의 Cefoperazone 처리 된 마우스 모델 임상 관련

본 프로토콜의 전체적인 목표는 임상 질환 모니터링, 세균 수 측정, 독소 세포독성 및 감염 후 조직병리학적 변화에 중점을 두어, cefoperazone을 이용한 Clostridium difficile 감염 마우스 모델을 구현하기 위한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 이 상세 프로토콜은 연구자가 Clostridium difficile 감염 마우스 모델을 정확하게 수행할 수 있도록 도와주며, 이는 해당 박테리아의 병인 연구 및 새로운 치료법을 평가하는 데 필수적입니다. 이 마우스 모델의 주요 장점은 5일 동안 한 가지 항생제에 노출시키면 마우스가 C.difficile 군락 형성에 취약해지며, 인간의 질병과 유사하게 감염의 임상 경과가 장기간 지속된다는 점입니다.

먼저, 사용할 C.difficile 보존 균주를 꺼내어 볼텍싱합니다. 층류 정화대(laminar flow hood) 내에서, 스크류 캡 튜브에 담긴 멸균수에 보존 균주를 희석하여 25 µL당 10⁵ spores 농도가 되도록 조절합니다. 해당 혼합물에 '포자 접종액(spore inoculum)'이라고 표시한 후, 튜브를 65 °C 항온수조에 20분 동안 둡니다.

다음으로, 층류 정화대(laminar flow hood) 내에서 가열된 포자 접종액 50 µL를 멸균 마이크로원심분리 튜브에 피펫으로 옮긴 후, 추후 사용 시까지 혐기성 챔버로 이동시킵니다. 남은 포자 접종액을 멸균 벌브 팁 위장 존대 바늘(bulb tipped gastric gavage needle)이 장착된 1 mL 주사기에 충전합니다. 층류 정화대 내에서 실험 쥐를 준비하고, 동물의 목과 등 쪽의 느슨한 피부를 부드럽게 잡아 머리를 고정합니다.

검지 손가락을 사용하여 동물이 소리를 내거나 고통스러운 징후를 보이지 않도록 주의하며 동물의 머리를 추가로 고정하고 식도를 늘려줍니다. 마우스를 수직으로 똑바로 세운 상태에서 가바지 바늘을 입 옆쪽으로 부드럽게 삽입합니다. 가바지 바늘을 입천장을 따라 유도하여 식도 내부로 천천히 진입시킵니다.

바늘이 식도의 약 절반 정도까지 진입하면, 포자 접종액 25 µL를 주입한 후 바늘을 천천히 뽑습니다. 동물을 케이지로 돌려보내고, 의도치 않게 기관으로 투여되었음을 나타낼 수 있는 기침이나 호흡 곤란 징후가 있는지 관찰합니다. 다음으로, 이전에 혐기성 챔버에 보관해 두었던 포자 접종액 분취액과 남은 가바지(gavage) 포자 접종액을 사용하여 180 µL의 1x PBS에서 10배 연속 희석을 수행합니다.

이 희석 과정을 4~5회 반복합니다. 무균 조작법을 사용하여 각 단계별 희석액 100 µL를 개별 TCCFA 플레이트에 옮깁니다. 매번 새로운 멸균 L자형 스프레더를 사용하여 각 플레이트에 희석된 접종액을 균일하게 도포합니다.

플레이트를 37°C의 혐기성 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 각 희석 플레이트에서 C.difficile 콜로니 수를 측정하고 콜로니 형성 단위(CFU)를 계산하여 마우스에 투여된 감염 용량을 구합니다. 평가를 위해 마우스로부터 분변 샘플을 수집하려면, 먼저 마우스가 스트레스를 받지 않도록 주의하며 목과 등의 느슨한 피부를 가볍지만 단단하게 잡아 고정합니다.

새끼손가락을 사용하여 동물의 꼬리를 부드럽게 들어 올려 항문을 노출시킵니다. 무게를 알고 있는 멸균 마이크로원심분리 튜브를 동물의 항문 바로 아래에 대고, 튜브가 마우스에 직접 닿지 않도록 주의합니다. 동물이 배변하면 튜브에 분변 펠릿을 수집합니다.

필요한 모든 샘플을 수집할 때까지 튜브를 실온에서 보관하십시오. 분석 저울을 사용하여 분변이 담긴 튜브의 무게를 측정하고, 소수점 넷째 자리까지 질량을 기록하십시오. 튜브의 무게를 빼서 분변 펠릿의 무게를 계산하십시오.

다음으로, 내용물을 1:10으로 희석하여 1x PBS에 재현탁합니다. 파이펫 팁을 사용하여 분변 물질을 용액 속으로 부드럽게 분쇄합니다. 샘플을 실온에서 30분 동안 배양하여 내용물이 가라앉도록 합니다.

용액을 혐기성 상태로 유지하면서, 각 시료에 대해 1x PBS로 단계별 희석을 수행합니다. 각 단계별 희석액 100 µL를 TCCFA 플레이트에 옮깁니다. 멸균된 L자형 스프레더를 사용하여 배지에 고르게 도말합니다.

플레이트를 혐기성 조건의 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 마지막으로, C.difficile 콜로니 수를 측정하고 분변 함량 g당 콜로니 형성 단위(colony forming unit)를 계산합니다. 이 그림은 C.difficile R20291 감염 후 날짜별 마우스의 체중 변화를 나타냅니다.

0일 차에 기저 체중을 100으로 설정하였다. 이후 14일 동안 매일 마우스의 평균 체중을 측정하였다. 챌린지 후 2일에서 7일 사이에 챌린지군 마우스에서 유의미한 체중 감소가 관찰되었다.

이 시점 이후로 마우스들은 회복되어 체중이 다시 증가하는 것으로 보였습니다. 여기서는 감염 후 수일 동안 분변 내의 C.difficile 부하량이 표시되어 있습니다. 감염 후 24시간 시점에서 모든 마우스의 분변 1g당 10⁷ CFU가 군집을 형성하였습니다.

이 균 부하는 7일째부터 감소했으나, C.difficile은 여전히 존재했습니다. 감염 경과에 따른 마우스의 조직병리학적 검사 결과, 맹장에서 가장 유의미한 병리학적 변화가 나타났습니다. 전체 맹장 조직학적 점수는 challenge 후 0일째와 2일 및 4일째 사이에 유의미한 차이를 보였습니다.

일반적으로 이 마우스 모델을 처음 접하는 연구자들은 마우스에 감염을 유도하기 위해 사용되는 포자 접종액의 계산 및 조제와 분변 내 C.difficile 세균 부하량 계산에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 프로토콜을 수행할 때, 마우스에 투여하는 C.difficile 포자의 용량이나 균주를 변경하면 모델의 결과가 달라질 수 있다는 점을 유념하는 것이 중요합니다.