Name: 된 유의 메틸화 측정 INS 바이오 마커 작은 섬의 β 세포 죽음 등 인간의 혈청 샘플에서 DNA 종 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 학습하세요 인간 혈청에서 디지털 PCR을 이용해 INS DNA 메틸화 차이를 측정하여 β세포 사멸을 바이오마커로 감지하는 방법입니다. 이 기술은 제1형 당뇨병 조기 진단에 활용됩니다.

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 UC4 DK104166(RGM으로)의 지원을 받았습니다. 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 P30 DK097512의 지원을 받는 인디애나 당뇨병 연구 센터(Indiana Diabetes Research Center) 번역 핵심(Translation Core)의 도움에 감사드립니다.

윤리 선언문: 프로토콜은 인디애나 대학교 기관 검토 위원회(Indiana University Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 피험자의 부모는 서면 동의서를 제공했으며, 7세 이상의 아동은 참여에 동의했습니다.
1. 혈청 가공
참고: 설명된 분석은 다음과 같이 분리된 인간 혈청을 사용하여 엄격하게 테스트되었습니다.
<ol>
	<li>하나의 빨간색 상의(무첨가, 코팅되지 않은) 혈액 채취 튜브에 혈액을 수집합니다.</li>
	<li>혈전이 형성될 수 있도록 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.</li>
	<li>2,000 x g의 원심분리기 튜브를 실온에서 10분 동안 사용합니다. 상층액(혈청)을 혈청 보관용으로 지정된 새 튜브(폴리프로필렌 나사 상단 튜브, 샘플에 따라 크기에 따라 다름)로 옮깁니다.</li>
	<li>DNA 분리가 준비될 때까지 -80ºC에서 샘플을 보관하십시오.</li>
</ol>
2. 혈청 DNA 추출
참고: DNA는 50μl의 혈청(권장)을 사용하는 DNA 추출 키트로 추출되며, 일부 수정이 가해진 제조업체의 프로토콜에 따릅니다.
<ol>
	<li>마이크로 원심분리 튜브에 시료당 200μl 용해 완충액 + 1μl 폴리(A)(5μg)를 준비합니다. 15초 동안 소용돌이 2.3단계까지 따로 보관하십시오.</li>
	<li>-80ºC 냉동고에서 혈청 샘플을 채취하여 실온에서 해동합니다. 인산염 완충 식염수(PBS, 염화칼슘 및 염화마그네슘 포함)를 사용하여 총 200μl의 혈청 시료량을 가져옵니다.</li>
	<li>샘플에 20μl 프로테아제(1.4 Anson units/ml)를 첨가한 다음 200μl 용해 버퍼/폴리A 혼합물(단계 2.2)과 8초 동안 볼텍스를 첨가하여 샘플을 용해합니다.56°C에서 10분 동안 샘플을 배양한 다음 마이크로 원심분리기(>10,000 x g)에서 최고 속도로 7초 동안 잠시 원심분리합니다.</li>
	<li>샘플에 230μl, 100% 에탄올을 첨가하고 8초 동안 와류를 일으켜 DNA를 침전시킵니다. 최고 속도(>10,000 x g)로 7초 동안 짧게 원심분리합니다.</li>
	<li>미니 스핀 컬럼에 600μl 샘플 혼합물을 추가하여 DNA를 스핀 컬럼에 적용합니다. 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 플로우스루(flow-through)를 버리고 깨끗한 튜브에 컬럼을 넣습니다.</li>
	<li>컬럼에 500μl 세척 완충액 1을 추가하여 DNA를 세척합니다. 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리기 플로우스루(flow-through)를 버리고 깨끗한 튜브에 컬럼을 넣습니다. 500μl의 세척 버퍼 2를 컬럼에 추가하고 최고 속도(>10,000 x g)로 3분 동안 원심분리합니다. 새 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣고 다시 1분 동안 최고 속도로 원심분리합니다.</li>
	<li>새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 컬럼을 넣고 필터에 직접 60μl 용리 완충액을 추가하여 DNA를 용리합니다. 교차 오염을 방지하기 위해 시료 간에 팁을 전환하는 것이 중요합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. 60μl의 용리 완충액을 추가로 추가하고 6,000 x g에서 1분 동안 원심분리합니다. </li>
	<li>나중에 사용할 수 있도록 DNA를 -20ºC에 보관하거나 즉시 중아황산염 전환을 진행하십시오.</li>
</ol>
3. 중아황산염 변환
참고: 중아황산염 변환은 중아황산염 변환 키트를 사용하여 수행되며, 제조업체의 프로토콜에 따라 약간의 수정이 가해집니다.
<ol>
	<li>메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 전환하려면 PCR 튜브(단일 0.2ml PCR 튜브 또는 8-스트립 PCR 튜브)에서 2.7단계의 DNA 20μl에 130μl의 중아황산염 전환 시약을 추가합니다. 나중에 사용하거나 복제 반응에 사용할 수 있도록 나머지 40μl의 DNA를 저장하십시오. 위아래로 피펫팅하여 20회 혼합하고 짧게 원심분리하여 측면이나 뚜껑에 방울이 떨어지지 않도록 합니다. 다음과 같이 수조 또는 열 순환기에서 배양하십시오 : 98 ° C 8 분 동안, 54 ° C 60 분, 4 ° C 5 분 동안.
	<ol>
		<li>3.2단계로 진행하거나 4°C에서 최대 20시간 동안 보관하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>600μl의 결합 완충액을 스핀 컬럼에 추가하고 제공된 수집 튜브에 컬럼을 놓습니다. bisulfited DNA를 컬럼에 적용하고 위아래로 10회 피펫팅하여 혼합합니다. 최고 속도(>10,000 x g)에서 30초 동안 원심분리기 폐기 플로우 스루(flow through) 폐기.</li>
	<li>컬럼에 세척 완충액 100μl를 첨가하고 최고 속도(>10,000 x g)로 30초 동안 원심분리기하여 DNA를 세척합니다.</li>
	<li>컬럼에 200μl의 탈sulphonation buffer를 추가하여 unmethylated cytosine의 uracil로의 전환을 완료하기 위해 desulphonation을 수행합니다. 실온에서 20분 동안 그대로 두었다가 최고 속도(>10,000 x g)로 30초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>컬럼에 200μl의 세척 버퍼를 첨가하여 DNA를 세척하고 30초 동안 최고 속도로 원심분리합니다. 플로우 스루(flow-through)를 폐기하고 이 세척 단계를 반복합니다.</li>
	<li>컬럼을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 10μl 용리 완충액을 컬럼 필터에 직접 첨가하여 DNA를 용리합니다. 1분 동안 배양합니다. DNA를 용리하기 위해 최고 속도로 30초 동안 원심분리기를 사용합니다. A260. 
	참고: 분광광도계로 검출된 DNA는 주로 위의 2.3단계에서 추가된 캐리어 polyA DNA를 나타냅니다. 일반적으로 polyA의 회수율은 입력의 ≥85%(>4.25μg)입니다.</li>
	<li>디지털 PCR을 진행할 준비가 될 때까지 DNA를 -20°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>
4. 멀티플렉스 디지털 PCR
<ol>
	<li>각 시료 및 대조군에 충분한 용액으로 마스터 믹스를 만듭니다. 물을 함유한 시료 1개 이상(음성 대조군), 메틸화되지 않은 INS를 함유한 플라스미드 시료 1개(1pg, 양성 대조군), 메틸화 INS를 함유한 플라스미드 시료 1개(1pg, 양성 대조군) 및 플라스미드의 1:1 혼합물을 함유한 시료 1개를 포함합니다.
	<ol>
		<li>PCR 마스터 믹스를 준비하기 위해, PCR 완충액의 반응당 12.5 μl(예: 10 샘플당 125 μl), 반응 프라이머/프로브 믹스당 1.25 μl(예: 10 샘플당 12.5 μl), 반응수 당 8.25 μl(예: 10 샘플당 82.5 μl), 반응 EcoR1 효소당 0.5 μl(예: 10개 샘플당 5μl). 
		참고: 여기에 사용된 프라이머 및 프로브는 다음과 같습니다: 포워드 프라이머: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTAGTTTTTTTGT-3'; 리버스 프라이머: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; FAM 프로브: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; VIC 프로브: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>96웰 플레이트에서 멀티플렉스 PCR 반응을 설정합니다. 각 웰에 마스터 믹스 19.5μl를 추가합니다. 2.5 μl의 중아황산염 변환 DNA 샘플을 각각의 적절한 웰에 추가합니다 (나머지 7.5 μl의 중아황산염 변환 DNA를 저장하거나 복제 반응에 사용). 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 
	알림: 행의 모든 8개의 웰에는 s가 포함되어야 합니다.amp르 또는 버퍼 제어.</li>
	<li>우물 측면에 액체가 없을 때까지 플레이트 실러와 플레이트 스피너에서 원심분리기를 사용하여 호일 씰로 밀봉합니다.</li>
	<li>터치스크린에서 자동 액적 생성기를 설정합니다. 
	알림: 카트리지의 모든 8개 웰에는 s가 포함되어야 합니다.amp르 또는 버퍼 제어.
	<ol>
		<li>4.2단계에서 96웰 플레이트에서 샘플이 로드되는 행을 터치하여 사용 중인 행 수를 설정하고 행을 파란색으로 강조 표시하여 활성 행을 나타냅니다.</li>
		<li>오염을 방지하기 위해 소모품을 뒤에서 앞으로 적재하십시오. 시작하려면 기기의 뒷줄을 따라 카트리지를 추가합니다. 기기의 중앙 줄에 팁을 로드합니다. 
		알림: 카트리지는 올바른 방향으로만 홀더에 들어갈 수 있습니다.</li>
		<li>96웰 플레이트를 기기에 놓습니다. -20 °C 냉동고에서 콜드 블록을 제거하고 새 스커트 96웰 플레이트를 놓습니다. 기기 내부에서 시료가 주입된 96웰 플레이트 옆에 놓습니다.</li>
		<li>기기 전면에 있는 디스펜서에 오일을 추가합니다. 터치스크린에서 오일 유형을 선택합니다.</li>
		<li>파란색 시작 버튼을 터치하여 실행을 시작합니다. 플레이트 설정을 확인하고 실행 시작 버튼을 터치하여 시작합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>완료되면 새로 형성된 액적이 포함된 96웰 플레이트를 제거하고 플레이트 실러를 사용하여 호일 씰로 밀봉합니다.</li>
	<li>뒤에 오는 프로그램을 사용하여 열 cycler에 PCR10를 실행하십시오: 10:00 분 동안 95 °C; 40 주기: 00:30 분 동안 94 °C, 01:00 분 동안 57.5 °C, 10:00 분 동안 98 °C, 10 분 동안 12 °C 또는 24 시간까지.</li>
	<li>액적 판독기에 플레이트를 놓고 판독기를 설정합니다.
	<ol>
		<li>설정 탭을 클릭합니다. Template > new(새로 만들기)를 클릭하여 새 템플릿을 엽니다. 파일 이름을 입력합니다.</li>
		<li>웰 편집기를 사용하여 각 샘플에 대한 매개변수를 설정합니다. 각 샘플에 고유한 이름을 지정하고, 실험을 R-RED(R-RED)로 설정하고, 마스터 믹스를 4.1단계에서 사용된 믹스로 설정합니다.</li>
		<li>타겟 1에 이름(즉, 메틸화되지 않음)을 부여하고 타겟 1을 알 수 없음(U)으로 설정합니다. 타겟 2에 이름(즉, 메틸화)을 지정하고 타겟 2를 참조(R)로 설정합니다.</li>
		<li>실행 탭을 클릭하여 실행을 시작합니다. 실행 옵션 창에서 검출 화학(FAM/VIC)을 선택합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 데이터 분석
<ol>
	<li>분석 탭에서 결과를 열고 양성 대조군을 기반으로 하는 2차원 플롯을 사용하여 분석합니다(그림 1 참조).</li>
	<li>데이터 분석을 위해 드롭릿 리더에서 생성된 CSV 파일을 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다.</li>
	<li>혈청의 "μl당 사본"을 생성하려면 (농도*250)/(DNA 분리에 사용되는 혈청의 부피(μl)) 공식을 사용하십시오. 6 
	참고: 데이터는 일반적으로 정규 분포를 보장하기 위해 인간 혈청에서 획득할 때 로그10으로 변환됩니다. 또는 데이터를 로그10 척도에 표시하고 비모수 통계량으로 분석할 수 있습니다.</li>
</ol>
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</style>

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<li>Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+beta-cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).</li>
<li>Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+immunobiology+to+%CE%B2-cell+biology%3A+the+changing+perspective+on+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes.</a> Islets. 6 (2), 28778(2014).</li>
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</ol>

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DNA의 methyltransferases에 의해 시토신의 메틸화는 많은 유전자의 전사의 후생 유전 학적 제어 할 수 있습니다. 인간의 INS 유전자는 거의 독점적으로 세포 β 섬으로 표현, 그 전사 (11)의 침묵에 INS 유전자의 시토신 메틸화의 주파수 사이의 상관 관계가있을 나타납니다. 13 - 따라서, 대부분의 세포 유형은 세포를 11 β에 비해 다양한 사이토에서 INS 유전자의 메틸화가 실질적으로 높은 주파수를 나타낸다. 이는 β 세포 사멸의 빈도가 DNA 12 해방 β 세포 죽음에서 크게 발생하는 것이다 무 세포 INS 메틸화 DNA의 혈청 농도의 분석에 의해 모니터링 될 수 있다고 제안되었다. 바이 설 파이트 반응은 14 변경 메틸화 된 시토신을 떠나, 우라실에 비 메틸화 된 시토신 ...

제 1 형 당뇨병 (T1D)은 자기 반응성 T 세포를 1 β 세포의 인슐린 - 생성 췌장의 파괴를 특징으로하는자가 면역 질환이다. T1D의 진단은 일반적으로 인슐린 결핍의 증거로 케톤 산증으로 야기 될 수 있습니다 린, 젊은 개인에 고혈당 (혈당&gt; 200 밀리그램 / DL)의 측정에 따라 이루어집니다. T1D의 진단시, β 세포 기능 및 질량의 상당한 감소에 대한 증거가있다 (50 - 90 %)이. 임상 연구에서, 진단시 제정 된 여러 면역 조절 성 약물, 질병의 임상 적 관해 이어질 β 세포 기능 (그리고 아마도 질량), 그러나 아무도의 안정화 개발을위한 전화를 제기 한 연구 결과를 초래 질병의 초기 탐지와 대한 바이오 마커의 조합의 효과의 길이 추적 3,4 치료. 국제 컨소시엄의 노력, 이러한히스 (5)의 국립 연구소에서 인간의 작은 섬 연구 네트워크 컨소시엄이야, T1D의 β 세포 스트레스와 죽음에 초점 바이오 마커의 개발 필요성을 강조했다. 9 - 이러한 노력에 맞춰, 우리 그룹 등 최근 β 세포 6 죽어 주로 발생, 후 성적 변형 된 DNA 조각을 순환 측정 바이오 마커 분석을 개발했다. 지금까지 발표 된 검정 모두에서, 초점이 다른 세포 유형에 비해 코딩 및 프로모터 영역의 비 메틸화 된 CpG 부위의 큰 정도를 보여주는 인간 유전자 부호화 preproinsulin (INS)의 정량에있다. 메틸화 INS DNA 단편의 해방은 (괴사, 세포 사멸) β 세포를 죽음에서 주로 발생으로 가정 하였다. 우리의 최근의 연구는 청소년, 위치 -69 bp의에서 메틸화 및 메틸화 모두 INS의 DNA에 고도는 (상대가 마에 것으로 나타났다그는 새로운 발병 T1D에서 관찰되었다) 사이트를 시작, 함께이 인구 6과 같은 특정 바이오 마커를 제공 전사. 이러한 바이오 마커 분석이 분리 된 DNA의 중아 변환 다음에 상용 스핀 키트를 사용하여 혈청 또는 혈장에서 무 세포 DNA의 분리를 포함 (우라실에 비 메틸화 된 시토신을 변환하는 그대로 메틸화 된 시토신을 떠나). 이 보고서에서 우리는 차별적 메틸화 INS DNA에 대한 혈청 샘플 수집, 혈청에서 무 세포 DNA, 중아 변환 및 (이제부터는, 디지털 PCR) 방울 디지털 PCR의 성능 분리의 기술적 측면에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>레드 탑 Vacutainer&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>첨가제 없음, 코팅되지 않은 내부, 10ml</td></tr><tr><td>극저온 튜브</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>폴리프로필렌, 나사 캡 튜브, 모든 크기의</td></tr><tr><td>QIAamp DNA 혈액 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>TE 버퍼(10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA)에서 5 &micro; g/&마이크로; 엘&nbsp;</td></tr><tr><td>절대 에탄올 (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (CaCl2 및 MgCl2 포함)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8-strip Tubes</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8-strip Caps, Dome</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화-라이트닝 키트</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>프로브용 ddPCR Supermix(dUTP 없음)</td><td>프로브용 Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 제어</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>피어싱 가능한 호일 열 밀봉</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 씰러</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG 액적 디지털 PCR 시스템</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>프로브용 자동 액적 생성 오일</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>자동 액적 발생기용 DG32 카트리지</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>자동 액적 발생기를 위한 피펫 팁</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>자동 액적 발생기용 피펫 팁 빈</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 터치 열 순환기</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 액적 판독기</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 액적 판독기 오일</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

된 유의 메틸화 측정<em&gt; ins</em&gt; 바이오 마커 작은 섬의 β 세포 죽음 등 인간의 혈청 샘플에서 dna 종

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

섬 β 세포의 사멸은 거의 모든 형태의 당뇨병의 발병 기전의 기저에 있는 것으로 생각되며, 특히 제1형 당뇨병에서 솔직한 고혈당증의 발병에 선행하는 것으로 생각됩니다. β세포 사멸에 대한 민감하고 신뢰할 수 있는 바이오마커의 개발은 당뇨병의 발병을 예방하거나 지연시키기 위한 조기 치료 개입을 가능하게 할 수 있습니다. 최근, 우리 자신을 포함한 여러 그룹에서는 혈액 순환 중 프리프로인슐린(INS)을 인코딩하는 세포가 없고 차등적으로 메틸화된 DNA가 1형 당뇨병 전단계 당뇨병 및 새로 발병하는 1형 당뇨병의 세포 사멸β 상관관계가 있다고 보고했습니다. 여기에서는 -69bp 위치(전사 시작 부위 기준)의 시토신에서 차등 메틸화되는 cell-free INS DNA를 측정하기 위해 디지털 PCR을 사용하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 당사는 이 분석법이 -69bp 위치에서 메틸화된 시토신과 메틸화되지 않은 시토신을 구별할 수 있고, 여러 자릿수에 걸쳐 선형이며, DNA 복제 수의 절대 정량화를 제공하고, 새로 발병한 제1형 당뇨병 및 무질병 대조군을 가진 개인의 인간 혈청 샘플에 적용할 수 있음을 입증합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 순환 또는 분리된 세포 및 조직에서 차등적으로 메틸화된 사이토신의 검출이 필요한 모든 DNA 종에 적용할 수 있으며 DNA 단편의 절대 정량화를 제공할 수 있습니다.

적절하게 데이터를 해석하기 위해, 우리는 각 디지털 PCR 실행의 메틸화 및 메틸화 대상 INS의 DNA 모두 플라스미드 컨트롤을 사용합니다. 이러한 컨트롤은 메틸화 및 비 메틸화 된 DNA에 대응하는 신호가 명확하게 구별되어 있는지 확인하십시오. 도 1은 바이 설 파이트 변환 메틸화 INS DNA (도 1a)를 포함하는 플라스미드 컨트롤 메틸화 INS DNA (도 1b)에 대한 물방울에 대응하는 2-D 산점도를 나타내고, 1 개의 플라스미드 (도 1C) 1 혼합물. 메틸화 INS를 포함하는 플라스미드 플라스미드는 INS가 VIC 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다 메틸화 함유하는 반면, 6 카르복시 (FAM) 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다. 1 년 : ...

Islet β 세포 사멸은 제1형 당뇨병의 발병보다 먼저 발생하며, 이 과정을 감지하면 조기 치료 개입이 가능할 수 있습니다. 여기에서는 세포 사멸의 바이오마커로서 인간 혈청에서 차등 메틸화된 INS DNA 종을 측정하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다β.

된 유의 메틸화 측정<em&gt; INS</em&gt; 바이오 마커 작은 섬의 β 세포 죽음 등 인간의 혈청 샘플에서 DNA 종

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

본 절차의 전반적인 목적은 베타 세포 사멸의 바이오마커로서 인간 혈청 내의 차등 메틸화된 preproinsulin DNA 종을 측정하는 것입니다. 이 방법은 제1형 당뇨병의 진행 과정 중 특정 시점에 베타 세포 사멸이 일어나고 있는가와 같은 당뇨병 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 디지털 PCR을 활용함으로써 매우 적은 양의 혈청에서도 베타 세포 사멸량을 결정할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 인간 혈액 샘플에서 혈청을 수집한 후, 마이크로원심분리 튜브에 샘플당 200 µL의 lysis buffer와 1 µL의 poly(A)를 준비합니다. 튜브를 15초 동안 볼텍싱합니다. -80 °C 냉동고에서 혈청 샘플을 꺼내어 실온에서 해동합니다.그 다음, PBS를 사용하여 혈청 시료의 부피를 200 µL로 맞춥니다. 프로테아제 20 µL와 lysis buffer poly(A)mix 200 µL를 첨가하여 시료를 용해합니다. 튜브를 8초 동안 볼텍싱하고 시료를 56 °C에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음, 튜브를 최고 속도로 7초 동안 원심 분리합니다. 시료에 100% ethanol 230 µL를 첨가하여 DNA를 침전시키고, 튜브를 8초 동안 볼텍싱합니다. 그 후, 튜브를 최고 속도로 7초 동안 원심 분리합니다.다음으로, 600 µL의 시료 혼합물을 스핀 컬럼에 분주하고 6000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 통과액을 버리고 컬럼을 깨끗한 튜브에 옮깁니다. 컬럼에 500 µL의 wash buffer one을 첨가하고 시료를 6000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다.그 후, 통과액을 버리고 컬럼을 깨끗한 튜브에 넣습니다. 컬럼에 wash buffer two 500 µL를 첨가하고 최고 속도로 3분 동안 원심분리합니다. 그다음, 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 다시 1분 동안 회전시킵니다.DNA를 용출시키기 위해, 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 필터에 용출 버퍼 60 µL를 직접 첨가합니다. 컬럼을 상온에서 5분 동안 배양한 후, 샘플을 6000 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 컬럼은 폐기하고, 비설파이트 전환 단계 전까지 샘플을 보관합니다.메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변환하기 위해, PCR 튜브에 담긴 20 µL의 DNA에 130 µL의 비설파이트 변환 시약을 추가합니다. 파이펫팅으로 샘플을 20회 섞어준 뒤, 튜브 벽면이나 뚜껑에 액체 방울이 맺혀 있지 않도록 짧게 원심 분리합니다. 여기에 표시된 대로 항온수조 또는 써멀 사이클러에서 샘플을 배양합니다.제공된 수집 튜브에 컬럼을 배치하고 스핀 컬럼에 binding buffer 600 µL를 추가합니다. 비설파이트 처리된 DNA를 컬럼에 넣고 피펫팅으로 10회 섞어줍니다. 그 후, 샘플을 최대 속도로 30초 동안 원심분리하고 통과액을 제거합니다.다음으로, 컬럼에 세척 버퍼 100 µL를 넣고 30초 동안 원심분리합니다. 그 후, 메틸화되지 않은 사이토신을 우라실로 변환하는 과정을 완료하기 위해 설피네이트기를 제거하고자, 컬럼에 탈설피네이션 버퍼 200 µL를 넣습니다. 샘플을 상온에서 20분 동안 방치한 후, 컬럼을 30초 동안 원심분리합니다.컬럼에 세척 버퍼 200 µL를 넣고 30초 동안 원심 분리하여 DNA를 세척합니다. 그 후, 통과액을 버리고 세척 단계를 반복합니다. 컬럼을 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 컬럼 필터에 용출 버퍼 10 µL를 직접 첨가하여 DNA를 용출합니다.샘플을 1분 동안 배양한 후, 30초 동안 원심 분리하여 DNA를 용출합니다. 컬럼은 폐기하고 샘플을 보관합니다. 260nm의 흡광도에서 분광 광도법을 통해 회수된 DNA의 양을 정량합니다.각 샘플과 대조군에 충분한 양의 용액으로 마스터 믹스를 제조하십시오. 물을 포함하는 샘플 하나, 메틸화되지 않은 인슐린을 포함하는 플라스미드 샘플 하나, 그리고 플라스미드가 1:1 비율로 혼합된 샘플 하나를 반드시 포함하십시오. 96-웰 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 19.5 µL를 먼저 분주하여 멀티플렉스 PCR 반응을 준비하십시오.적절한 웰에 bisulfite 변환 DNA 샘플 2.5 µL를 첨가합니다. 그런 다음, 피펫팅을 여러 번 반복하여 웰 내부를 혼합합니다. 호일과 플레이트 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 웰 벽면에 액체가 남지 않을 때까지 플레이트 스피너로 원심분리합니다.터치스크린에서 자동 드롭렛 생성기를 설정하려면, 플레이트 웰에 샘플이 로드된 행을 터치하여 사용 중인 행의 수를 설정하십시오. 오염을 방지하기 위해 기기 뒷줄의 카트리지부터 시작하여 소모품을 뒤에서 앞으로 로드하십시오. 그 다음, 중앙 행에 팁을 로드하십시오.다음으로, 96-웰 플레이트를 기기에 넣습니다. 그런 다음, -20 °C 냉동고에서 콜드 블록을 꺼내어 새로운 스커트형 96-웰 플레이트를 그 안에 넣습니다. 플레이트가 담긴 블록을 샘플 플레이트 옆의 기기 내부에 삽입합니다.기기 전면에 있는 디스펜서에 오일을 추가하고 터치스크린에서 오일 종류를 선택하십시오. 파란색 Start 버튼을 터치하여 작동을 시작합니다. 그런 다음 플레이트 설정을 확인하고 Start Run 버튼을 터치하여 분석을 시작하십시오.런이 완료되면 새로 형성된 액적(droplet)이 포함된 96-웰 플레이트를 꺼내 플레이트 실러를 사용하여 포일로 밀봉합니다. 이제 다음 프로그램을 사용하여 서멀 사이클러에서 PCR을 수행하십시오. 플레이트를 액적 판독기 위에 놓고 Setup 탭을 클릭하여 판독기를 설정합니다.그 다음, Template New를 클릭하여 새 템플릿을 엽니다. 웰 에디터를 사용하여 각 샘플의 파라미터를 설정하십시오. 각 샘플에 고유한 이름을 지정하십시오.실험 설정을 Rare Event Detection으로 지정하고, 마스터 믹스를 반응 준비에 사용된 믹스로 설정하십시오. Target 1에 Unmethylated와 같은 이름을 부여하고, Target 1을 unknown 또는 U로 설정하십시오. Target 2에 Methylated와 같은 이름을 부여하고, Target 2를 reference 또는 R로 설정하십시오. Run 탭을 클릭하여 실행을 시작하고 파일 이름을 입력하십시오. 그다음, Run Options 창에서 검출 화학물질을 선택하십시오.데이터를 분석하려면 Analyze 탭에서 결과물을 열고, 양성 대조군 기반의 2D 플롯을 사용하여 데이터를 분석하십시오. 이 그림은 비설파이트 처리된 비메틸화 인슐린 DNA, 메틸화 인슐린 DNA, 그리고 이 두 플라스미드가 1:1로 혼합된 시료를 포함하는 플라스미드 대조군 드롭렛에 해당하는 2D 산점도를 보여줍니다. 이 패널에서 FAM 양성 드롭렛이 VIC 채널 방향으로 약간 이동한 것을 확인할 수 있으며, 이는 메틸화 인슐린 DNA용 프로브를 나타냅니다.마찬가지로, FAM 채널에서 VIC 양성 액적(droplet)이 아주 약간 이동하는 것을 볼 수 있으며, 이는 비메틸화 DNA용 프로브가 메틸화 DNA와 교차 반응함을 나타냅니다. 프라이머의 선형성을 입증하기 위해, 수 자릿수(order of magnitude) 범위에 걸쳐 두 플라스미드를 혼합하여 PCR 반응에 사용하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, 두 번째 플라스미드가 일정량 존재하는 상태에서 한 가지 플라스미드의 농도 변화를 선형적으로 검출할 수 있습니다.이 그림에서는 신규 발병 제1형 당뇨병 환자 4명과 제1형 당뇨병이 없는 대조군 4명의 샘플을 분석하였습니다. 데이터에 따르면, 이전에 보여준 바와 같이 제1형 당뇨병 환자는 대조군에 비해 비메틸화 및 메틸화 인슐린 DNA 수치가 모두 높게 나타납니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 30개 샘플을 8시간 이내에 분석할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안 모든 단계에서 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 이 기술이 개발된 이후, 당뇨병 분야의 연구자들은 제1형 당뇨병 발생의 바이오마커로서 이 기술의 활용 가능성을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 인간 혈청의 cell free DNA에서 비메틸화 및 메틸화된 preproinsulin을 측정하여 베타 세포 사멸량을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.DNA 추출 버퍼를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 장갑과 실험복을 착용하고 표백제가 포함된 소독제를 사용하지 않는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

이 비디오는 인간 혈청에서 섬 자가항체의 전기화학발광 검출을 보여줍니다. 혈청의 항체는 루테늄 접합 항원을 비오틴화 포획 항원에 연결하여 전기화학발광 측정으로 검출되는 복합체를 형성합니다.

전기화학발광 분석을 사용한 human islet 자가항체 검출

레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.

수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜

우리는 여기에서 제2형 당뇨병의 마우스 모델, Leprdb에서 섬을 분리하기 위한 프로토콜과 2개의 광자 현미경을 사용하는 온전한 섬에서 인슐린 분비를 측정하기 위한 라이브 셀 분석의 세부 정보를 제시합니다.

Lepr<sup&gt; DB</sup&gt; 2 형 당뇨병의 마우스 모델 : 본래 독도 췌장 섬 세포의 분리 및 라이브 셀 2 광자 이미징

여기, 우리는 인간의 섬 자가 electrochemiluminescence (ECL) 분석 실험을 사용 하 여 검색 하는 방법을 제시. 타입 1 당뇨병을 예측 하는 데 사용 되는 프로토콜 자가 다른 자가 면역 질환에 대 한 검색에 따라 확장할 수 있습니다.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

췌 장 섬 연구 비보 전 당뇨병 연구에 대 한 중요 하다. 기존 기술을 그들의 네이티브 3 차원 건축 교양된 독도 공부 시간이 소요, 비효율적이 고, 자주 사용 됩니다. 이 작품 전체 교양된 독도의 높은-품질 파라핀 섹션을 생성 하기 위한 새로운 간단 하 고 효율적인 방법을 설명 합니다.

췌 장 섬 파라핀 섹션에 대 한 포함

여기서, 우리는 액적 기반 의 미세 유체 단일 세포 RNA 염기서열 분석 기술을 사용하여 단면 췌도로부터 단일 세포의 고품질, 대규모 전사체 데이터를 생성하는 프로토콜을 제시한다.

단세포 RNA 시퀀싱 및 인간 췌장 섬 분석

이 연구는 췌장섬에서 사이토카인 유도 세포사멸 및 세포 특이적 사멸을 평가하기 위해 컨포칼 현미경과 결합된 세포 사멸 및 세포자멸사에 대한 다중 염색 형광 기반 마커β 활용합니다. 그것은 세포 외 자극에 대한 반응으로 세포 사멸과 세포 사멸의 공간적, 시간적 변화를 보여줍니다.

Isolated Pancreatic Islet Treatment 및 Apoptosis 측정

여기에서는 생체 일주기 발광과 인간 섬 세포 및 일차 근관의 분비 활동을 병렬로 모니터링하기 위한 설정에 대해 설명합니다. 이를 위해 루시페라제 코어 클럭 리포터의 렌티바이러스 유전자 전달을 사용한 후, 연속적인 세포 주혈에 의한 유출 매질의 체외 동기화 및 수집을 수행했습니다.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

여기에서는 세포 분리에서 염기서열분석 결과의 기본 분석에 이르기까지 게놈 전체 포유류 복제 타이밍을 매핑하기 위한 비교적 빠르고 간단한 접근 방식을 설명합니다. 대표적인 복제 프로그램의 게놈 맵은 프로토콜에 따라 제공됩니다.

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

학습하세요 인간 혈청에서 디지털 PCR을 이용해 INS DNA 메틸화 차이를 측정하여 β세포 사멸을 바이오마커로 감지하는 방법입니다. 이 기술은 제1형 당뇨병 조기 진단에 활용됩니다.

된 유의 메틸화 측정

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