Name: 대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 배우세요 대뇌 혈관 내피 세포의 미토콘드리아 기능 평가 방법을 통해 혈뇌장벽 손상과 신경질환 연구를 수행하세요. 이 기술은 실시간 생체 에너지 분석으로 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 작업은 AHA 16SDG31170008 to X.R. 및 NIH P20 GM109098, P01 AG027956 및 U54 GM104942 to J.W.S.의 보조금으로 지원되었습니다.

주 : 프로토콜의 방식이 절차의 타임 라인을 포함하여,도 1에 도시되어있다. CVE 세포의 1. 문화 통로 <ol><li> 완전 성장 배지에서 배양 CVE 세포 (bEnd.3 세포) (고 글루코스 둘 베코 변형 이글 배지, DMEM)는 T75의 cm 2 조직 배양 플라스크에 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충. 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 성장한다. </li><li> 분리하여 세포 배양 배지를 버리고. 0.25 % 트립신, 0.03 %의 EDTA 용액으로 세포 층을 헹군 후 1 추가 - 플라스크를 트립신 EDTA 용액 2 mL로 3 37 ℃에서 플라스크를 유지 - 5 분. 세포 층이 분리 될 때까지 반전 현미경으로 세포를 관찰한다. 완전한 성장 배지 10 mL를 넣고 부드럽게 피펫 팅하여 세포를 대기음. </li><li> 5 분 세포 파편을 제거하기 위해 700 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 스핀에 유체 및 세포를 가만히 따르다. </l난&gt; <li> 원심 분리기 튜브에서 뜨는을 폐기하십시오. 완전 성장 배지 10 mL를 첨가하여 세포 펠렛을 다시 일시. 5 분 동안 700 XG에서 세포를 스핀. </li><li> 원심 분리기 튜브에서 뜨는을 폐기하십시오. 다시 일시 2.0 × 105 세포 / ㎖의 농도로 완전 성장 배지에서 세포 펠릿 (혈구를 사용하여 계산하여 결정될; 트립 판 블루 염색법에 의해 사균을 제외). 참고 : 갓 해동 세포 실험에서 최소 3 구절에 대한 계대 배양합니다. </li></ol> 세포 배양 접시에 2 종자 및 치료 세포 <ol><li> 96 웰 세포 외 플럭스 세포 배양 접시에 씨앗 세포 : 물론 80 μL /. 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포 배양 접시를 놓습니다. 참고 : 잘 당 16 × 10 3 세포가 60에 도달 할 것 - 24 시간 이내에 80 %의 포화 상태. </li><li> 세포가 화학 물질에 노출되는 경우, 세포가 플레이트 바닥면에 부착되면, 치료제를 추가 (8-24 시간 후 참조땡땡). 참고 : 형질 전환 실험에 대한 완전한 성장 배지에 항생제를 추가하지 않습니다. </li></ol> Bioanalyzer를 사용하여 미토콘드리아 기능 3. 평가 <ol><li> 분석의 개시에 앞서, 판 외 플럭스 calibrant 용액 150 μL를 첨가하지 않고 CO 2, 37 ℃에서 O / N 항온 처리하여 calibrant와 외 플럭스 센서 카트리지 수화. </li><li> 판 와셔 스테이션을 사용하여 pH를 7.0 외 플럭스 분석 배지로 세포 배양 배지를 변경. 60 분 - 30 CO 2없이 37 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 8 μM의 oligomycin, 4.5 μM FCCP, 10 μM의 로테 논, 그리고 DMEM에서 10 μM antimycin A의 작업 솔루션을 준비합니다. 로드 25 μL 카트리지 주입구로 원액의 포트 A, oligomycin; 포트 B, FCCP; 포트 C, 세포 외 플럭스 분석 매체와 로테와 antimycin A를. 표 1에 기재된 바와 같이 분석 프로토콜을 구현. </li><li> bioanalyzer에 수화 카트리지를로드하고 &quot;시작&quot;버튼을 클릭하여 교정을 수행합니다. 캘리브레이션이 완료되면, 카트리지 바닥 판을 제거하고 &quot;언로드 카트리지&quot;메시지를 클릭하여 세포 플레이트를 로딩. 모든 측정이 끝날 때까지 시험을 계속한다. </li><li> 데이터 파일을 열고 bioanalyzer에서 속도 값을 구하십시오. 스프레드 시트 파일에 데이터를 보냅니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 참고 : 데이터 분석에 대한 계산은 아래 공식화된다. OCR은도 2에 제시된 값은 bioanalyzer 기기로부터 얻어진다. <ol><li> 기저 값으로부터 (측정 3) - 기저 호흡을 계산하기 위해, 비 - 미토콘드리아 호흡 (12 측정치 10) 빼기. 참고 : 기저 호흡 = 기저 - 비 미토콘드리아 호흡 = 속도 ③ - 평가 ⑩ ~ ⑫. </li><li> ATP의 producti와를 계산하려면기저 값에서 (측정 3) -에서 ATP 링크 된 호흡 (6 측정 4)를 뺍니다. 참고 : ATP 생산 = 기저 - ATP 링크 된 호흡 = 속도 ③ - 평가 ④ ~ ⑥. </li><li> 최대 호흡에서 (측정 7-9) - 최대한 호흡을 계산하려면, 비 미토콘드리아 호흡 (12 측정 10)를 뺍니다. 참고 : 최대한 호흡 = 최대 호흡 - 비 미토콘드리아 호흡 = 속도 ⑦ ~ ⑨ - 평가 ⑩ ~ ⑫. </li><li> 예비 용량을 계산하기 위해, 최대의 호흡에서 기저 값 (측정 3) (- 9 측정치 7) 빼기. 참고 : 예비 용량 = 최대 호흡 - 기저 = 속도 ⑦ ~ ⑨ - 평가 ③. </li><li> ATP에 연결된 호흡 (측정 4)에서 - 양성자 누수를 계산하려면, 비 미토콘드리아 호흡 (12 측정 10)를 뺍니다. 참고 : 양성자 누출 = ATP 링크 된 호흡 - 비 미토콘드리아리터 호흡 = 속도 ④ - 평가 ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
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</ol>

저자는 이 기사의 연구, 저자 및/또는 출판과 관련하여 잠재적인 이해 상충이 없음을 선언합니다. 이 기사에 대한 오픈 액세스 수수료는 애질런트 테크놀로지스에서 제공했습니다.

이 프로토콜은 뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 표현형의 평가 방법을 나타낸다. 이는 내피 세포의 미토콘드리아 평가 기본적인 역할 분석, 그리고 CVE 세포에서 미토콘드리아 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수있는 자극의 기작을 조사하기위한 실험에 적합하다. 또한 BBB 단절 - 관련 질병에 대한 잠재적 치료제를 시험하기위한 방법을 제공한다. 프로토콜 내에서 중요한 단계 외 플럭스 bioanalyzers 실시간 OCR을 측정 할 수있다. 이 분석에서, 상기 적절한 셀 밀도를 식별하는 것은 중요하다. 세포 밀도는 웰 당 8 × 103 세포를 밑도는 경우, 기저 OCR은 (도 2 및도 3)를 분석하기에 너무 낮다; 세포 밀도는 웰 당 32 × 103 세포를 초과하면, 세포 또는 oligomycin FCCP의 자원 처리에 응답하지 않는다국세청 (그림 2와 그림 3). 우리의 실험 모델에서이 세포주에 대한 최적의 세포 밀도는 7 트리트먼트 10, 14를 자극에 복제 결과와 감도를 보여줍니다 아니라, 당 16 × 10 3 세포이다. 24 웰 bioanalyzer가 사용되는 경우, 세포 밀도는 새로운 적정 분석을 위해 요구 될 것이다. 된 CVE 다른 내피 세포 또는 조직 유형 15,16 미토콘드리아에 비해 많은 양이 그것이 큰 에너지 생산 및 생체 에너지 대사를 측정하기위한보다 적은 세포의 필요성을 시사 설명한다. 우리는 주와 같은 뇌 내피 세포의 여러 종류를 테스트하고 쥐의 뇌 혈관 내피 세포 (7) 불후 인간의 뇌 혈관 내피 세포 (게시되지 않은 데이터) 불후있다. 160 pmol의 / 분 -이 셀 (40) 내에 수용 OCR (기저 호흡 OCR 도달하는 유사한 세포 밀도를 필요96 웰 플레이트 및 50-24 웰 플레이트, 400 pmol의 / 분)에 생체 에너지 분석을 수행 하였다. Kaczara 외. 높은 세포 밀도 (17)를 사용하여 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 생체 에너지 대사를 측정보고 하였다. 우리 그룹은 다른 조직이나 장기에서 혈관 세포를 평가하지 않았다. 이론적 bioanalyzer 잠재적 셀 타입에 이용 될 수 있지만, 세포 밀도, 세포 배양 배지와 배양 조건 (일부 특정 세포가 잘 성장할 플레이트 코팅 필요할 수 있음)에 대한 분석을 최적화 할 필요. 이 실험은 OCR 속도가 허용 가능한 범위 내에 있도록 완료되도록 요구된다. 다른 기관으로부터 내피 세포의 OCR 셀 밀도가 증가 된 CVE 뇌에서보다 낮은 경우 OCR 허용 범위 내에서 얻을 수 있습니다. 세포가 에너지를 그들의 주요 소스로 산화 적 인산화를 사용하지 않는 경우 또는의 bioanalyzer는 OPTIMA되지 않을 것리터 분석. bioanalyzer는 시약이 적용되는 순서에 기초하여, 전자 전달계의 순차적 중단을 허용한다. 먼저 oligomycin 미토콘드리아는 단지 V (ATP 합성 효소)를 억제하는인가된다. 둘째, FCCP, 전자 uncoupler는 양성자 구배의 파괴에 이르게하는인가된다. 마지막으로, 미토콘드리아 단지 I 및 III을 억제 로테 antimycin 및 A는, 각각 전자 흐름 총 억제 리드에 적용된다. 약물 노출 순서는 약물 특정 전자 전달계 반응을 차단하기 때문에 필수적이며, 순차 변화는 미토콘드리아의 기능을 반영하기 위해 측정 될 수있다. 수정 및 문제 해결 CVE 세포에서 미토콘드리아 자극에 반응을 평가하기 위해, 세포가 세포 배양 플레이트의 바닥에 부착 된 후 자극 (막대 표시 셀에인가되는 것을 권장도 1에 도시; 보통) 적어도 6 시간이 걸립니다. 치료법으로 복제 결과를 얻기 위해서는, 일치 셀 밀도를 유지하는 것이 매우 중요하다. 전처리는 세포 파종하기 전에 설계하는 경우, 각각의 전처리를위한 세포 밀도는주의 깊게 파종의 죽은 세포를 제외하고 측정해야한다. 형질는 실험 디자인에 포함되는 경우, 제조자의 형질 감염 프로토콜을 참조. 도 4에 제시된 데이터에서 보여 미르-34A 미르-34A의 과발현과 대사 기능의 변화를 평가하기 위해 항생 물질이없는 세포 배양 배지 및 미토 스트레스 테스트를 필요로 리포 펙 타민 형질 전환 키트를 사용하여 CVE 세포로 형질 감염시켰다 . 이전 13 공표 플라스미드의 용량은 또한 최적화 될 수있다. 프로토콜에 따라 제조 될 수있는 또 다른 변화는 시약의 농도를 변경한다. oligomycin, FCCP 및 / 또는 로테 및 Antimycin (A)의 적정 곡선 일 수 공단테드. 높은 처리량에 사용이 분석은 다양한 약물의 분석을하는 경우뿐만 아니라, 그 세포 생존하고 이전의 공보에서 설명되었다 7,13 세포 증식을 측정하는 병렬 분석을 포함하도록 제안한다. 문자 인식 값은 크게 세포 수 (도 2 및 3)의 영향 및 세포 증식 및 생존 분석은 데이터의 정규화에 도움된다. 그러나 이러한 분석의 완료는 각 기관의 재량이다. 기술의 한계 이 프로토콜의 주요 한계는 우리가 단지 연구에서 시험 관내 세포 배양 모델을 사용한다는 것이다. 현재, 내피 세포의 미토콘드리아 기능을 처리 할 수 사용 가능한 생체 모델이나 동물 모델이 없습니다. 새로운 모델은 생체 내에서 생체 에너지 함수의 평가를 위해 개발 될 것으로 예상되며 <em&gt; 생체 미래 연구한다. 또 다른 제한은 생물 에너지 학 조치 다음 장벽 평가의 확장입니다. 첫째, 생체 에너지 측정 종료 후, 세포 생존율은 전자 전달계의 완전한 붕괴 다음 감소되기 때문 실험을 수행 할 수 없다; 둘째, 특정 세포 배양 접시와 삽입은 생물 에너지 학 값을 감지해야하며 장벽 평가를위한 삽입에 적합하지 않습니다. 따라서, 생물 에너지 학 분석 한 후 완료 할 수있는 많은 기능 분석이되지 않습니다. 그러나, 특별한 장치가 생체 에너지 세이 이전 기능 분석을 수행하도록 개발 될 수있을 것으로 기대된다. 기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성 미토콘드리아의 기능을 평가하기 위해 이전 기술은 셀 (18)로부터 미토콘드리아의 분리를 필요로. 이 북동bioanalyzer를 사용하여 w 기술은 고립 된 미토콘드리아를 평가보다 세포 환경을 더 많이 보존 손상 세포에서 미토콘드리아 활동의 측정을 할 수 있습니다. 이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향 이 프로토콜 설계 및 bEnd.3 세포주 개발뿐만 아니라 일차 대뇌 혈관 내피 (pCVE) 셀 (7) 또는 다른 내피과 호환 가능하며, 우리는 pCVE 전지 7을 이용하여 이전 출판물이 입증된다. 내피 세포의 다른 유형을 사용할 경우, 배양 판의 코팅 및 성장 인자의 사용이 요구 될 수있다. 그러나, 적정 분석은 다른 세포 유형을 권장합니다. 이 프로토콜은 CVE 세포의 생체 에너지의 평가에 채택 될 수있는 일반적인 방법을 제공하고, 더 나아가 장치의 연구 또는 이러한 방식으로 치료 학적 반응에 적용될 수있다.

널리 대뇌 혈관 내피 (CVE) 세포에 의해 형성되는 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)이 혈관 생물학 중요 매우 독특하고 고유 한 기능을 가지고 있음을 인식하고 있습니다. 이러한 내피 세포는 화학 에너지 원으로서 아데노신 트리 포스페이트의 셀룰러 공급 (ATP)의 대부분을 생성하는 미토콘드리아를 사용한다. CVE 전지용 ATP를 제공 할뿐만 아니라 미토콘드리아 1-4 시그널링 셀룰러로서 혈관 내피 세포의 다양한 세포 과정 아폽토시스 5 및 세포주기의 조절 및 세포 성장 6. CVE 세포에서 미토콘드리아 생체 에너지 함수의 조절 이상을 조절 손상된 혈관 내피 세포의 활동을 선도, 미토콘드리아 생물에 영향을 미칠 및 뇌 혈관 질환과 신경 퇴행성 질환, 예를 들어, 뇌졸중 7,8 및 알츠하이머 병 (AD) 9 악화시킬 수 있습니다. 우리는 CVE 세포에 모욕이 lipopolysac에 노출된다는 것을 증명하고있다charide은 (LPS)는 CVE 세포에서 미토콘드리아의 기능을 손상과 뇌졸중 7 성과 악화. 급 히드로퀴논 (TBHQ)는 CVE 셀 (10)의 산화 적 인산화를 방해하여 뇌졸중 사망률을 증가시킨다. 따라서, CVE 세포뿐만 아니라 조종사 중추 신경계에 대한 메커니즘 관련 연구 시리즈 (CNS) 질환의 생체 에너지 함수의 정량적 모델뿐만 아니라, 혈관 생물학에서 미토콘드리아의 기능을 표적 치료제의 약물 검사에서 돌파구를 제공합니다. 격리 미토콘드리아는 생체 에너지 함수를 측정하는 데 사용되어왔다. 우리 7 등 (11)는 세포 외 플럭스 bioanalyzer를 사용하여 그대로 CVE 세포에서 세포 생물 에너지 학의 평가를보고했다. 분석기는 내인성 세포의 생체 에너지 평가의 이점을 제공한다. 민감한 일관된 분석은 CVE 세포의 미토콘드리아 대사를 측정함으로써 생체 에너지 STI 손상을 평가할 수있다muli는 CVE 세포에서 미토콘드리아의 기능에 영향을 미치는 미토콘드리아 신호 전달 경로의 메커니즘 및 화면 약물이나 치료를 조사합니다. 이 프로토콜에서, 로테 논 및 antimycin의 A. oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드 -4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐 (FCCP) 산소 소모 속도 (OCR)는 네 개의 미토콘드리아 장애 물질의 사용을 조합하여 약리 프로파일 링 방법을 사용하여 bioanalyzer 의해 기록 우리는 세부 사항 하나의 분석에서, 측정 및 기초 미토콘드리아 호흡, ATP 생산, 양성자 누출, 최대 호흡, 및 예비 호흡기 용량을 포함 CVE 세포에서 미토콘드리아 기능 매개 변수의 계산이 가능하게 최적화 된 접근 방식을.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 세포주</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 passages</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>10% 최종 농도</td></tr><tr><td>페니실린/스텝토마이신</td><td>하이클론</td><td>SV30010</td><td>1회; 100 스타킹</td></tr><tr><td>0.25% 트립신, 0.03% EDTA 용액</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 &micro; M 최종 농도</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM 최종 농도</td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>시그마</td><td>O4876</td><td>1.0 &마이크로; M 최종 농도</td></tr><tr><td>카르보닐시아나이드 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP)</td><td>시그마</td><td>C2920</td><td>0.5 &마이크로; M 최종 농도</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 &micro; M 최종 농도</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>시그마</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 &마이크로; M 최종 농도</td></tr><tr><td>플레이트 세척 스테이션</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular flux bioanayzer&nbsp; &nbsp;</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>XFe96</td><td></td></tr><tr><td>세포외 플럭스 세포 배양 플레이트</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>세포외 플럭스 센서 카트리지</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>세포외 플럭스 캘리브런트 용액</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>세포외 플럭스 분석 배지</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102365-100</td><td>PH 분석 전 완충</td></tr></tbody></table>

대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

혈액 - 뇌 장벽 (BBB)의 무결성 뇌 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 뇌 혈관 내피 (CVE) BBB 셀을 구성하는 세포 형 중 하나이며; 이들 세포는 최적의 미토콘드리아 기능을 필요로하는 매우 높은 에너지 수요를 갖는다. 질병 또는 부상의 경우, 이들 세포에서의 미토콘드리아 기능 질환 또는 BBB의 개방의 결과로, 변경 될 수있다. 이 논문에서는 전체 그대로 세포 및 bioanalyzer CVE를 사용하여 세포에서 미토콘드리아의 기능을 측정하는 방법을 소개한다. 미토 응력 분석은 물리적으로나 화학적으로 교란 된 셀 도전, 및 생체 에너지 함수를 계산하는데 사용된다. 또한이 방법은 미토콘드리아 기능에 직접적인 영향을 미칠 새로운 치료제를 스크리닝하는 유용한 방법을 제공합니다. 우리는 미토콘드리아 파라 다양한 계산을 허용 산소 소비 속도를 산출하기 위해 필요한 셀 밀도를 최적화 한ATP 생산, 최대 호흡, 및 예비 용량을 포함 미터. 또한 마이크로 RNA 미르-34A의 도입 미토콘드리아 활성의 현저한 감소 및 검출 리드 것을 입증함으로써 분석의 감도를 나타낸다. 이 논문에 도시 된 데이터가 bEnd.3 세포주에 대해 최적화되지만, 또한 상기 전임상 및 임상 모델에서 유용성을 시사 CVE 차 전지용 프로토콜을 최적화했다.

산화 스트레스에 응답 CVE 세포의 생체 에너지 함수를 평가하기 위해, 우리는 기본 뇌 미세 혈관 내피 세포 (12)와 같은 비교 배리어 특성을 표시하는 쥐의 뇌 미세 혈관 내피 세포주 bEnd.3을 선택했다. 반응 속도 및 반응의 상대 강도가 ​​다양한 세포 유형 사이에서 변화되었는지 주어 실험의 첫 번째 일련의 대사 프로파일을위한 분석에서 사용할 bEnd.3 세포의 최적의 개수를 식별함으로써 측정 OCR 수준을 얻기 위해 설계되었다에 도시 평가에 따라 그림 2. 데이터 정량화 및 그림 3. 기저 호흡, 최대 호흡에 제시 및 예비 호흡기 용량은 세포 밀도에 비례 반응을 보였다된다. 그러나, ATP 생산은 오버 합류 세포 배양가 있음을 시사 잘 당 64 × 10 3 세포를 선택했을 때 감소이 실험에 적합하지 않습니다. 미토콘드리아 장애 물질에 대한 응답에 기초하여 웰 당 3 × 10 32 세포 - 최적의 세포 밀도는 8 ~ 발생. 이후의 실험을 위해, 웰 당 16 × 103 세포 접종 밀도 OCR 변화 최적의 검출을 허용하기 위해 사용되었다. 물론 당 16 × 10 3 세포를 사용하여, 우리는 OCR의 예상 반응을 관찰하고, 마이크로 RNA은 miR-34A는 CVE 세포에서 미토콘드리아 기능 (그림 4)을 감소 시킨다는 것을 보여 주었다. 우리는 이전에은 miR-34A는 이러한 셀 (13)의 산화 적 인산화를 감소 것으로보고있다. 반복 된 실험은 또한 최대 호흡 및 예비 용량이 상당히 큰 변화가 없었다 심지어 기초 호흡, ATP 생산, 양성자 누출 불구하고, 24 시간 후 형질 전환에 된 CVE 미르-34A의 과발현에 의해 감소 된 것으로 나타났다 (그림 4) . 이러한 데이터된 CVE의 미토콘드리아 기능의 변화를 감지하는 bioanalyzer의 감도를 보여준다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> 셀, 판에 대해. 실험에 대한 타임 라인을 1. 전략 기획 그림 및 카트리지 준비가 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> 도 다양한 세포 밀도 CVE 세포 BIOENERGETIC 기능 2. 주제 RAW 데이터. 산소 소모 속도는 다른 세포 밀도 CVE 세포에서 측정 하였다. 데이터는 평균 ± SD 표현한다 (N = 5); OCR : 산소 소비 속도; FCCP : 카본 시안화 -4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐;<html> 부패 / 안티 - A : 로테와 antimycin A에 ①은 ②와 ③ 기초 호흡을 나타냅니다; ④는, ⑤와 ⑥ ATP가 호흡을 연결 표시; ⑦, ⑧, ⑨ 및 최대 호흡을 표시; ⑩, ⑪, ⑫ 및 비 미토콘드리아 호흡을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> 다양한 세포 밀도와 CVE 세포의 생체 에너지 함수의 그림 3. 대표 결과. 기저 호흡, ATP 생산, 최대 호흡, 및 예비 용량이 생물 에너지 학에 의해 생성 된 원시 데이터로부터 계산 그림 수식을 사용하여 2의 기능 분석은 4 절에 표시된 . 데이터는 SD 평균 ± 대표 (N = 5); OCR : 산소 소비 속도.<html> F = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> 그림 4 :은 miR-34A로 감소 BIOENERGETIC 기능의 대표 결과 (A) 미토콘드리아 기능의 원시 데이터는 24 시간 후 형질 전환에은 miR-34A의 과발현 다음.. (B) 기저 호흡, ATP 생산의 최대 호흡 및 예비 용량은 생체 에너지도 4a에 작용 분석에 의해 생성 된 원시 데이터로부터 계산된다; 매개 변수가은 miR-34A의 제 4 과발현에 표시된 공식에 의해 계산 된 24 시간 후 형질 전환에 CVE 세포에서 미토콘드리아의 기능을 감소시킨다. 데이터는 평균 ± SD 표현한다 (N = 5); OCR : 산소 소비 속도. ****, P &lt;0.0001.파일 / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> 표 1 악기 실행 프로토콜.

내피 세포의 미토콘드리아는 혈액 - 뇌 장벽 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 대뇌 혈관 내피 세포에 생체 에너지 기능을 측정 할 수있는 프로토콜을 소개합니다.

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 미토콘드리아 기능의 변화가 신경계 질환의 발달에 어떠한 영향을 미치는지 평가하고, 혈뇌장벽(blood-brain barrier) 개방에 직접적인 영향을 주는 치료제를 설계하는 것입니다. 이 방법은 뇌졸중 이후 신경세포 사멸을 어떻게 최소화할 수 있는가와 같이 신경계 질환 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 손상되지 않은 전체 세포 내 미토콘드리아 기능을 실시간으로 평가할 수 있다는 점입니다.T75 cm² 조직 배양 플라스크에서 뇌혈관 내피세포를 완전 배지 내 37 °C, 5% CO2 조건으로 80% 합류도까지 배양한 후, 세포 배양 배지를 제거하고 trypsin EDTA로 세포를 헹굽니다. 그다음, 1~2 mL의 신선한 trypsin EDTA를 플라스크에 넣고 37 °C에서 3~5분간 처리하여 세포를 탈착시킵니다. 도립 현미경으로 세포가 떨어진 것을 확인한 후, 10 mL의 신선한 완전 세포 배지를 조심스럽게 첨가하여 반응을 중단시키고, 원심분리를 위해 세포를 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다.상층액을 제거하고 펠렛을 10 milliliters의 신선한 완전 성장 배지로 세척한 후 다시 원심분리합니다. 그 다음, 계대 배양을 위해 펠렛을 2 × 10⁵ cells/mL 농도의 완전 성장 배지로 재부유합니다. 적절한 횟수의 계대 배양 후, 96-well extracellular flux 세포 배양 플레이트의 웰당 80 microliters의 완전 배지에 1.6 × 10⁴ cells를 분주하고, 플레이트를 5% carbon dioxide 조건의 37 °C 인큐베이터에 넣습니다.세포가 플레이트에 부착되면, 해당 웰에 원하는 처리제를 첨가하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 미토콘드리아 기능 평가 분석 전날, 150 µL의 extracellular flux calibrant solution으로 extracellular flux censor 카트리지를 습윤화하고, 이산화탄소가 없는 37 °C에서 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 플레이트 워셔 스테이션을 사용하여 세포 배양 배지를 pH 7.0의 extracellular flux assay medium으로 교체합니다.그 다음, 이산화탄소가 없는 37°C에서 세포를 30~60분 동안 배양합니다. 세포가 평형 상태에 도달하면, 수화된 카트리지를 Bioanalyzer에 장착하고 Start 버튼을 클릭하여 캘리브레이션을 시작합니다. 캘리브레이션이 끝나면, Unlock Cartridge 프롬프트를 클릭하여 카트리지 바닥 플레이트를 제거하고 세포 플레이트를 장착합니다.그런 다음 데이터 파일을 열어 Bioanalyzer에서 측정된 속도 값을 확인하고 이를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 뇌혈관 내피세포의 유형에 따라 반응의 역학 및 상대적 강도가 다양하므로, 본 실험에서는 대사 프로파일링 분석에서 산소 소비율 수준을 측정하기 위한 최적의 세포 수를 결정하기 위해 일련의 bEnd. 3 세포 농도를 사용하였습니다.관찰된 바와 같이, 기초 및 최대 호흡률과 예비 호흡 능력은 세포 밀도에 비례하는 반응을 보입니다. 하지만 웰당 세포 농도가 가장 높을 때 ATP 생산량이 감소하며, 이는 과하게 밀집된 세포 배양이 실험에 적합하지 않음을 시사합니다. 최적의 세포 밀도는 웰당 세포 수의 중간 범위에서 나타나는 것으로 보입니다.따라서, 중간 범위의 세포 농도를 사용한 이번 대표 실험에서 예상 산소 소비율 수준을 평가하였으며, 이를 통해 비코딩 전구체 mRNA 분자가 뇌혈관 내피세포의 미토콘드리아 기능을 감소시킨다는 것을 입증하였습니다. 또한 이러한 실험들은 형질전환 24시간 후 뇌혈관 내피세포에서 이들 분자를 과발현시켰을 때, 기저 호흡, ATP 생성 및 양성자 누출에는 유의미한 변화가 없음에도 불구하고 최대 호흡과 예비 능력이 유의하게 감소함을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.세포 플레이팅부터 미토콘드리아 기능 분석까지, 적절하게 수행한다면 가능합니다. 이 실험 절차를 시도할 때, 다른 모든 절차를 시작하기 전에 최적의 세포 밀도를 결정하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억해야 합니다. 본 절차 이후에는 세포 생존율이나 당분해 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여, 세포 생존율 저하 또는 다른 대사 경로의 변화로 인해 미토콘드리아 기능에 발생하는 변화에 대한 추가적인 질문들에 답할 수 있습니다.이 기술은 개발 이후, 분리된 미토콘드리아 대신 온전한 세포를 사용하여 미토콘드리아 기능 분야의 연구자들이 신경 질환, 암 또는 대사 장애를 포함한 다양한 질병을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 뇌혈관 내피세포에서 미토콘드리아 기능을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

이 비디오는 세포외 플럭스 분석을 사용하여 대뇌 혈관 내피(CVE) 세포의 미토콘드리아 기능을 평가하는 방법을 보여줍니다. CVE 세포는 세포외 플럭스 세포 배양 플레이트에 도금되어 있습니다. 세포 외 플럭스 센서는 bioanalyzer에 로딩 및 교정하기 전에 수화됩니다. 그런 다음 세포가 포함된 플레이트가 분석을 위해 로드됩니다.

대뇌 혈관 내피 세포의 미토콘드리아 기능 평가

내피 기능 장애는 수많은 질병 상태와 관련된 인간의 심혈관 사건의 예측이다. 흐름 매개 혈관 확장 (FMD)는 내피 세포 기능을 평가 비 침습적 초음파 방법이다. 방법 론적 선택과 작업자의 경험은 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 인간 연구에서 FMD에 대한 체계적인 접근 방법은 여기에서 논의된다.

임상 연구에서 상완 동맥의 초음파 평가 내피 의존 흐름 매개 혈관 확장

뇌 미세혈관 내피 세포(BMEC)는 혈액과 중추신경계(CNS), 이른바 혈액-뇌-장벽(BBB)을 분리하는 고도로 조절되는 장벽을 형성하는 특정 접합 단백질에 의해 상호 연결되어 있습니다. 이 프로토콜에서 논의된 바와 같이 1차 쥐 뇌 미세혈관 내피 세포의 분리는 BBB의 상세한 체외 연구를 가능하게 합니다.

차 설치류 뇌 미세 혈관 내피 세포의 분리

본 논문은 죽상동맥경화증의 여러 단계를 평가하기 위해 의학 연구에서 일반적으로 사용되는 혈관 기능 및 형태에 대한 몇 가지 비침습적 평가에 대한 방법론적 고려 사항을 설명합니다.

혈관 기능 및 형태의 비 침습적 평가에 대한 방법 론적 접근

우리는 검출 및 정량화 리간드, 혈관 내피 성장 인자 패밀리의 구성원의 활성을 모니터링하는 간단한 셀 기반 생물학적 검정을 기술한다. 분석법은 리간드가 수용체 결합 및 가교 결합의 반 정량적 또는 정량적 평가를 제공하는 인자 의존적 세포주에서 발현 된 키메라 수용체를 사용한다.

혈관 내피 성장 인자의 평가에 대한 간단한 생물 검정

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

우리는 3개의 간단한 시험관내 분석-장거리 이동 분석, 공동 배양 이동 분석, 및 화학-유도 분석-인간 줄기 세포 유래 의 기능을 집합적으로 평가하는 시험관 내 외 내피 세포 및 그들의 GABAergic 인터 뉴런과 상호 작용.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

이 프로토콜은 뇌 혈액 장벽의 신뢰할 수 있고 효율적인 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 방법은 마우스 대뇌 혈관 내피 세포 bEnd.3를 사용하고 막관통 전기 저항을 측정합니다.

경내피 전기 저항 검출을 통한 bEnd.3 혈관 내피 세포의 장벽 기능 무결성 기록

여기에서는 뇌 내피 장벽 강도를 측정하기 위해 임피던스 기반 바이오센서인 ECIS 및 cellZscope를 사용하는 기술을 보여줍니다. 우리는 뇌 내피의 체외 모델에 다양한 자극을 추가하는 준비 및 기술에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 결과를 측정, 기록 및 대표 분석을 제공합니다.

암세포와 사이토카인에 대응하는 두 개의 임피던스 기반 바이오센서를 사용한 뇌내피 장벽 무결성 측정

배우세요 대뇌 혈관 내피 세포의 미토콘드리아 기능 평가 방법을 통해 혈뇌장벽 손상과 신경질환 연구를 수행하세요. 이 기술은 실시간 생체 에너지 분석으로 치료 전략 개발에 활용됩니다.

대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가

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