November 19th, 2016
내피 세포의 미토콘드리아는 혈액 - 뇌 장벽 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 대뇌 혈관 내피 세포에 생체 에너지 기능을 측정 할 수있는 프로토콜을 소개합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 미토콘드리아 기능 변화가 신경 장애의 발달에 어떤 영향을 미치는지 평가하고 혈액 뇌 장벽 개방에 직접적인 영향을 미치는 치료법을 설계하는 것입니다. 이 방법은 뇌졸중 후 신경 세포 사멸을 어떻게 최소화할 수 있는지와 같은 신경 장애 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 전체 세포에서 미토콘드리아 기능을 실시간으로 평가할 수 있다는 것입니다.
T75cm 제곱 조직 배양 플라스크에서 섭씨 37도, 이산화탄소에서 80% 포화도에서 대뇌 혈관 내피 세포를 완전한 배지로 성장시킨 후 세포 배양 배지를 버리고 트립신 EDTA로 세포를 헹굽니다. 그런 다음 1-2ml의 신선한 트립신 EDTA를 플라스크에 넣고 섭씨 37도에서 3-5분 동안 세포를 분리합니다. 도립 현미경으로 세포가 들어올려진 것을 확인한 후, 10ml의 새로운 완전 세포 배지를 부드럽게 첨가하여 반응을 중지하고 원심분리를 위해 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
상등액을 버리고 또 다른 원심분리를 위해 10ml의 신선한 완전 성장 배지로 펠릿을 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 완전 성장 배지에 2 배 10에서 밀리리터 당 5 세포 농도로 다시 현탁시켜 하계 배양을 위해 적절한 수의 계대배양 후, 웰당 80마이크로리터의 완전한 배지에 있는 4번째 세포의 1.6배를 96웰 세포외 플럭스 세포 배양 플레이트에 파종하고 플레이트를 5%의 이산화탄소가 있는 섭씨 37도의 인큐베이터에 놓습니다.
세포가 플레이트에 부착되면 적절한 웰에 관심 처리제를 추가하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 미토콘드리아 기능 평가 분석 전날, 150마이크로리터의 세포외 플럭스 검열 카트리지에 수화하고 이산화탄소 없이 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음 날 아침, 플레이트 세척기 스테이션을 사용하여 세포 배양 배지를 pH 7.0 세포외 플럭스 분석 배지로 변경합니다.
그런 다음 이산화탄소가 없는 섭씨 37도에서 30-60분 동안 세포를 배양합니다. 세포가 평형을 이루면 수화 카트리지를 Bioanalyzer에 로드하고 시작 버튼을 클릭하여 보정을 시작합니다. 보정이 끝나면 Unlock Cartridge(카트리지 잠금 해제) 프롬프트를 클릭하여 카트리지 바닥판을 제거하고 셀 플레이트를 로드합니다.
그런 다음 데이터 파일을 열어 스프레드시트 파일로 내보내기 위해 Bioanalyzer에서 속도 값을 가져옵니다. 반응의 역학 및 상대적 강도가 다양한 대뇌 혈관 내피 세포 유형에 따라 다르다는 점을 감안할 때, 이 실험에서는 일련의 bEnd 농도가 나타났습니다. 대사 프로파일링 분석에서 산소 소비율 수준을 측정하기 위한 최적의 세포 수를 식별하기 위해 3개의 세포를 사용했습니다.
관찰된 바와 같이, 기저 호흡 및 최대 호흡 및 예비 호흡 능력은 세포 밀도에 대한 비례 반응을 보여줍니다. 그러나 ATP 생산은 웰당 가장 높은 농도의 세포를 사용할 때 감소하며, 이는 과잉 융합 세포 배양이 실험에 적합하지 않음을 시사합니다. 최적의 세포 밀도는 웰당 세포 수의 중간 범위에서 발생하는 것으로 보입니다.
따라서 이 대표적인 실험에서 중간 범위의 세포 농도를 사용하여 예상 산소 소비율 수준을 평가하여 비코딩 전구체 mRNA 분자가 대뇌 혈관 내피 세포의 미토콘드리아 기능을 감소시킨다는 것을 입증했습니다. 또한 이러한 실험은 기저 호흡, ATP 생산 및 양성자 누출이 유의한 변화를 나타내지 않더라도 형질주입 후 24시간에 대뇌 혈관 내피 세포에서 이러한 분자의 과발현으로 인해 최대 호흡 및 예비 용량이 크게 감소한다는 것을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.
세포를 도금하는 것부터 미토콘드리아 기능에 접근하는 것까지, 제대로 수행된다면. 이 절차를 시도하는 동안 다른 절차를 시작하기 전에 최적의 세포 밀도를 결정하는 것이 매우 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 생존율 또는 해당작용 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 생존력 감소 또는 다른 대사 경로의 변화로 인해 미토콘드리아 기능에서 발생하는 변화에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.
개발 후 이 기술은 미토콘드리아 기능 분야의 연구자들이 고립된 미토콘드리아 내부와 신경 질환, 암 또는 대사 장애를 포함한 다양한 질병 내부의 온전한 세포를 사용할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 대뇌 혈관 내피 세포에서 미토콘드리아 기능에 접근하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 기사는 뇌 혈관 내피 세포에서 미토콘드리아 기능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 혈액-뇌 장벽 무결성을 유지하는 데 중요합니다. 이 방법은 미토콘드리아의 변화가 신경학적 장애에 어떻게 기여하는지 이해하는 것을 목표로 합니다.
Quantitative assessment of mitochondrial function in cerebral vascular endothelial cells enables early de-risking of blood-brain barrier (BBB) integrity mechanisms in neurological disease models. Real-time bioenergetic profiling supports predictive confidence in target validation and informs therapeutic strategies aimed at modulating BBB permeability. This capability is critical for portfolio decisions in neurovascular and CNS drug discovery pipelines.
This mitochondrial function assay positions within early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research for neurovascular programs.