Name: 파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화, 소나무 재선충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 배우세요 소나무 재선충 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동 관찰 및 정량화 방법입니다. 처녀 성충을 획득하여 정확한 행동 분석이 가능하며, 선충 생태학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Najie 주홍 및 Liqun 바이는이 작품에 동일하게 기여했다. 이 작품은 재정적으로 공공 복지에서 임업 과학 연구를위한 특별 기금 (201,204,501)와 중국 국가 자연 과학 재단 (31170604, 31270688 및 31570638)에 의해 지원되었다. 우리는 영어 쓰기에 자신의 도움이 제안 박사 Holighaus 리트 박사 다니엘 Hickford 감사합니다.

버진 성인 선충 1. 취득 <ol><li> 파인 우드 선충의 분리 및 배양 조건 B를 xylophilus Nxy61 원래 중국 절강 성 닝보 지역에서 병에 걸린 Pinus의 massoniana에서 추출 분리 : 주. <ol><li> (PDA 재료의 표 참조) 감자 포도당 한천을 준비 보 트리 티스 시네 레아를 성장 판. </li><li> 접종 들어 B. 시네 메트에서 10mm의 직경을 갖는 매트 진균의 조각을 펀칭하고 새로운 PDA 플레이트의 중간에 넣어. 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 5 D에 대한 B. 시네. </li><li> 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 B. 시네을 포함하는 준비된 배양 접시에있는 파인 우드 선충. </li></ol></li><li> B. xylophilus 계란의 취득 <ol><li> 깔때기 아래에 고정 고무 튜브를 놓고 조립하는 랙에 제조 된 깔때기를 개최Baermann 깔때기 장치. 깔때기의 입에 종이 필터 대신 거즈 두 레이어를 놓습니다. </li><li> 유입 경로 설정에 곰팡이 문화를 전송하고 곰팡이 매트가 침지 될 때까지 물을 추가합니다. 2 시간을 기다린 선충은 곰팡이 문화에서 나올 여과지를 통과하고 Baermann 깔때기의 가장 낮은 부분에 정착 것입니다. </li><li> 15 ML의 튜브에 튜브의 바닥에서 물 방울의 첫 번째 부부를 수집하고 천천히 튜브 클램프를 풀어 선충를 수집합니다. </li><li> 실온에서 2 분 동안 3,000 XG에서 위의 컬렉션을 원심 분리기. </li><li> 피펫 물의 상층을 제거하고 멸균 이중 증류 (DD)의 1 mL의 H 2 O와 함께 재현 탁 </li><li> 피펫으로, 새로운 유리 페트리 접시 (6cm 직경)에 위의 부유를 전송합니다. 선충 자유롭게 수영을 할 수 있는지 확인하기 위해 페트리 접시에 무균 DD의 H 2 O 3 ML을 추가합니다. </li><li> 한 유리의 선충을 유지어둠 속에서 25 ° C에서 10 분 동안 배양 접시에요. 계란은 임신 한 여성에 의해 배치됩니다. 때문에 당 단백질 표면의, 계란 유리 페트리 접시의 바닥에 충실 할 것이다. </li><li> 계란을 방해하지 않고, 조심스럽게 물과 벌레를 제거합니다. 건조에서 계란을 방지하기 위해 즉시 유리 페트리 접시에 무균 DD의 H 2 O 3 ML을 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 1.2.8 배는 모든 애벌레와 어른을 제거하고 순수한 계란을 얻었다. 페트리 접시에 무균 DD의 H 2 O의 추가 2 ㎖ (총 5 ㎖)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 네 번째 단계 청소년의 취득 (J4 유충) <ol><li> 해치 25 ℃에서 어둠 속에서 24 시간 동안 수집 된 계란 J2 유충을 얻었다. </li><li> 2 분 동안 3,000 XG에 15 ML의 튜브, 원심 분리기에 피펫으로 J2 유충을 전송, 물 상층을 제거합니다. </li><li> 멸균 DD의 H 2 O의 200 μL와 J2 유충을 재현 탁하고로 전송B. 시네을 포함하는 PDA 판. </li><li> 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 52 시간의 J2 애벌레. 이 시점에서, 대부분의 유충 J2 J4 유충의 초기에 개발 된 것이다. </li></ol></li><li> 처녀 성인 선충의 취득 <ol><li> 알코올 버너 동안 가열 한 후 유리 모세관을 그려 선충을 따기위한 바늘을 준비합니다. 주 :이 모세관 바늘의 팁은 일반적으로는 단일 선충류를 픽업하기위한 도구로서 이용 될 수 있도록, 직경 50㎛의 성인 선충 대략 차체 폭 할 필요가있다. </li><li> Baermann 깔때기를 조립하고 단계 1.2.1에 기술 된 바와 같이, 2 시간 동안 곰팡이 문화 선충을 추출 - 1.2.3. </li><li> 깨끗한 페트리 접시에 물을 J4을 전송합니다. </li><li> 실체 현미경 하에서 선충을 관찰하고 마미야와 기요하라 (8) (그림 1에서 설명 된 바와 같이, 성기 형태로 남성과 여성을 구분 </strong&gt;). 제조 된 모세관 바늘로 원하는 섹스의 선충을 선택하고 남성 또는 여성에 대한 적절한 진균 배양 접시에 전송합니다. 주 : 남성보다 여성이 60에서 여성의 비율에있다 - 70 %. 여성 외음부는 남성 spicule에서 분명히 다르다. 성인에 비해 초기 단계 J4에서 spicule 또는 외음부는 작지만 여전히 쉽게 볼과 구별 될 수있다. 선충은 항상 때로는 남성과 여성을 구별에 어려움을 증가 물에서 움직이고있다. </li><li> 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 또 다른 24 시간의 J4 애벌레. 참고 : 모든 선충은 성인으로 발전해야하지만, 그들이 결합 해제하기 때문에, 그들은 처녀 성인으로 간주됩니다. </li><li> Baermann 유입 경로 둘을 조립하고 단계 1.2.1에 기술 된 바와 같이, 2 시간 동안 곰팡이 문화 처녀 성인을 추출 - 1.2.3, 그리고 두 개의 분리 된 깨끗한 페트리 접시에 처녀 성인 남성과 여성을 전송합니다. </li></oL&gt; </li></ol> 2. 관측 및 짝짓기 행동의 비디오 녹화 <ol><li> 여러 오목 슬라이드를 준비하고 자신의 우물 각 멸균 DD의 H 2 O의 200 μL를 추가합니다. </li><li> 모세관 바늘로 준비된 처녀 성인 남성 또는과 여성을 선택하고 각 오목 슬라이드의 물에 하나의 선충을 넣어. </li><li> 그들이 새로운 수성 환경에 적응할 수 있도록 1 시간 동안 잘 내부의 처녀 성인을 유지합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 다른 잘 하나에서 둘 중 하나를 전송하여 처녀 남성과 여성의 쌍. </li><li> 실체 현미경 아래 오목 슬라이드에 1♀ + 1♂ 조합의 짝짓기 행동을 관찰한다. </li><li> 버진 성인의 결합 효율을 분석하기 위해, 그 결합 성공률 (R)을 계산하고, 무작위로 선택된 성인 쌍의 것과 비교한다. 교미가 공부 복제의 총 개수에 비해 관찰 된 복제의 백분율 R을 계산한다. </li><li&gt; 결합 선택과 intrasexual 경쟁, 그룹을 조사하고 두 개의 서로 다른 조합으로 처녀 선충을 준수합니다 : 1♀ + 3♂과 + 1♂ 3♀합니다. </li><li> 정량적 분석을위한 데이터를 수집하기 위해, 비디오 현미경을 사용하여 결합 동작을 촬영. 일반적으로, 그들이 교미 후 멀리 이동할 때 선충이 모멘트에 오목 슬라이드의 웰에 배치 된 시점으로부터 전체 정합 프로세스는 2 시간 이내에 완료된다. 따라서 하나의 복제에 적어도 2 시간 동안 연속하여 정합 처리를 기록한다. 최소 30 전체는 각 조합의 총에 복제합니다. 주 : 기록 과정에서 증발을 보상 할뿐만 더 무균 DD의 H마다 0.5 H 2 O (통상 50 μL)을 추가한다. </li></ol> 3. 데이터 수집 <ol><li> 컴퓨터 화면에 신중하게 모든 동영상을보고 성적 하위 행동 특성. </li><li> 결합하여 일의 기간을 측정비디오 레코더의 전자 프레임 별 기능. 수동 종단점으로부터 시작 시간을 뺀다. </li><li> 1♀ + 1♂ 조합은 각 녹화를 분석하여 다음과 같은 이벤트의 지속 시간을 측정한다 : <ol><li> 검색하는 시간을 측정 (즉, 암수가 그들이 발생하는 모멘트에 오목 슬라이드의 웰에 넣고 서로 접촉 할 때까지의 시간). </li><li> 접촉의 지속 시간을 측정한다 (즉, 수형 정확하게 제 교미 위해 여성의 외음부에 위치하는 순간에 제 접촉까지의 시간). </li><li> 교미의 지속 시간을 측정 (즉, 자신이 사정 한 후 아래로 여성의 몸에서 슬라이드까지 남성이 정확하게 여성의 외음부에 위치 할 때까지의 시간). 참고 : 일부 선충은 2 시간에 여러 번 교접 할 수 있습니다. 이러한 경우, 라스의 끝에서 제 교미 교미 기간을 측정사이의 시간을 포함하여 t 하나. </li><li> 여운의 지속 시간을 측정한다 (즉, 교미 후 기간 암수 수영 서로 떨어져 그리고 더 선충의 몸 길이 이하의 간격으로 분리 될 때까지 (통상 1 ㎜)). </li></ol></li><li> 교미 주파수와 모든 교미 기간과 다른 조합의 각각에 대해 2 시간에있는 모든 교미의 평균 시간을 계산합니다 (즉, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ 및 1♀ + 3♂). </li><li> 즉시 끊김없이 수행되는 첫 접촉 후 짝짓기 성공률로 상이한 조합에 대해 먼저 접촉 (P)에 대한 상대 성공율을 계산한다. 접촉 단계에서는 여러 연락처는 실제 교미하기 전에 관찰 될 수 있습니다. <ol><li> 두 개인 사이의 거리는 상기 본체의 길이 이상이면 이상으로 하나의 접촉을 고려한다. 하나의 복제, 기록 P 100 %의 교미의 난에 대한의는 휴식없이 첫 접촉 후 즉시 관찰, 또는 0.00 % 더 교미가 관찰되지 않은 경우 또는 교미하지만 두 개 이상의 접점 후이 있다면. 참고 : 여기에 설명 된 각 조합에 대한 30 복제가 있었다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

행동 테스트는 화학 생태학, 신경 생물학, 분자 생물학, 유전학의 기본적인 부분입니다. 선충, 특히 C. 엘레은 광범위하게이 분야에서 연구에 사용됩니다. 선충의 짝짓기 행동은 이전에 10-11을 조사하고있다. 그러나, B.의 xylophilus는 자웅 이체와 자웅 동체 C. elegans의 다른이며, 그 결합 과정은 다른 행동 기능 9있다. 최근 Bursaphelenchus의 okinawaensis, B.의 xylophilus의 자웅 동체 자매 종의 짝짓기 행동은 12을보고되었다. 다른 실험 방법을 사용하고 있지만,이 자웅 동체 종, B.의 xylophilus 유사한 섹스 매력을 보여 주었다 그들 사이의 상호 종 매력이 관찰되었다. 이 자웅 동체 자매 종의 Bursaphelenchus의 생물학에 대한 추가 ...

소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle은 가장 파괴적인 침입종 중 하나로, 소나무를 시들게 하고 결국 죽게 만듭니다. 이 병원성 선충은 미국이 원산지인 것으로 여겨지지만 중국, 일본, 한국, 포르투갈 등 여러 국가로 옮겨졌습니다. 최근에는 스페인에서도 보고되어 수백만 그루의 소나무를 죽이고 막대한 경제적 손실을 입었으며 산림 생산과 생태 안정성을 위협하고 있습니다1-5.
숙주 소나무가 소나무 선충에 감염되면 수억 마리의 자손이 줄기 내에서 빠르게 번식합니다. 이것은 물관부 기능 장애를 일으켜 시들게 하고 결국 숙주 나무6의 죽음을 초래한다. 그러나 현재로서는 이 질병을 통제할 수 있는 효율적인 방법이 없습니다. 짝짓기 행동은 이 선충7의 높은 번식력에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 따라서 우리는 실험실에서 B. xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하여 짝짓기를 방해하고 번식력을 감소시키는 효과적인 방법을 찾기 위해 노력했습니다. 
이 프로토콜은 B. xylophilus의 처녀 성체를 얻는 방법과 비디오 레코더와 실체 현미경을 사용하여 짝짓기 행동을 관찰하고 분석하는 방법에 대한 자세한 방법을 소개하기 위한 것입니다. 이 프로토콜은 다른 선충의 행동 연구를 위한 참고 자료로도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus isolate Nxy61</td><td></td><td></td>중국 <td>닝보 지역의 Pinus massoniana에서 추출</td></tr><tr><td>회색 곰팡이 균주</td><td></td><td></td><td>중국 임업 아카데미에서 획득</td></tr><tr><td>Baermann 깔때기</td><td>Sengong</td> 매 튜브 Sengong <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 dd 2O</td><td></td><td></td><td>121°°에서 고압의 증기로 멸균; C 30분 동안</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA 매체</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>층류</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>입체 경</td><td>라이카</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>도립 입체 현미경</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>오목 슬라이드</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화, 소나무 재선충

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

관찰과 소나무 선충, Bursaphelenchus의 xylophilus의 짝짓기 행동을 정량화하기위한 방법은, 실체 현미경 아래 설립되었다. B. Xylophilus의 결합 효율을 향상시키고 상대 관찰 가능성을 증가시키는, 버진 성인 배양하고, 조사에 사용. 계란은 물에 선충을 유지하고, 여성은 10 분 동안 알을 낳기 수 있도록함으로써 얻을 수 있었다. 2 단째 유생 (J2)는 어둠에서 25 ° C에서 24 시간 동안 난자를 배양하여 동기화하고, 초기 J4 또 다른 52 시간 동안, 잿빛 곰팡이, 보 트리 티스 시네 레아와 J2를 배양함으로써 얻어졌다. 이 시점에서, 가장 J4 선충은 생식기 형태를 사용하여 남성 또는 여성 인 것으로 명확히 구별 될 수있다. 남성과 여성의 J4 수집하고 처녀 성인 선충을받을 24 시간 동안 두 개의 서로 다른 배양 접시에서 분리 배양 하였다. 처녀 남성과 처녀 여성은 와트의 드롭 쌍 하였다오목 슬라이드의 잘 어. 정합 동작은 실체 현미경 비디오 레코더로 촬영했다. 결합 프로세스의 전체 시간은 82.8 ± 3.91 분 (± SE 평균)이고 4 개의 단계로 나눌 수있다 : 검색, 접촉 교미 및 느린. 구간의 평균 분은 각각 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 및 7.2 ± 0.5이었다. 일레븐 서브 행동을 설명했다 :, 순항 접근, 발생, 반원형 누수 방지 공법, 터치, 위치, 부착, 사정을, 정지를 분리하고, 로밍. 한 여성이 3 명의 남성 3 명의 여성과 한 남성과 함께 그룹화 할 때 흥미롭게도, 분명 내 성적 경쟁이 관찰되었다. 이 프로토콜의 B. xylophilus의 결합 거동을 조사에서뿐만 아니라 다른 선충 ethological 연구를위한 기준으로서 작용에서뿐만 아니라, 유용하고 귀중하다.

처녀 성인의 짝짓기 성공률 (R)가 무작위로 선택된 성인에 비해 유의하게 높았다하는 평균 86.67 %이었다 : 13.33 ± 4.65 % (F = 1301.71, DF = 1, P = 0.0001) (그림 2). 이 발견은 B의 xylophilus 무작위로 선택된 성인보다 처녀 성인 짝짓기 행동을 관찰하기 쉽다는 것을 의미한다. 한 남성이 여성 하나와 결합되었을 때 전체 정합 프로세스는 평균 82.8 분 동안 지속되었다. 전체 프로세스는 네 가지 단계로 설명 될 수있다 : 검색 접촉 교미 및 느린. 이 네 단계의 기간은 21.8 ± 2.0 분, 28.0 ± 1.9 분, 25.8 ± 0.7 분, 7.2 ± 0.5 분, 각각 (그림 3)이었다. 최근 게시...

소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 조사하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. B. xylophilus의 행동 특징은 짝짓기 과정에 설명되어 있습니다.

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

이 절차의 전반적인 목표는 소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 선충에 대한 심리학 연구를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 특히 소나무 선충의 짝짓기 행동 관찰을 다룹니다.이 기술의 가장 큰 장점은 처녀 성체를 얻을 수 있어 성체 짝짓기 행동을 훨씬 쉽게 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 순전히 선충에 대한 광범위한 연구로 확장되는데, 이는 선충이 유사한 생활사 행동을 가지고 있기 때문입니다. 이 방법의 시연은 매우 중요한데, 발달 선충의 제약은 연습이 필요하고 초기 1단계 유년기에서 수컷과 암컷을 정확하게 구별하는 것이 쉽지 않기 때문에 처녀 성체 선충을 획득하는 것이 어렵기 때문입니다.소나무 선충을 배양하려면 먼저 감자 포도당 한천 플레이트를 준비하십시오. 플레이트를 접종하려면 betritus senaria 매트에서 직경 10mm의 곰팡이 매트 조각을 펀칭하고 새 PDA 플레이트의 중간에 놓습니다. 어둠 속에서 섭씨 25도에서 5일 동안 곰팡이 매트를 배양합니다.5일 후, 준비된 페트리 접시에 소나무 선충을 넣고 어둠 속에서 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다. 곰팡이에서 선충을 분리하려면 먼저 수집 도구를 준비하십시오. 깔때기 아래에 클램프 고무 튜브를 놓고 준비된 깔때기를 랙에 고정하여 baermann 깔때기 장치를 조립합니다.그런 다음 깔때기 입구에 거즈 대신 여과지를 두 겹 놓습니다. 이제 곰팡이 배양을 깔때기 설정으로 옮기고 곰팡이 매트가 잠길 때까지 물을 추가합니다. 2시간 후, 선충은 곰팡이 배양에서 나와 여과지를 건너 baermann 깔때기의 가장 낮은 부분에 정착합니다.깔때기 아래에 15ml 튜브를 놓고 클램프를 천천히 풀어 선충을 포함할 물 몇 방울을 모아 선충을 수집합니다. 선충 컬렉션을 3, 000G에서 실온에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 물의 상층부를 비가시화하고 1 밀리리터의 물에 벌레를 다시 매달아 놓습니다.선충의 현탁액을 6cm 유리 접시에 옮기고 3ml의 물을 넣어 선충이 자유롭게 수영할 수 있도록 합니다. 이제 알을 모아 처녀 주식을 만드십시오. 접시를 어두운 인큐베이터로 옮기고 임산부가 10분 동안 알을 낳게 합니다.당단백질 표면 때문에 계란은 유리잔에 달라붙습니다. 다음으로, 접시에 붙어있는 계란을 방해하지 않도록 벌레가 있는 물을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 계란이 마르지 않도록 접시에 물 3ml를 빠르게 다시 넣으십시오.알을 청소하는 이 과정을 최소 세 번 반복하여 모든 유충과 성인을 제거하고 순수한 알을 얻습니다. 씻은 순수한 계란 컬렉션에 5ml의 물을 넣고 섭씨 25도의 어둠 속에서 계란을 개발합니다. 알 배양을 시작한 후 24시간이 지나면 부화한 J2 유충을 수집합니다.J2 유충을 15ml 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 3, 000G에서 2분 동안 수집품을 원심분리합니다. 물의 상층을 제거하고 200마이크로리터의 물을 다시 추가합니다.그런 다음 곰팡이 매트로 준비된 PDA 플레이트에서 J2 유충을 배양합니다. 52시간이 지나면 대부분의 J2 유충은 초기 단계의 J4 유충으로 발달합니다. baermann 깔때기를 조립하고 앞에서 설명한 대로 2시간 동안 곰팡이 배양에서 선충을 추출합니다.기다리는 동안 바늘을 준비하여 벌레를 골라냅니다. 알코올 버너로 가열된 유리 모세관에서 팁을 그립니다. 끝은 직경이 약 50미크론이어야 하며, 이는 대략 성인 선충의 몸 너비와 같습니다.2 시간 후, 앞서 설명한대로 J4 유충을 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다. 이제 실체 현미경으로 선충을 성교하십시오. 유충의 약 3분의 2는 보통 암컷입니다.암컷의 외음부는 분명히 수컷의 해부학적 구조와 다르지만, 기생충이 매우 활동적이기 때문에 성교는 연습이 필요할 것입니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 초기 첫 단계에서 수컷과 암컷을 정확하게 구별하고 분리하는 것입니다. 그렇지 않으면, 그들이 성인이 되었을 때 혼합되고 나쁠 것입니다.그리고 그것은 짝짓기를 관찰하기 어렵게 만듭니다. 점차적으로 수컷 또는 암컷을 위한 슬라이드의 물 한 방울로 벌레를 골라서 옮깁니다. 성공을 보장하기 위해 두 명의 다른 사람이 성별 할당을 다시 확인해야 합니다.이제, sexed 벌레를 포함하는 물방울을 적합한 곰팡이 배양 판으로 옮깁니다. 그런 다음 짝짓기 행동을 연구하기 전에 24시간 동안 처녀를 더 배양하십시오. 소나무 선충의 짝짓기 행동을 관찰하려면 먼저 각 우물에 200마이크로리터의 물을 추가하여 여러 개의 오목한 슬라이드를 준비합니다.다음으로, 준비된 처녀 성인 한 명을 선택하여 준비된 슬라이드로 옮깁니다. 처녀 성체를 한 시간 동안 우물 안에 두어 새로운 수성 환경에 적응할 수 있도록 합니다. 한 시간 후, 피펫을 사용하여 이성의 한 명의 처녀 성인을 우물에 추가하십시오.그런 다음 실체 현미경으로 결합 거동을 관찰하고 정량 분석을 위해 거동을 촬영합니다. 전체 짝짓기 과정은 보통 2시간 안에 끝납니다. 30분마다 50마이크로리터의 물을 추가하여 증발을 보상합니다.짝짓기 선택과 성간 경쟁을 조사하기 위해 두 가지 다른 조합의 처녀 선충을 그룹화하고 관찰합니다. 처녀 성체의 짝짓기 성공률은 약 87%로 무작위로 선발된 성체보다 훨씬 높았습니다. 한 쌍이 4개의 다른 단계를 포함하는 전체 짝짓기 과정을 완료하는 데 평균 83분이 걸렸습니다.찾고, 연락하고, 교미하고, 머뭇거린다. 이러한 단계에서 많은 특정 행동 패턴을 관찰할 수 있습니다. 한 마리의 암컷이 여러 마리의 수컷을 만났을 때, 명백한 짝짓기 선택이 있었다.암컷은 보통 머리를 사용하여 수컷 한 명과 접촉하며, 보통 머리, 몸통, 꼬리 및 생식기 부위에 접촉합니다. 그런 다음 암컷은 수컷과 교미하거나 재빨리 그를 떠나 다른 수컷에게 헤엄쳐 갔다. 짝짓기 성공률은 서로 다른 선충 조합에 대한 첫 번째 접촉 후에 측정되었습니다.성간 경쟁도 발생했다. 한 명의 처녀 암컷이 세 명의 처녀 수컷과 섞였을 때, 수컷은 암컷과 짝짓기를 할 기회를 얻기 위해 가능한 한 많이 암컷에게 접근하고 접촉하려고 노력했습니다. 외음부가 점유되었을 때, 다른 수컷들은 격렬하게 몸을 흔들거나 끌어당겨 분리하는 방법을 사용하여 짝짓기 과정을 방해하려고 했다.여성의 간성 경쟁은 남성의 간성 경쟁과 다소 유사한 것으로 보였다. 성간 경쟁으로 인해, 다른 조합으로 만들어진 교미 빈도는 현저히 달랐다. 개발 후, 이 기술은 선충의 행동 생태학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 절차를 숙달하면 제대로 수행되면 12일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 처녀 성체를 얻기 위해 초기 4 단계 청소년 인 수컷과 암컷을 정확하게 분리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

행동 분석은 뉴런 기능을 이해하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 여기에서는 모델 선충 Pristionchus pacificus와 그 친척에서 발견되는 포식적 섭식 행동을 정량화하기 위한 몇 가지 프로토콜을 제시합니다. 또한 입 구조와 치아를 포함한 포식적 섭식 적응을 분석하는 방법을 제공합니다.

에서 약탈 먹이 행동을 분석<em&gt; Pristionchus</em&gt; 및 기타 선충

우리는 초파리 Drosophila melanogaster 에서 짝짓기 행동에 영향을 미치는 환경 및 유전 신호를 분석하는 분석법을 시연합니다.

환경에서 신호의 결합 효과에 미치는 영향을 시험하는 방법<em&gt; Drosophila melanogaster</em

C. 선 충 수 컷의 효율적인 칼슘 이미징에 대 한 적응된 "후 각 칩"를 사용 하 여 여기에 설명 되어 있습니다. 글리세롤과 페로몬에 남성 노출의 연구도 표시 됩니다.

남성 선 충 C. 머리 신경에 있는 페로몬에 대 한 응답에서 신경 활동의 이미징에 대 한 적응된 미세 후 각 칩을 사용 하 여

친구를 지키는 행동 속 Tigriopus의 조간 copepods의 재생산에 중요 한 역할을 한다. 그러나,이 행동 공부 방법을 잘 설명 되지 않았습니다. 여기 우리는 방법에 대 한 설명: 처녀 Tigriopus 동물, 그리고 그들의 동료를 지키는 행동의 정량 분석 2)의 1) 개별 문화.

Tigriopus Copepods 및 그들의 동료를 지키는 행동의 정량 분석의 개별 경작

이 프로토콜에서 근 친 십자가 실시 하 고 그 십자가의 성공을 평가 하기 위한 메서드가 개미 Vollenhovia emeryi에 대 한 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 실험 Hymenoptera에 섹스 결정 시스템의 유전 기초를 이해 하기 위한 중요 합니다.

유도 및 개미, Vollenhovia Emeryi 를 사용 하 여 근 친 십자가의 평가

정자는 성공적으로 난 모 세포를 비료를 통해 이동 해야 합니다. 여기에서, 우리는 C에서 정자 이동 측정에 대 한 분석을 설명 합니다 .  이 분석은 결합 후 자 궁 내 정자 분포에 대 한 정량적 데이터 뿐만 아니라 속도, 방향 속도 및 반전 주파수를 제공 할 수 있습니다.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

여기에서는 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 Bursaphelenchus xylophilus 에서 RNA 간섭에 대한 상세한 담그는 방법을 소개합니다.

파인우드 선충류에서의 RNA 간섭의 적용, Bursaphelenchus xylophilus

이 프로토콜은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 휘발성 성 페로몬에 대한 반응을 추출하고 정량화하는 방법을 확립하여 화학적 통신 및 탐색 궤적을 연구하기 위한 도구를 제공합니다.

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 휘발성 성 페로몬 추출 및 화학매력 분석)

이 프로토콜은 Pinus pinaster의 in vivo 및 in vitro pinewood 선충 감염과 가스 크로마토그래피(GC) 및 질량 분석법(GC-MS)과 결합된 GC를 통한 휘발성 분석을 설명합니다.

Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus 에 의한 In Vivo 및 In Vitro Pines 감염 및 유도 휘발성 물질의 분리

본 프로토콜은 염화칼륨(KCl) 이온의 삼투압 조절을 통해 Bursaphelenchus xylophilus의 3기 유년기(pre-dauer juveniles, JIII.)를 cryptobiosis로 분산시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 B. xylophilus의 응력 저항 메커니즘에 대한 연구를 위한 기술 지원을 제공할 수 있습니다.

삼투압 조절을 통해 Bursaphelenchus xylophilus 의 3단계 분산 청소년의 Cryptobiosis 진입 유도

배우세요 소나무 재선충 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동 관찰 및 정량화 방법입니다. 처녀 성충을 획득하여 정확한 행동 분석이 가능하며, 선충 생태학 연구에 활용됩니다.

파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화, 소나무 재선충

더 많은 동영상 탐색