 방식으로 조기에 구분할 수 있습니다. 이 개발된 플랫폼의 주요 장점은 다양한 분석을 결합하여 화학 라이브러리, 특히 천연 화합물의 항생물막 효과에 대한 보다 완전한 그림을 제공한다는 것입니다.실험을 시작하려면 멸균된 96 마이크로웰 플레이트의 웰당 10에서 6번째 CFU로 구성된 200마이크로리터의 처리되지 않은 대조군 샘플을 준비합니다. 박테리아 배양이 없는 매체 대조군을 포함합니다. 다음으로, 동일한 96개의 웰 플레이트에서 웰당 4마이크로리터의 50x 항생제 원액과 196마이크로리터의 박테리아 배양액으로 샘플을 준비한 다음 배양합니다.멀티채널 피펫을 사용하여 바이오필름을 건드리거나 기포를 생성하지 않고 전체 플랑크톤 용액을 별도의 깨끗한 96웰 플레이트로 조심스럽게 옮겨 레사주린 염색을 계속합니다. 다시 다채널 피펫을 사용하여 웰당 200마이크로리터를 추가하여 멸균 PBS로 바이오필름을 한 번 세척하고 용액을 조심스럽게 제거합니다. 바이오필름 플레이트의 웰당 200마이크로리터의 20마이크로몰 레사주린 용액을 추가하고 처리되지 않은 바이오필름 대조군이 균일하게 분홍색이 될 때까지 어둠 속에서 200rpm으로 20분 동안 바이오필름을 배양합니다.그런 다음 플레이트 리더로 형광을 측정합니다. 우물에서 resazurin 얼룩을 조심스럽게 제거하십시오. 200마이크로리터의 메탄올로 15분 동안 생물막을 고정합니다.고정 후 메탄올을 제거하고 플레이트를 10분 동안 자연 건조시킵니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 190마이크로리터의 0.02% 크리스탈 바이올렛 용액을 바이오필름에 조심스럽게 첨가합니다. 피펫팅하는 동안 얼룩이 있는 웰의 측면을 만지지 말고 기포가 형성되는 것을 방지하고 피펫을 눌러 완전히 분출하지 마십시오.그런 다음 실온에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 다중 채널 피펫으로 얼룩을 조심스럽게 제거하십시오. 200마이크로리터의 탈이온수로 생물막을 세척합니다.웰을 실온에서 5분 동안 건조시키고 남은 얼룩을 33% 아세트산에 용해시킵니다. 플

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 페그 플레이트를 사용하여 생물막을 효율적으로 제거하는 항균 화합물을 스크리닝하는 분석을 보여줍니다. 이 방법론은 항균 화합물로 처리한 후 생물막의 대사 상태를 모니터링하여 최소 생물막 박멸 농도를 쉽게 측정할 수 있습니다.

항균제 스크리닝을 위한 Peg Plate Biofilm Assay

이 비디오는 생물막 형성을 평가하기 위한 고체상 부착 분석을 보여줍니다. 멀티웰 플레이트에서 담즙염이 보충된 매체의 박테리아는 고체 표면에 부착되어 생물막을 형성하며, 이는 결정 바이올렛 염색 및 에탄올 처리를 통한 비색법으로 확인됩니다.

생물막 형성을 평가하기 위한 고체상 부착 분석

이 비디오는 다중 웰 플레이트를 사용한 생물막 분산 분석을 보여줍니다. 완충액과 포도당 처리는 생물막을 분해하여 박테리아를 방출하는 반면, 담즙염은 스트레스를 유발하여 박테리아를 보호하는 세포외 고분자 물질에 유지합니다. 완충액과 포도당을 사용한 더 높은 분산은 성공적인 생물막 분해를 확인하며, 이는 집락 형성 단위 측정으로 추정됩니다.

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