파인 우드 선충의 관측 및 짝짓기 행동의 정량화, 소나무 재선충

이 절차의 전반적인 목표는 소나무 선충인 Bursaphelenchus xylophilus의 짝짓기 행동을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 선충에 대한 심리학 연구를 진전시키는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 특히 소나무 선충의 짝짓기 행동 관찰을 다룹니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 처녀 성체를 얻을 수 있어 성체 짝짓기 행동을 훨씬 쉽게 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 순전히 선충에 대한 광범위한 연구로 확장되는데, 이는 선충이 유사한 생활사 행동을 가지고 있기 때문입니다. 이 방법의 시연은 매우 중요한데, 발달 선충의 제약은 연습이 필요하고 초기 1단계 유년기에서 수컷과 암컷을 정확하게 구별하는 것이 쉽지 않기 때문에 처녀 성체 선충을 획득하는 것이 어렵기 때문입니다.

소나무 선충을 배양하려면 먼저 감자 포도당 한천 플레이트를 준비하십시오. 플레이트를 접종하려면 betritus senaria 매트에서 직경 10mm의 곰팡이 매트 조각을 펀칭하고 새 PDA 플레이트의 중간에 놓습니다. 어둠 속에서 섭씨 25도에서 5일 동안 곰팡이 매트를 배양합니다.

5일 후, 준비된 페트리 접시에 소나무 선충을 넣고 어둠 속에서 섭씨 25도에서 3일 동안 배양합니다. 곰팡이에서 선충을 분리하려면 먼저 수집 도구를 준비하십시오. 깔때기 아래에 클램프 고무 튜브를 놓고 준비된 깔때기를 랙에 고정하여 baermann 깔때기 장치를 조립합니다.

그런 다음 깔때기 입구에 거즈 대신 여과지를 두 겹 놓습니다. 이제 곰팡이 배양을 깔때기 설정으로 옮기고 곰팡이 매트가 잠길 때까지 물을 추가합니다. 2시간 후, 선충은 곰팡이 배양에서 나와 여과지를 건너 baermann 깔때기의 가장 낮은 부분에 정착합니다.

깔때기 아래에 15ml 튜브를 놓고 클램프를 천천히 풀어 선충을 포함할 물 몇 방울을 모아 선충을 수집합니다. 선충 컬렉션을 3, 000G에서 실온에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 물의 상층부를 비가시화하고 1 밀리리터의 물에 벌레를 다시 매달아 놓습니다.

선충의 현탁액을 6cm 유리 접시에 옮기고 3ml의 물을 넣어 선충이 자유롭게 수영할 수 있도록 합니다. 이제 알을 모아 처녀 주식을 만드십시오. 접시를 어두운 인큐베이터로 옮기고 임산부가 10분 동안 알을 낳게 합니다.

당단백질 표면 때문에 계란은 유리잔에 달라붙습니다. 다음으로, 접시에 붙어있는 계란을 방해하지 않도록 벌레가 있는 물을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 계란이 마르지 않도록 접시에 물 3ml를 빠르게 다시 넣으십시오.

알을 청소하는 이 과정을 최소 세 번 반복하여 모든 유충과 성인을 제거하고 순수한 알을 얻습니다. 씻은 순수한 계란 컬렉션에 5ml의 물을 넣고 섭씨 25도의 어둠 속에서 계란을 개발합니다. 알 배양을 시작한 후 24시간이 지나면 부화한 J2 유충을 수집합니다.

J2 유충을 15ml 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 그런 다음 3, 000G에서 2분 동안 수집품을 원심분리합니다. 물의 상층을 제거하고 200마이크로리터의 물을 다시 추가합니다.

그런 다음 곰팡이 매트로 준비된 PDA 플레이트에서 J2 유충을 배양합니다. 52시간이 지나면 대부분의 J2 유충은 초기 단계의 J4 유충으로 발달합니다. baermann 깔때기를 조립하고 앞에서 설명한 대로 2시간 동안 곰팡이 배양에서 선충을 추출합니다.

기다리는 동안 바늘을 준비하여 벌레를 골라냅니다. 알코올 버너로 가열된 유리 모세관에서 팁을 그립니다. 끝은 직경이 약 50미크론이어야 하며, 이는 대략 성인 선충의 몸 너비와 같습니다.

2 시간 후, 앞서 설명한대로 J4 유충을 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다. 이제 실체 현미경으로 선충을 성교하십시오. 유충의 약 3분의 2는 보통 암컷입니다.

암컷의 외음부는 분명히 수컷의 해부학적 구조와 다르지만, 기생충이 매우 활동적이기 때문에 성교는 연습이 필요할 것입니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 초기 첫 단계에서 수컷과 암컷을 정확하게 구별하고 분리하는 것입니다. 그렇지 않으면, 그들이 성인이 되었을 때 혼합되고 나쁠 것입니다.

그리고 그것은 짝짓기를 관찰하기 어렵게 만듭니다. 점차적으로 수컷 또는 암컷을 위한 슬라이드의 물 한 방울로 벌레를 골라서 옮깁니다. 성공을 보장하기 위해 두 명의 다른 사람이 성별 할당을 다시 확인해야 합니다.

이제, sexed 벌레를 포함하는 물방울을 적합한 곰팡이 배양 판으로 옮깁니다. 그런 다음 짝짓기 행동을 연구하기 전에 24시간 동안 처녀를 더 배양하십시오. 소나무 선충의 짝짓기 행동을 관찰하려면 먼저 각 우물에 200마이크로리터의 물을 추가하여 여러 개의 오목한 슬라이드를 준비합니다.

다음으로, 준비된 처녀 성인 한 명을 선택하여 준비된 슬라이드로 옮깁니다. 처녀 성체를 한 시간 동안 우물 안에 두어 새로운 수성 환경에 적응할 수 있도록 합니다. 한 시간 후, 피펫을 사용하여 이성의 한 명의 처녀 성인을 우물에 추가하십시오.

그런 다음 실체 현미경으로 결합 거동을 관찰하고 정량 분석을 위해 거동을 촬영합니다. 전체 짝짓기 과정은 보통 2시간 안에 끝납니다. 30분마다 50마이크로리터의 물을 추가하여 증발을 보상합니다.

짝짓기 선택과 성간 경쟁을 조사하기 위해 두 가지 다른 조합의 처녀 선충을 그룹화하고 관찰합니다. 처녀 성체의 짝짓기 성공률은 약 87%로 무작위로 선발된 성체보다 훨씬 높았습니다. 한 쌍이 4개의 다른 단계를 포함하는 전체 짝짓기 과정을 완료하는 데 평균 83분이 걸렸습니다.

찾고, 연락하고, 교미하고, 머뭇거린다. 이러한 단계에서 많은 특정 행동 패턴을 관찰할 수 있습니다. 한 마리의 암컷이 여러 마리의 수컷을 만났을 때, 명백한 짝짓기 선택이 있었다.

암컷은 보통 머리를 사용하여 수컷 한 명과 접촉하며, 보통 머리, 몸통, 꼬리 및 생식기 부위에 접촉합니다. 그런 다음 암컷은 수컷과 교미하거나 재빨리 그를 떠나 다른 수컷에게 헤엄쳐 갔다. 짝짓기 성공률은 서로 다른 선충 조합에 대한 첫 번째 접촉 후에 측정되었습니다.

성간 경쟁도 발생했다. 한 명의 처녀 암컷이 세 명의 처녀 수컷과 섞였을 때, 수컷은 암컷과 짝짓기를 할 기회를 얻기 위해 가능한 한 많이 암컷에게 접근하고 접촉하려고 노력했습니다. 외음부가 점유되었을 때, 다른 수컷들은 격렬하게 몸을 흔들거나 끌어당겨 분리하는 방법을 사용하여 짝짓기 과정을 방해하려고 했다.

여성의 간성 경쟁은 남성의 간성 경쟁과 다소 유사한 것으로 보였다. 성간 경쟁으로 인해, 다른 조합으로 만들어진 교미 빈도는 현저히 달랐다. 개발 후, 이 기술은 선충의 행동 생태학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 절차를 숙달하면 제대로 수행되면 12일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 처녀 성체를 얻기 위해 초기 4 단계 청소년 인 수컷과 암컷을 정확하게 분리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.