Name: P10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 배우세요 신생아 뇌졸중 연구를 위한 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델을 P10 쥐에서 수행하는 방법을. 이 기법은 허혈성 뇌 손상 메커니즘과 치료 전략 탐구에 필수적인 생리학적으로 정확한 번역 모델을 제공합니다.

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자금은 NIH K08 NS064094 및 UCSF REAC 보조금으로 제공되었습니다. 저자는 이 기술의 개발에 도움을 준 Nikita Derguin, Zinalda Vexler 및 Joel Faustino에게 감사를 표합니다.

모든 동물 연구는 동물 연구에 캘리포니아 대학 샌프란시스코위원회에 의해 승인 및 실험 동물의 관리 및 사용 (보건 복지부, 간행물 번호 85-23, 1985 년 미국 교육부의 가이드에 따라 수행되었다 ). 동물은 밀접하게 AAALAC의 인증을 받았으며 UCSF 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 수의사에 의해 감시했다. 8 일 된 쓰레기와 한 여성의 Sprague-Dawley 계 쥐 (쓰레기 당 10 새끼)를 얻었다. 새끼 10 일 이전 때까지 어머니와 그녀의 새끼는 음식과 임의 량의 물을 주어 IACUC 프로토콜에 따라 매일 농축와 온도 - 빛 제어 동물 보호 시설에 수용되었다. 이 절차에 사용 된 모든 수술기구는 멸균을 위해 멸균되었다. 악기 팁 불임 수술을 통해 유지됩니다. 1. 중간 대뇌 동맥 폐색 <ol><li> 강아지와 ensur 무게그 예는 적절한 가중치 (19-21 G)이다. 100 % O 2에서 3 %의 이소 플루 란의 강아지를 마취와 발 핀치에 대한 응답이 없음을 확인합니다. 수술 단계 하에서 가열 패드를 사용하여 35.5 ° C, 37 ° C 사이에서 상기 본체의 표면 온도를 유지한다. </li><li> 어깨 지역에 걸쳐 테이프와 부정사 위치에 동물을 고정합니다. 멸균 면봉을 사용하여, 총 네 면봉 각 용액 번갈아 이중 증류수에 70 %의 에탄올을 면봉 하였다 포비돈 요오드 용액 전방 치경부 면봉. </li><li> 로컬로 계획 절개 사이트에 0.25 % bupivacaine을 침투. 입체경을 사용하여 경동맥 (CCA)를 노출하는 중간 선 5 ~ 7 mm 전방 경부 절개를합니다. 개방 및 노출 된 동맥 캐비티 유지 2-4 견인기 놓는다. </li><li> 내 경동맥 (ICA), 후두 동맥 (OA) 및 외부 경동맥 (ECA)을 찾아. 명확한 전망을 얻을 수있는 동맥을 신랑. 자동차 수eful는 미주 신경을 방해하지. 참고 : 가짜 운영 새끼를 들어, inicision은 개방되고 동맥을 절개가 폐쇄 봉합 후, 노출되어있다. 총 마취 시간은 교합 수술의 그것과 동일합니다. </li><li> 6-0 실크 꼰 봉합 스레드의 1.5 cm를 잘라. 단일 가닥을 잡아 당겨, ​​봉합을 Unbraid. 단일 가닥이 단정하고 있지 마모 있는지 확인하십시오. 참고 : 필요한 경우, 멸균 물에 단일 가닥을 찍기와 forcep 팁 가닥을 정리하여 마모 끝을 smoothe. </li><li> 45도 집게로 봉합 가닥을 잡고 있지만, forcep 팁은 ICA 및 OA 사이에 나올 수 있도록 ICA에 따라 가기 위해 청소 아크 동작으로 집게를 이동합니다. 참고 : 해부가 잘되어있는 경우,이 단계가 상대적으로 쉬울 것이다. ICA에와 OA가 감동 경우, ICA를 분리하기 위해 집게를 사용하는 경우 동맥을 파열 않도록주의하십시오. 출혈이 발생하는 경우, 집게까지로 동맥에 압력을가출혈은 정지한다. 멸균 면봉으로 혈액을 흡수. </li><li> 포셉에 의해 유지되는 봉합 가닥의 끝을 잡고 최종 사용자가 쉽게되도록 당깁니다. 나이프의 가닥을 분리하고 150 단계 (도 1a)의 동작을 반대의 ICA 아래로부터 겸자를 백업. </li><li> 기지는 CCA에서 분리 곳에서 가장 가까운에 ICA 주변에 임시 끈을 묶어. 주 :이 있다는 것을 보장하면서 매듭을 제거 인출 될 가닥의 단부는 용이하게 집게로 파악 (1mm 이상, 3 mm 이하) 정도로 오래되도록 매듭 것이 중요 후퇴 매듭의 반대쪽 가닥에 봉합 적당량. </li><li> 조심스럽게 옆으로 ICA를 철회하고 절개 반대 측면에있는 겨드랑이 지역 근처에 과도한 피부에 가닥을 고정 클립을 사용합니다. 이 후퇴 가닥에, 다음 단계로 진행하기 전에 혈액의 흐름을 막을 정도로 팽팽 있는지 확인조절되지 않는 출혈의 위험을 최소화 할 수 있습니다. 동맥이 평평하고 창백한 것을 관찰한다. 참고 : 이상 후퇴, 그것은 ICA의 부분 또는 전체 눈물을 일으킬 수 마십시오. 후퇴 단지 클립 반대측의 가닥 당겨 arteriotomy하기 전에 조정할 수있다. </li><li> 단계 1.5에서와 같이, 아래 및 ICA 주위 다른 unbraided 봉합 루프 가닥을 파악 45 개 집게를 사용한다. 포지션이 후퇴 가닥 가닥 (도 1b) 측 방향. 참고 :이 단계는 또한 철회 이전에 수행 할 수 있습니다. 철회의 품질에 대한 확신이 있다면,이 매듭은 매우 느슨하게 다음 단계 이전에 연결 할 수 있습니다. </li><li> 동점 결찰에 근접 실수를 범 상기 묶여 묶이지 합자 사이의 0.2 mm의 arteriotomy 중간을 잘라. 참고 : 혈액이 arteriotomy를 통해 비울 수있는 공동 오프 동맥에 남아 있지만 5 μL를 초과하지 않아야합니다. 이 지속 출혈하는 경우, 신중에 신중하게 후퇴를 높이기 위해 후퇴 가닥을 당겨보이드 과도한 장력에서 동맥 손상. </li><li> 메트릭 통치자를 사용하여 폐색 봉합을 측정하고 재관류 동안 occluder에 제거 2-3 mm의 추가 수당과 봉합을 잘라. 45도 집게로 occluder에를 잡고 발전을위한 정지 지점을 표시의 MCA에 도달하기 위해 적절한 길이 굴곡을 만들 직선 집게를 사용합니다. 주 : 벤드 실리콘 선단에서 10mm 흡장 길이 중량이 범위 P10 스프 라그 돌리거나 긴 에반스 래트 새끼 사용된다. </li><li> 45 ° 집게를 사용하여 arteriotomy으로 실리콘 코팅 된 나일론 봉합사 폐색 공급하고 MCA (도 1C)에 사전 결정된 거리를 표시하는 굽힘 봉합을 진행. 발전이 부드러운 느낌을 보장; 저항이 느껴지는 경우 즉시 발전을 중지합니다. 발전하는 동안, 머리쪽으로는 CC / ECA에 평행 한 방향으로 봉합을 목표로하고 있습니다. 참고 : 봉합 고급 등쪽은 방향 인 경우동물의 척추, 그것은 pterygopalatine 동맥 (PTA)로 실행할 수 있습니다. 저항 발전 3-5 mm 후 생각되면 봉합사는 PTA 접합을 쳤다. 실리콘 헤드 발전 방향을 조정하기 전에 arteriotomy 근처까지 동맥 밖으로 occluder에를 백업합니다. 완전히 arteriotomy에서 occluder에 제거 할 필요는 없습니다. </li><li> 임시 끈 묶는 단계 1.10 (도 1D)로부터 스트랜드를 사용하여 occluder에 보안. </li><li> 트랙터 클립을 제거합니다. 매듭을 제거 당기면 매듭의 가닥 직선 집게로 파악이 용이하고 매듭을 조여 당겨 가닥 이상이되도록 임시 합자 모두의 가닥을 낸다. 참고 :이 폐쇄 후 캐비티에 얽힌하지 않도록 가닥이 짧아야한다. </li><li> 견인기를 제거하고 서너 중단 봉합을 만들 6-0 꼰 실크를 사용하여 구멍을 닫습니다. </li><li> 에서 강아지를 제거마취는 실내 공기의 가열 패드 위에 놓고. 이 흉골 드러 누움을 유지하고 완전히 댐에 반환하기 전에 복구되었는지 확인하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 강아지를 모니터링합니다. 강아지는 35.5 ° C, 37 ° C 사이의 본체의 표면 온도를 유지하는 것을 보장한다. </li><li> 교합 동안, 이소 플루 란 마취하에 확산 강조 자기 공명 영상 (MRI-DW)의 부상의 적절한 유도를 확인하기 위해 사용될 수있다. 그림 2는 결과 tMCAO 9시 DW-MRI에 의해 감지 지속적인 허혈 손상을 보여줍니다. 주 : 확산 가중 스핀 에코 평면 촬상 재관류 전에 10-15 분간 수행된다. 뇌 전체는 다음 펄스 시퀀스 설정하여 일련의 2 mm 두께의 관상 부에 결상된다 : TR을 / TE = 5000 / 60 밀리 초, 4 개 평균, 시야 = 35mm, 데이터 매트릭스 = 128 * 128, 확산 구배 시간 = 20 MS 분리 = 29.7 밀리 초, 진폭 = 70mT / m, 및 B- 계수 = 1,045 S / mm 2.이러한 뇌간에서와 같이 대뇌 피질의 참여 또는 비정형 허혈 손상의 부족을 전시 동물은 제외됩니다. </li></ol> 2. 재관류 참고 : 폐쇄는 선조체 (striatum)와 피질과 관련된 부상의 중등도 양을 유발하는 3 시간 동안 수행된다. <ol><li> 약 2 시간 및 50 분 MCA 폐색 다음에 100 % O 2에서 3 % 이소 플루 란으로 마취 강아지. 수술 단계 하에서 가열 패드를 사용하여 35.5 ° C, 37 ° C 사이의 본체의 표면 온도를 유지한다. </li><li> 두 합자 및 교합 봉합의 꼬리 끝으로 표시됩니다 접합을, 단계 1.16에서 중단 된 봉합사를 제거하고 찾습니다. 참고 : 가짜 운영 동물 유도 폐색 동물에 해당하는 시간 동안 마취 유지된다. 절개는 다시 한 번 개폐 봉합된다. 가짜 운영 동물의 경우, 2.11 단계로 진행합니다. </li><li> 조심스럽게 풀고대부분의 측면 매듭는 이전에 긴 가닥을 잡아 당겨 단계 1.14에 묶여. 참고 : 매듭을 푸는 저항이있는 경우, 매듭의 올바른 가닥이 당겨지는 것을 보장하기 위해 중지합니다. 저항이 계속되면, 더 나은 뷰의 배율을 높일 수 있습니다. 이 단계에서 동맥을 손상 할 수있는 한, 푸는 때주의해야합니다. </li><li> 캐 버티로부터 봉합 가닥을 제거한다. </li><li> MCA 폐색 다음 정확히 3 시간에서 천천히 동맥에서 교합 봉합을 백업 할 수 있습니다. 아무 저항도 없을 것입니다. 참고 : 대부분의 경우에는 출혈이있을 수 없습니다. 출혈의 작은 금액이 발생하는 경우, arteriotomy 사이트의 동맥에 압력을 적용합니다. </li><li> 다음 단계는 재관류에 대한 ICA 혈액의 흐름을 복원 한, arteriotomy에 압력을 적용하기 위해 집게를 사용합니다. </li><li> 조심 단계 2.3에서와 동일한 방법을 사용하여 중간 매듭을 푼다. </li><li> 몸에서 봉합 가닥을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 arteriotomy에 지혈제를 적용합니다. </리&gt; <li> 출혈이 정지되었는지 확인합니다. 참고 : 동맥의 원래 모양과 붉은 색의 반환 ICA 혈액의 흐름이 복원 된 것을 확인합니다. </li><li> 견인기를 제거하고 6-0 꼰 실크 3-4 중단 봉합 캐비티를 닫습니다. </li><li> 마취에서 강아지를 제거하고, 실내 공기의 가열 패드에 배치. 이 흉골 드러 누움을 유지하고 댐에 반환하기 전에 전체 복구를 보장 할 수있는 충분한 의식을 회복 할 때까지를 모니터링합니다. 강아지는 35.5 ° C, 37 ° C 사이의 본체의 표면 온도를 유지하는 것을 보장한다. </li><li> 5 일간 매일 새끼를 검사합니다. 자신의 무게를 Recprd하고 적절한 치료를 위해 긴밀하게 절개 사이트를 검사합니다. 7-14일 후 봉합사를 제거합니다. 9 원하는 경우 후 결과 tMCAO 손상은 MRI로 이미지화 할 수있다. 참고 : 동물 첫날에 무게 1g까지 잃을 수 있지만 일반적으로 무게가 비슷한 내에 개입없이 체중을 회복하고있을 것일 4-5로 컨트롤 t 범위. 드물게 강아지는 구강 투여를 필요로하는 것은 2-3 일 동안은 공급, 과도한 체중 감량하거나 어려움 공급을 가질 수있다. </li><li> P21에서, 손상 등을 확실하게 로타로드 (rotarod) 또는 실린더 사육 같은 감각 행동 시험으로 평가할 수있다. 인지 테스트는 새로운 물체 인식 또는 모리스 물 미로 (13)로 평가를 사용하여 연령 빠르면 4-6로 주를 수행 할 수 있습니다. </li><li> 뇌 수확 11, 12 Euthasol의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏)에 의해 래트를 안락사. </li><li> 조직 학적 분석은 중재 부상 량 또는 응답 크레 실 바이올렛 또는 H &amp; E 염색 (도 3) (10)로 수행 될 수있다 평가한다. </li></ol>

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프로토콜 내에서 중요한 단계 모두 미성숙과 성숙 동물의 뇌 손상의 진행에 모두 저체온증 (17)과 고열 (18)의 효과가 알려진대로 첫째는, 전체 복구까지 마취의 개시로부터 정상 체온을 유지하는 것이 중요하다. 동물을 고정하고 호흡을 모니터링하고 기관이 압축이 없도록 절개 최적의 위치를 ​​권취하면서 둘째, 필수적이다. 이 미주 신경 자극과 심박수의 변화를 초래할 수 셋째, 압착 또는 미주 신경 연신 피한다. ICA에의 철회는 arteriotomy 동안 출혈을 제어 할 필요가 있기 때문에 넷째, 관심이 동맥 손상을 방지하기 위해 수축하는 동안 긴장의 정도에 지불해야합니다. 동맥이 수축에서 눈물 않으면 가난한 arteriotomy 절개가있는 경우, 또는 동물 인해 위험 분석에서 제외되어야한다출혈 가난한 재관류. 수정 및 문제 해결 참조 MRI를 사용하여 봉합 길이 실리콘 팁이 제대로 국소 허혈을 만들기 위해 MCA를 폐색하도록 최적화 될 수있다. MRI를 사용할 수없는 경우 절개가 봉합의 위치를 ​​시각화하기, 새끼는 재관류 전에 안락사 할 수있다. 필요에 따라 봉합 길이를 조정합니다. 강아지의 무게는 매우 교합 봉합 길이 요구와 상관 관계. 교합 시간은 부상의 심각성의 정도를 조정하기 위해 수정 될 수 있습니다. 또한, 봉합의 모양과 길이가 중요합니다. 19-21 g의 무게 P10의 Sprague-Dawley 계 롱 에반스 쥐들 10 mm의 경험에 삽입 최적의 길이이다. 교합 봉합사의 추가의 삽입은 MCA 천공 될 수있다. 또한, 각각의 수술에 흡장 필라멘트 형상의 일관성 부상 P 농도의 증가가 발생할 것attern 19, 20. 이러한 이유로, 우리는이 특정 목적을 위해 전문적으로 제조 봉합사를 사용하는 것이 좋습니다. 부상 패턴으로 인해 기술에서 보이는 분 차이로 실무자 사이에 다를 수 있습니다하는 것이 중요하다. 기술의 한계 작은에서이 기술을 수행, 설치류를 개발하는 것은 상당한 경험이 필요합니다. 제대로 수행 한 경우, 의사는 다른 크기의 동물에서 매우 일관된 부상 패턴의 원인이 95 % 이상의 생존율을 달성 할 수 있습니다. 또한, 적절한 수술 도구가 필수적입니다. 수술 도구가 아니라 모든 악기 팁이 제대로에 근접하도록 유지해야합니다. 기존 또는 대체 방법에 대한이 기술의 중요성 저산소증 - 허혈, 또는 쌀-Vannucci 모델이 동안 </SUP&gt;, 가장 일반적으로 개발 뇌의 저산소증 - 허혈 손상을 연구하는 데 사용됩니다, 재관류 단계 다음 글로벌 저산소증없이 일시적 국소 허혈이,이 결과 tMCAO의이 모델이 점에서 HI에서 구별되는 것이 중요합니다 때 장애물을 제거하고 혈액의 흐름이 복원됩니다. 이보다 일관되고 재현 부상을 야기보다 임상 적으로 번역 만삭 신생아 뇌졸중에서 본 것과 유사한 부상 패턴을 일으키는 것입니다. 이것은 초점 부상 패턴과 손상되지 않은 조직의 보상 반응의 연구를 할 수 있습니다. 이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 이 모델은 인간의 신생아 뇌졸중의 가장 흔한 원인은 주 산기 (11), (21) 중에 발생하는 일시적인 폐색 성 혈전과 비슷합니다. 병인은 완전히 명확하지 않다 가장 가능성이 다원적이지만, 대부분의 경우 t으로 추정된다O 태반 (11)로부터 전달 색전 기인한다. 또한, 이후의 발작이나 미세한 국소 신경 학적 시험 종종 본 추정 획 산기 많은 신생아 22 나 비정상. 이 부상을 진행하고 중요한 가능한 치료 전략의 메커니즘을 식별 할 수있는 일관된 번역 손상 모델의 사용을합니다.

신생아 기간 동안 스트로크만큼 2300의 1과 출산 (1)에서 발생하는 사망과 장애의 중요한 원인이다. 이 변형 된 중앙 신경 시스템 개발에 이르게과 간질의 발생률이 증가, 뇌성 마비, 정신 지체, 모터 또는인지 기능 장애의 다른 유형을 포함하여 장기 사망률을 증가. 초기 뇌졸중의 평생 효과는이 인구에 손상 및 수리의 메커니즘을 검사 손상된 뇌를 보호하기 위해 또는 수리를 강화하는 전략을 포함한 번역 동물 모델이 중요합니다. 다른 허혈 모델은 성인 동물에서 뇌 손상을 연구하는 데 사용하고있다이 과정은 일반적으로 개발 뇌의 저산소증 - 허혈 손상을 연구하는 데 사용되는 쌀-Vannucci (수정 레빈), 국소 허혈 - 재관류 손상의 독특한 메커니즘을하는 동안 부상 코어 및 penu에 초점 부상을 입을mbra 및 손상되지 않은 원격 조직. 고이즈미 3 및 4 롱가 모델은 각각 총 경동맥 (CCA) 및 외부 경동맥 (ECA)을 통하여 일시적 중간 대뇌 동맥 폐쇄를 달성 성인 쥐에서 개발되었다. 두 모델 모두에서 영구 결찰 및 동맥 가지의 소작은 출혈을 최소화하고 또한 동물의 능력을 공급하고 손상 후 체중이 증가하기에 부작용을 일으키는 원인이되는 수술 절차를 간소화하는 것이 중요하다. 또한, 미성숙 한 뇌에 뚜렷한 손상 메커니즘과 그 결과로 볼 부상의 특정 패턴이있다. 최근 photothrombotic 스트로크 (로즈 벵골 방법) 5 영구 MCA의 결찰 (6) 신생아 및 성인 뇌졸중을 연구하는 데 사용되었습니다. 두 photothrombotic 뇌졸중 및 MCA 내고는 reperfus의 부족을 초래할 뇌 혈류에 영구적 인 변화를 만들이온. 재관류가 증가 흥분 독성 (excitotoxicity), 자유 라디칼 형성하고, 허혈성 단계 7 구별되는 폭포 신호 포함 지연 세포 죽음에 이르는 산화 질소의 생산에 초점 부상의 발생과 진행의 중요한 구성 요소입니다. 저산소증 - 허혈은 또한 부상 코어와 더 도전 주변부의 연구를하고, 인간의 저산소 - 허혈 손상의 원인이 다릅니다과 일관된 초점 부상 패턴을 발생하지 않습니다 글로벌 저산소증, 다음에 영구 일방적 경동맥 결찰을 포함한다. 우리는 이전에 일시적 중간대 뇌동맥 폐색 (MCAO) 8, 9, 10을 사용하여 미성숙 한 쥐에서 비 출혈 허혈 - 재관류 뇌졸중 모델을 설명했다. 이것은 액세스 및 영구 ligati없이 내부 경동맥을 통해 MCA 폐색 덜 침습적 인또는 소작. 이는 주 산기 (11), (12) 뇌졸중의 가장 흔한 원인과 비슷한 부상의 모델을 제공한다. 동측 선조체 (striatum)와 두정 시간 피질에 손상 부상 결과이 허혈 - 재관류 모델. 결과 tMCAO의이 모델은 또한 폐쇄 기간을 변화시킴으로써 부상의 정도를 제어 할 수 있습니다. 신호 전달 경로와 부상 코어와 주변부에서와 손상되지 않은 동측 및 반대측 조직의 조직 학적 변화의 시험은 더 미성숙 뇌의 손상 및 수리의 메커니즘을 규명 할 수 있습니다. 이 연구는 뇌 발달이 중요한 손상 모델을 시연 할 예정이다.

<table><tbody><tr><td>Isoflourane</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>마취제, 3%&nbsp;</td></tr><tr><td>삼안 수술용 내시경</td><td>세계 정밀 기기</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>난방 패드</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td>저에서 중간 설정</td></tr><tr><td>IR 온도계</td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>소형 동물용 리트랙션 키트&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>CermaCut Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Junps</td><td>Fine Science Tools</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Clamp</td><td>Fine Science Tools</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>클램프 적용을 위한 Forcepts</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td>2mm 절단 가장자리</td></tr><tr><td>폐색 봉합</td>사 <td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>자</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic Agent&nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td><td>Ethicon</td><td>769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0.22 mL/kg</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Henry Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>실험실 테이프</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

p10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

미성숙한 뇌와 성숙한 뇌 모두에서 저산소성 허혈성 손상, 외상성 손상, 전반적 저산소증 또는 영구적 허혈을 연구하기 위해 많은 동물 모델이 사용되었습니다. 뇌졸중은 인간의 주산기에 흔히 발생하며, 일과성 허혈-재관류는 신생아에서 가장 흔한 형태의 뇌졸중입니다. 재관류 단계는 며칠에서 몇 주에 걸쳐 발생하는 부상 진행과 부상에 대한 내인성 반응의 중요한 구성 요소입니다. 이 일시적 중대뇌동맥 폐색(tMCAO)의 출생 후 10일(p10) 랫트 모델은 만삭에 해당하는 뇌에서 국소 손상 및 복구의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있는 편측성 비출혈성 국소 허혈-재관류 손상을 생성합니다. tMCAO에 의해 생성된 부상 패턴은 일관되고 재현성이 높으며 MRI 또는 조직학적 분석으로 확인할 수 있습니다. 부상의 정도는 폐색 시간의 변화와 논의될 다른 방법을 통해 조작할 수 있습니다.

결과 tMCAO로 인한 부상의 심각도는 폐색 시간과 외과 의사의 경험 모두에 크게 의존한다. 3 시간은 중등도 부상을 생산하는 동안 90 분 폐색은 종종 부상 패턴을 중간 정도의 가벼운 생산하고 있습니다. 부상의 심각도 MRI, 조직학, 또는 장단기 행동 분석을 비롯한 다양한 방법으로 평가 될 수있다. 도 2는 DW-MRI의 예 동측 반구 관련된 허혈성 손상을 확인, 90 분, 75 분 폐색 수행 보여준다. 확산 가중 이미지는 허혈성 급성 단계에서, 반대측의 변경없이 동측 선조체 및 동측 피질의 다수의 확산을 증가 보여준다. 이 피질과 깊은 회색 물질을 모두 포함하는 장기 손상의 중간 수준의 상관 관계. 에서 MCA 결과의 폐색덜 심각한 부상의 선조체 (striatum)에서 시작하여 더 이상 폐쇄 시간과 더 심각한 부상 대뇌 피질과 해마 손상을 악화 개발 세포 죽음. 이 폐색 14, 15, 16 중 적절한 봉합 배치 및 부종 및 손상 진행의 시각화의 확인을 허용하는 수술 기술의 최적화를하는 동안, 같은 봉합 삽입 길이를 결정으로, MRI는 매우 좋습니다. MRI를 사용할 수없는 경우, H &amp; E 또는 크레 실 바이올렛 염색 부상의 형태를 결정하는 간단하고 신뢰할 수있는 조직 학적 방법이며, 결과 tMCAO 후 초기와 후기 시점 모두에서 사용할 수 있습니다. 그림 3은 동측의 선조체 (striatum)와 피질에서 낭종 형성과 볼륨을 보여, 3 시간 폐색 다음 조직 병리학 적 검사에서 중등도 부상 패턴을 보여줍니다. 10 염색. 심지어 가벼운 부상, 같은 돌고 반 부전 마비와 같은 전위의 변화와 함께, 폐색 기간 동안 주목된다. 더 심각한 부상,이 변화는 재관류 후 지속됩니다. 추가의 행동 검사는 감각 기능 로타로드 (rotarod) 또는 실린더 사육 시험 및 모리스 물 미로 포함한 손상의 정도를 평가하는데 사용될 수있다인지 기능 (13). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg"> 그림 1 : 결과 tMCAO 절차의 라이브 수술 이미지. 단계 1.6에 설명 된 바와 같이 (A) 제 1 봉합사 가닥은 ICA 감아된다. (B)는 상기 제 1 임시 결찰 묶여되고 ICA가 후퇴된다. 단계 1.9에 설명 된 바와 같이 두 번째 가닥 봉합사는 봉합사 제 가닥 측면은 ICA 감아된다. 단계 1.12에 자세히 (C) 실리콘 코팅 폐색 봉합사는 arteriotomy 부위에 공급된다. 단계 1.14에 자세히 (D) 상기 제 2 임시 결찰은 제자리에 고정 occluder에 묶여있다. 스케일 바 = 1 mm이다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg"> Occl 동안 MRI : 그림 2usion는 적절한 일방적 인 상해를 보여줍니다. 전방 급성기 지속적인 허혈 손상과 일치 동측 반구 (화살표)를 포함하는 증가 된 확산을 보여, 후방 90 분 동안 폐색 수행 DW-MRI 화상의 관상 슬라이스한다. 스트로크 (11)의 허가 재판. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg"> 그림 3 : 결과 tMCAO 다음 사주에서 선조체 및 Cortex을 포함 일방적 부상. 후방은 크레 실 바이올렛 염색 코로나 뇌 섹션 P38 동물에서 수확 (각 50 μm의)를 보여 상당히 심각한 부상을 (화살표가 동측 낭종 형성을 보여 대뇌 피질의 감소 및 전방하기P10에서 3 시간의 결과 tMCAO 다음 선조체 볼륨). 왼쪽의 둥근 구멍이 반대쪽 반구 식별자를 나타낸다. 스케일 바 = 5 mm이다. 질병 (12)의 신경 생물학의 허가 재판. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

신생아 뇌졸중은 조기 뇌 손상의 중요한 원인으로, 연구를 위해 일관된 국소 손상 패턴과 높은 재현성을 가진 번역 모델이 필요합니다. 이 연구는 만삭 등가 설치류에서 비출혈성, 편측성 국소 허혈-재관류 손상을 생성하기 위한 자세한 수술 절차를 설명합니다.

P10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

신생아 쥐에서 일시적인 중대뇌동맥 폐색의 전반적인 목표는 만삭 신생아에서 뇌졸중의 번역 모델을 제공하는 것입니다. 이 방법은 발달 중인 뇌의 손상 및 복구 메커니즘을 이해하고 다양한 치료 전략으로 이를 수정할 수 있는 방법을 이해함으로써 신생아 허혈성 뇌 손상 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신생아의 국소 동맥 허혈성 뇌졸중에 대한 생리학적으로 정확한 모델을 제공하고 인간 신생아의 부상 진행에 중요한 부분인 재관류 구성 요소도 포함한다는 것입니다.이 수술의 단계는 배우기가 매우 어려울 수 있기 때문에 이 모델의 시각적 시연이 중요합니다. 동맥 해부학적 구조에 대한 2차원 표현이 쥐의 3차원 분기의 복잡한 특성을 항상 적절하게 보여주는 것은 아닙니다. 강아지의 무게를 측정하여 19g에서 21g 사이인지 확인하는 것으로 시작하십시오.승인된 프로토콜에 따라 흡입된 이소플루란을 사용하여 강아지를 마취한 후 발 꼬집음에 대한 반응이 없는지 확인하십시오. 수술 단계에서 발열 패드를 사용하여 체표면 온도를 유지하십시오. 어깨 부위에 테이프를 붙여 동물을 누운 자세로 고정합니다.멸균 면봉을 사용하여 70% 에탄올로 경추 앞쪽 부위를 면봉으로 닦은 다음 포비돈 요오드 용액을 면봉으로 닦습니다. 다음으로, 0.25%부피바카인을 계획된 절개 부위에 국소적으로 침투시킵니다. 그런 다음 입체경을 통해 작업하는 동안 5-7mm 전방 경추 절개 정중선을 만들어 총경동맥을 노출시킵니다.2-4개의 견인기를 배치하여 캐비티를 열고 동맥을 노출시킵니다. 다음으로 내부 경동맥, 후두 동맥 및 외부 경동맥을 찾습니다. 동맥에서 결합 조직과 지방을 제거하여 명확하게 볼 수 있습니다.6-0 실크 꼰 봉합사 1.5cm를 자른 후 봉합사를 풀어 한 가닥을 빼냅니다. 한 가닥이 깔끔하고 닳지 않았는지 확인하십시오. 봉합사 가닥을 45도 집게 이내로 유지하면서 팁이 ICA와 OA 사이에 나오도록 ICA 아래 호를 그리며 집게를 쓸어냅니다. 그런 다음 봉합사 가닥의 끝을 잡고 끝이 쉽게 접근할 수 있도록 당깁니다.집게에서 가닥을 풀고 ICA 아래에서 집게를 뒤로 빼내어 이전 동작을 반대로 합니다. CCA와 분리되는 위치에서 가장 가까운 기저부에서 ICA 주위에 임시 합자를 묶습니다. ICA를 측면으로 조심스럽게 후퇴시킨 다음 클립을 사용하여 절개 부위 반대쪽의 겨드랑이 영역 근처의 여분의 피부에 후퇴하는 가닥을 고정합니다.다음 단계로 진행하기 전에 수축 가닥이 혈류를 멈출 수 있을 만큼 팽팽한지 확인하십시오. 동맥은 평평하고 창백해야 합니다. 45도 집게를 사용하여 꼰 다른 봉합사 가닥을 잡고 이전과 같이 ICA 아래 및 주위에 고리를 만듭니다.이 스트랜드를 수축 스트랜드의 측면으로 배치합니다. 그런 다음 묶인 합자와 묶이지 않은 합자 사이의 중간에서 0.2mm 동맥 절개술을 묶인 합자에 더 가깝게 자릅니다. 이제 미터법 눈금자를 사용하여 10mm의 실리콘 코팅된 나일론 봉합사를 폐색 봉합사로 측정합니다.재관류 중 제거를 위해 2-3mm의 여유를 두고 봉합사를 절단합니다. 45도 집게로 폐색 봉합사를 잡고 직선 집게를 사용하여 구부리기를 만들어 전진의 정지 지점을 표시합니다. 폐색 봉합사를 동맥 절개술에 공급하여 ECA와 평행하게 머리를 향하게 합니다.구부러진 부분에 도달할 때까지 봉합사를 부드럽게 전진시킵니다. 그런 다음 수축 가닥의 측면에 위치한 가닥을 사용하여 임시 결찰을 묶어 폐색 봉합사를 고정합니다. 견인기 클립을 제거한 다음 두 임시 합자의 가닥을 자르고 매듭을 제거하는 데 사용할 가닥을 조이는 데 사용된 가닥보다 길게 남겨둡니다.견인기를 제거하고 6-0 꼰 실크를 사용하여 캐비티를 닫아 3개 또는 4개의 단속 봉합사를 만듭니다. 강아지를 마취에서 제거하고 실내 공기가 있는 가열 패드에 놓습니다. 강아지가 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 모니터링하고, 댐으로 되돌리기 전에 완전히 회복되었는지 확인하십시오.폐색 중에는 확산 가중 자기 공명 영상(diffusion-weighted magnetic resonance imaging)을 사용하여 적절한 부상 유도를 확인할 수 있습니다. 이 이미지는 일시적인 MCAO 동안 DW-MRI에 의해 감지된 화살표로 표시된 진행 중인 허혈성 손상을 보여줍니다. MCA의 폐색 후에 대략 2 시간 50 분, 외과 물자를 준비하고, 그 후에 전과 같이 마취에 의하여 재관류 절차를 시작하십시오.중단된 봉합사를 제거하고 두 개의 합자와 폐색 봉합사의 꼬리 끝으로 표시된 접합부를 찾습니다. 더 긴 가닥을 당겨 임시 결속의 가장 측면 매듭을 조심스럽게 풀고 구멍에서 봉합사 가닥을 제거합니다. MCA 폐색 후 정확히 3시간 후에 폐색 봉합사를 동맥 밖으로 천천히 빼냅니다.저항이 없어야 합니다. 겸자를 사용하여 동맥 절개술에 압력을 가한 다음 내측 매듭을 조심스럽게 풀어 혈류를 회복시킵니다. 몸에서 봉합사 가닥을 제거한 후 동맥 절개술에 지혈제를 바르면 출혈이 멈춥니다.동맥의 원래 모양과 붉은색이 돌아온 것은 ICA 혈류가 회복되었음을 확인시켜줍니다. 견인기를 제거하고 6-0 꼰 실크를 사용하여 캐비티를 닫아 3개 또는 4개의 단속 봉합사를 만듭니다. 강아지를 마취에서 제거하고 집 케이지로 되돌리기 전에 이전과 같이 모니터링을 통해 회복하도록 합니다.5일 동안 매일 새끼를 검사하십시오. 체중을 기록하고 절개 부위를 면밀히 검사하여 적절한 치유가 이루어지고 있는지 확인하십시오. P-38 동물에서 채취한 이 후방에서 전방까지의 50미크론 크레실 바이올렛 염색 관상 뇌 절편은 P-10에서 3시간 동안 TMCAO를 실시한 후 상당히 심각한 손상을 입었습니다.화살표는 동측 낭종 형성과 피질 및 선조체 부피 감소를 나타냅니다. 왼쪽의 둥근 구멍은 반대쪽 반구 식별자를 나타냅니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 절차는 개념적으로는 간단하지만 성공과 숙달에는 최적화와 연습에 몇 시간이 걸릴 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.마스터하면 폐색은 10분 이내에 완료할 수 있으며 재관류는 5분 이내에 완료할 수 있습니다.

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연구

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의학

쥐에서 허혈성 뇌 손상 외과 유도는 뇌졸중 연구 널리 사용되는 모델입니다. 여기서 우리는 중간 대뇌 동맥의 폐색에 의해 초점 대뇌 국소 빈혈의 유도를 보여줍니다. histological 얼룩 및 자기 공명 영상에 의해 발생하는 경색의 시각화도 표시됩니다.

쥐 중간 대뇌 동맥의 폐색의 Endovascular 봉합사에 의해 초점 대뇌 국소 빈혈 모델

우리는 비디오 intraluminal monofilament를 사용하여 성인 마우스의 중간 대뇌 동맥 폐색을 생산하는 방법을 보여줍니다. 또한 2,3,5 - triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 염색법에 의해 대뇌 경색의 범위를 평가하는 방법을 보여줍니다.

중간 대뇌 동맥 폐색의 마우스 모델

출처: Larpthaveesarp, A., et. al입니다. P10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 모델. J. Vis. 특급. (2017)이 비디오는 새끼 쥐에서 Middle Cerebral Artery Occlusion 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. 내부 경동맥(ICA)이 노출되고 결찰자가 고정되어 혈액 범람을 제한합니다. 폐색은 ICA를 통해 삽입되어 중대뇌동맥에 도달합니다. 그런 다음 추가 분석 전에 강아지가 회복할 수 있습니다.

국소 뇌허혈을 유발하기 위해 새끼 쥐에서 중대뇌동맥 폐색을 생성하는 것

우리는 설치류의 주요 뇌 혈관의 영구 폐색에 대한 높은 재현성 방법을 설명합니다. 이 기술은 거의 주변의 손상을 최소화 혈액 손실, 장기 생존의 높은 속도, 인간의 임상 인구에 상응하는 일관된 경색 볼륨을 수행 할 수 있습니다.

영구적 인 뇌 혈관 폐색<em&gt;를 통해</em&gt; 더블 합자 및 절개

중대 뇌동맥 폐색 (MCAO)의 다양한 쥐 모델은 널리 실험 뇌 연구에 사용됩니다. 여기서 우리는 인간의 허혈성 뇌졸중의 대다수에 의해 부과 된 손상에 해당하는 크기의 일관성있는 대뇌 피질의 경색을 생산 두개 영구 원심 MCAO의 모델을 보여줍니다.

마우스의 모델링 스트로크 : 말초 중간 대뇌 동맥의 영구 응고

중간 대뇌 동맥 폐색의 다른 모델 (MCAo) 실험 적인 뇌졸중 연구에 사용 됩니다. 여기서, 외부 경동맥(ECA)을 통한 과도 MCAo의 실험적인 뇌졸중 모델이 기술되며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는 치료로 인해 뇌혈관 혈전이 제거되는 인간의 뇌졸중을 모방하는 것을 목표로 한다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 외부 경동맥을 통한 일시적인 중간 뇌동맥 폐색

이 프로토콜은 중간 크기의 경색과 우수한 생존율을 가진 독특한 마우스 스트로크 모델을 보여줍니다. 이 모델을 통해 전임상 뇌졸중 연구자는 허혈 기간을 연장하고, 노령 마우스를 사용하고, 장기적인 기능적 결과를 평가할 수 있습니다.

늙은 쥐의 뇌졸중 결과를 연구하기 위해 수정된 경두개 중뇌동맥 폐색 모델

이 프로토콜은 중뇌동맥의 내강 내 폐색을 통한 마우스의 일시적인 국소 대뇌 허혈 모델을 설명합니다. 또한 자기 공명 영상 및 행동 테스트를 사용하여 결과 평가의 예를 보여줍니다.

뇌졸중의 일시적인 중뇌동맥 폐색 모델

현재 프로토콜은 손상을 입히지 않고 뇌 혈관의 해부학적 구조를 보존하는 중대뇌 동맥 폐색/재관류의 쥐 모델을 설명합니다.

대뇌 혈관의 해부학적 구조를 손상시키지 않고 중간 대뇌 동맥 폐색/재관류의 쥐 모델

본 연구의 목적은 쥐에서 두개골 절제술 후 영구적이고 선택적인 중뇌동맥 폐색을 수행하는 재현 가능한 방법을 확립하여 운동 및 공간 기억 결손에 대한 실험 연구에 적용하는 것이었습니다.

쥐의 중뇌동맥 선택적 및 영구 폐색: 운동 및 공간 기억 결손 연구를 위한 실험적 접근법

배우세요 신생아 뇌졸중 연구를 위한 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델을 P10 쥐에서 수행하는 방법을. 이 기법은 허혈성 뇌 손상 메커니즘과 치료 전략 탐구에 필수적인 생리학적으로 정확한 번역 모델을 제공합니다.

P10 쥐에서 신생아 뇌졸중의 과도 중간 대뇌 동맥 폐색 모델

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