2016년 12월 10일
이 프로토콜은 임상 적으로 관련 및 유전자 다루기 쉬운 변형, R20291를 사용 클로스 트리 디움 디피 감염 (CDI)의 cefoperazone 마우스 모델을 설명합니다. 임상 질병 모니터링, C. 디피 세균 열거, 독소의 세포 독성 및 마우스 모델에서 CDI에 걸쳐 조직 병리학 적 변화에 대한 강조는 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 임상 질병 모니터링, 박테리아 계수, 독소 세포 독성 및 챌린지 후 조직병리학적 변화에 특히 중점을 두고 Clostridium difficile 감염의 cefoperazone 마우스 모델을 구현하기 위한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 이 상세한 프로토콜은 연구원들이 클로스트리듐 디피실 감염의 마우스 모델을 정확하게 실행하는 데 도움이 될 것이며, 이는 이 박테리아의 발병 기전을 연구하고 새로운 치료법에 접근하는 데 필수적입니다. 이 마우스 모델을 사용하는 주요 이점은 5일 동안 하나의 항생제에 노출되면 마우스가 C.difficile의 집락화에 취약해지고 인간 질병과 동시에 장기간 감염 임상 과정에 취약해진다는 것입니다.
시작하려면 관심 및 와류의 C.difficile 주식 변형을 예로 들어 보겠습니다. 층류 후드에서 스크류 캡 튜브의 멸균 된 물에 스톡을 25 마이크로 리터 당 10-5 포자의 농도로 희석합니다. 혼합물에 포자 접종으로 라벨을 붙이고 튜브를 섭씨 65도의 수조에 20분 동안 넣습니다.
다음으로, 층류 후드에서 가열된 포자 접종물 50마이크로리터를 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 더 사용할 때까지 혐기성 챔버에 전달합니다. 남은 포자 접종물을 멸균 전구 팁이 있는 위 간침에 부착된 1ml 주사기에 로드합니다. 층류 후드에서 대상 마우스를 잡고 목과 등의 느슨한 피부로 동물을 부드럽게 제지하여 머리를 고정시킵니다.
검지 손가락을 사용하여 동물이 소리를 내거나 고통의 징후를 보이지 않도록 하면 동물의 머리를 더 움직이지 못하게 하고 식도를 늘립니다. 마우스를 수직으로 세우고 개비지 바늘을 입 옆으로 부드럽게 통과시킵니다. 입천장을 따라 위장 바늘을 향하게 하고 천천히 식도로 밀어 넣습니다.
바늘이 식도에 약 절반 정도 들어가면 25마이크로리터의 포자 접종물을 주입한 다음 바늘을 부드럽게 빼냅니다. 동물을 우리로 되돌려 놓고 부주의한 기관 투여를 나타낼 수 있는 기침이나 호흡 곤란의 징후가 있는지 관찰합니다. 다음으로, 이전에 혐기성 챔버에 보관된 포자 접종 분취액과 남아 있는 위 포자 접종액을 취하고 1x PBS의 180마이크로리터에 1-10개의 연속 희석을 합니다.
이러한 희석 중 4-5개를 수행합니다. 무균 기술을 사용하여 각 직렬 희석액 100마이크로리터를 개별 TCCFA 플레이트로 옮깁니다. 매번 새로운 멸균 L자형 스프레더를 사용하여 각 플레이트에 희석 접종물을 고르게 분배합니다.
섭씨 37도에서 24시간 동안 혐기성 조건에서 플레이트를 배양합니다. 마지막으로, 각 희석 플레이트에서 C.difficile 집락을 세고 집락 형성 단위를 계산하여 마우스에 투여된 감염 용량을 얻습니다. 평가를 위해 생쥐의 배설물 샘플을 채취하려면 먼저 목과 등의 느슨한 피부로 피험자 생쥐를 가볍지만 단호하게 제지하여 동물이 고통에 빠지지 않도록 합니다.
새끼손가락으로 동물의 꼬리를 부드럽게 들어 올려 항문을 드러냅니다. 알려진 무게의 멸균 미세 원심분리기 튜브를 동물의 항문 바로 아래에 잡고 튜브가 마우스에 직접 닿지 않도록 합니다. 동물이 배변할 때 튜브에 배설물 알갱이를 모으십시오.
필요한 모든 샘플이 수집될 때까지 튜브를 실온에서 보관하십시오. 분석 저울에서 대변이 들어있는 튜브의 무게를 측정하고 질량을 소수점 이하 네 자리까지 기록합니다. 튜브의 무게를 빼서 배설물 펠릿의 무게를 계산합니다.
다음으로, 내용물의 1-10 희석을 계산하고 1x PBS로 재현탁합니다. 피펫 끝을 사용하여 배설물을 용액으로 부드럽게 파괴합니다. 샘플을 실온에서 30분 동안 배양하여 내용물이 가라앉을 수 있도록 합니다.
용액을 혐기성으로 유지하면서 1x PBS의 각 샘플에 대해 연속 희석을 수행합니다. 각 직렬 희석액 100마이크로리터를 TCCFA 플레이트에 옮깁니다. 멸균 L자형 스프레더를 사용하여 미디어를 플레이트에 고르게 적용합니다.
섭씨 37도의 혐기성 조건에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 마지막으로, C.difficile 군체를 열거하고 배설물 함량 그램당 군집 형성 단위를 계산합니다. 이 그림은 C.difficile R20291에 대한 챌린지 이후 며칠 동안의 마우스 무게를 보여줍니다.
0일차에는 기준 가중치가 100으로 설정됩니다. 평균 생쥐 체중은 이후 14일 동안 매일 측정되었습니다. 챌린지 후 2일에서 7일째에 챌린지를 받은 마우스에서 체중의 현저한 감소가 관찰되었습니다.
생쥐는 이 시점 이후에 회복되고 체중이 다시 증가하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 챌린지 후 며칠 동안의 대변에 있는 C.difficile 부하가 표시됩니다. 챌린지 후 24시간이 지나면 모든 마우스는 대변 그램당 10-7번째 CFU로 군락화되었습니다.
이 부하는 7일째부터 감소했지만 C.difficile은 여전히 존재합니다. 감염 기간 경과에 따른 생쥐의 조직병리학적 검사에서 맹장에서 가장 유의한 병리학적 변화가 나타났습니다. 총 두부 조직학적 점수는 챌린지 후 0일차와 2일차 및 4일차 사이에 유의한 차이를 보였습니다.
일반적으로 이 마우스 모델을 처음 접하는 개인은 마우스에 도전하는 데 사용되는 포자 접종물의 계산 및 준비와 분변 C.difficile 박테리아 부하의 계산에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 마우스에 투여된 C.difficile 포자의 용량 또는 균주의 변형이 이 모델의 결과를 변경할 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.
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본 프로토콜은 임상적으로 관련된 균주 R20291을 사용하여 클로스트리디움 디피실 감염(CDI)의 세페로존 쥐 모델을 설명합니다. 이는 CDI 전반에 걸쳐 임상 질병 모니터링, 세균 계수, 독소 세포독성 및 조직병리학적 변화를 강조합니다.
The cefoperazone-treated mouse model using C. difficile strain R20291 enables translationally relevant evaluation of novel therapeutics targeting chronic and recurrent Clostridium difficile infection. By recapitulating the prolonged clinical course and non-uniform lethality observed in human CDI, this model supports predictive confidence in preclinical efficacy and mechanistic de-risking for anti-infective portfolios. Its quantitative outputs and disease-relevant endpoints position it as a critical inflection point for therapeutic candidate triage and advancement.
This model bridges early discovery and preclinical validation by providing a robust platform for hypothesis testing, efficacy screening, and translational assessment of anti-C. difficile interventions.