Name: SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: 학습하세요 SAXS 빔라인에서 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피를 활용한 단백질 구조 분석 방법. 이 기술은 샘플 변성을 최소화하고 고품질의 저해상도 구조 데이터를 획득하여 구조생물학 연구의 신뢰성을 높입니다.

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우리는 프랑스 보조금 REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014와 Service de Santé des Armées 및 Délégation Générale pour l'Armement의 연구 보조금으로 프로젝트에 대한 재정적 지원을 인정합니다. SAXS 빔 시간에 대해 ESRF에 감사드립니다. 재정적, 과학적 지원을 해주신 앤드류 맥카시(Andrew McCarthy), 고든 레너드(Gordon Leonard), 빔 버마이스터(Wim Burmeister), 가이 쇤(Guy Schoehn)에게 감사드립니다.

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많은 고분자를 들어, 크로마토 그래피를 이용하여 최종 정제 단계는 양질의 데이터 세트를 획득 할 SAXS 데이터 수집에 앞서 요구된다. 그러나 모든 샘플은 안정적으로 유지; 그들은 올리고머 상태의 혼합물에 통합 또는 재 평형하는 경향이있을 수 있습니다. 따라서, 빔라인에 온라인 최종 정제 단계는 최고 품질 SAXS 데이터를 얻기 위해서 정제 및 데이터 수집 사이의 시간을 최소화하기 위해 요구된다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC-SAXS 또는 IEC-SAXS 최적 샘플 품질을 얻기 위해 선택 될 수있다. 여기서, 헬리 케이즈 / 프리 메이스 D5 유래의 단백질 구조에서 두 가지 기술이 설명되고 논의된다. SEC-SAXS 데이터의 수집은 점점 더 표준화되고 많은 BioSAXS의 빔라인에 사용할 수 있습니다. 데이터 분석, 특히 배경 뺄셈은 비교적 간단하고 쉽습니다. 그러나, 안정된 버퍼 신호및 거대 분자 화학 종의 충분한 분리가 필수적 남아있다. 따라서, 충분히 열을 평형화하기에 충분한 시간을 확보하는 것이 중요하다. 이 방법의 실패이자, 낮은 농도, 방사선에 민감한 버퍼의 단백질과 유사한 크기의 영구적 인 오염 물질에 기인 할 수있다. 실제로, 초기 SEC-SAXS 대부분의 고분자 샘플 선택의 방법으로 사용될 가능성이 높다. 여전히, 많은 정제 프로토콜은 오염물 또는 응집의 존재로 인해 종래 IEC 단계를 필요로한다. 각 농도 및 크로마토 그래피 단계 (30 % ~ 50 %로 추정) 샘플 및 시간 손실과 연관되어 있음을 감안할 때, 직접 IEC-SAXS 유리하다. SEC에 의해 정제 할 수없는 샘플 인해 비슷한 크기의 &quot;오염&quot;의 존재 또는 필요한 농도 심각 골재 IEC-SAXS 항상 더 적합한 방법이 될 것이기 때문에 그 것이다. 또한, 높은 유속 지원많은 IEC 칼럼 정제 및 측정 사이의 전송 시간을 줄일 수있다. 여기에 제시된 실시 예에서, IEC 신중 염 농도 단계를 선택하여 오염물로부터 D5의 323-785 가까운 피크의 분리를 허용하는 단계 용출로 사용 하였다. 원칙적으로, 단계의 수는 무제한이지만, 사실상, 피크 당 적어도 한 단계가 필요하며, 너무 많은 생략 선택되어야한다. 전술 한 배경 차감 법의 경우, 매칭을 찾기 위해 다른 버퍼 조성물의 상대적으로 높은 수를 측정하는 것이 중요하다. 두 기술의 공유 단점은 정확한 단백질 농도 정보의 부족이다. 이 때문에, 앞으로 산란을 기반으로 정확한 질량 측정 할 수 없습니다. 예 D5 323-785 같은 구형 단백질의 Porod 부피는 매우 유연 또는 무질서 단백질하지만 덜 정확한 질량 추정 불구 대안을 제공한다이 방법은 유효하지 않습니다. 여기에 제시된 단계적 구배 IEC-SAXS 방법의 변형 대신에 선형 구배를 사용하는 것이다. 이 단계적인 용출을 이용하여 서브 - 피크를 분리 할 목적으로 상기 선형 그라데이션 방법에서 많은 단계에서 작동하는 것이 가능하지만, 이는 전적으로 SAXS 시작 전에 피크를 분리하기 위해 신중 구배 조건을 최적화 할 필요 실험. 이 방법에 배경 차감 프레임 현명 할 수 있고, 각각의 프레임들의 비교에 의해 확인 될 수 있지만,보다 고급 데이터 처리를 요구하고, 전용 소프트웨어는 아직 존재하지 않는다. 그것은 거대 분자 종의 분리를 결정한 적당한 컬럼의 선택은 두 가지 기술에 중요하다. 이온 교환 컬럼 종류 및 밀도에 변화하면서 크기 배제 컬럼은, 적재 능력, 분리 거대 분자의 크기 범위 및 해상도에 차이가자신의 고정 요금. 여기에 제시된 프로토콜은 간단 원칙적으로 다른 SAXS 빔라인 인에 ESRF 빔라인 BM29, 적응, 특정된다. 주요 요건은 생성 할 수있는 충분히 높은 X 선 광속 초 이하의 범위에서 합리적인 신호 - 대 - 잡음 데이터를 획득하기에 적합한 검출기 (이상적인 단일 광자 카운팅), 온라인 액체 크로마토 그래피 시스템이다 그라디언트. 정확한 구현은 물론, 로컬 빔라인 환경에 의존 할 것이다. 두 가지 방법을 사용 D5 323-785에서 얻어진 결과는 약간 다르다. 관성 반경은 SEC 데이터보다 IEC 데이터 약간 작고, 산란 곡선의 국부 최소치는 약간 큰 산란 벡터로 전환된다. 이는 IEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 약간 더 작고 SEC-SAXS으로 측정 D5 323-785 이상임을 의미한다. 이 ㄱ 있습니다SEC에 정제 된 시료 중의 오염물에 덜 정제과 측정 사이의 시간에서 샘플 준비의 차이 (IEC 빠른 경우), 또는,에 의한 전자. 두 가지 방법으로 완전히 독립적으로 얻어진 비드 모델 (그림 1H) 비교할 수 있습니다. D5 323-785은 예상 중공, hexameric 구조 (18)를 보여줍니다. 결론적으로, 온라인으로 이온 교환 및 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 SAXS 6,7,9-12,25,26에 직접 결합 될 수있다 중요한 생화학 적 정제 방법이다. IEC-SAXS 데이터의 배경 차감 약간 SEC-SAXS보다 더 어려운 애매한이지만, 그럼에도 불구하고있다. 관심 단백질의 생물 리 학적 특성에 따라 SEC 및 IEC-SAXS 모두 고유의 장점 종 분리의 최적화를 허용한다. 유효성 검증 단계 (설명) 정확하게 관찰되어, 결과 데이터를 분석 할 수있는 재치 제공H 신뢰도 및 모델은 커뮤니티 내에서 사용 가능한 표준 도구를 사용하여 결정될 수있다. 함께, 두 가지 기술 표준 정적 측정을 통해 액세스 할 수없는 데이터를 산출, 생물학적 거대 분자의 광범위한 온라인 분리 할 수 ​​있습니다.

BioSAXS는 나노 크기의 물체 1-4의 형상을 결정하기위한 강력한 도구이다. 나노 크기 범위에서 고분자를 함유 한 용액에 의한 X 선의 산란이 매우 낮은 각도로 기록된다. 이 각도 범위는 글로벌 매개 변수에 대한 정보가 포함되어 관성 반경을; 가장 큰 입자 내 거리; 입자 형상; 및 폴딩, 변성, 또는 장애의 정도. 결정하는데 도움이되는 기술의 결정을 필요로하지 않고, 거대 분자가 이온 성 등 강도, pH가 이러한 요인의 지식 셀 특정 중요 파라미터를 흉내 낸 상태로 유지 될 수있다, 따라서 용액 내에서 유지하고, 예를 들면, 또는 관심의 단백질의 생리 학적으로 관련 올리고머 상태는 복잡한의 제안 된 모델의 유효성을 검사합니다. 다른 버퍼 조건에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 특성 누락 도메인 모델의 작성, 상 동성 모델을 정제하고, 디이산 접혀 펼친 상태의 종료가 빠르고 쉽게 5 행할 수있다. 유엔 해석 데이터가 발생할 수 있습니다 집계 또는 변성 샘플, 입자의 혼합물, 이기종 샘플, 방사선 손상, 버퍼 불일치 : 어떤 기술과 마찬가지로, BioSAXS는 본질적인 약점을 가지고있다. 많은 분석 방법의 경우, 묵시적 샘플을 실제로 얻는 것이 종종 어렵다 요구가 단 분산 인 것으로한다. 많은 경우에, 시료의 열화 미묘한 자체의 데이터를 검출 할 수없고, 데이터를 해석하는 시도가 부정확 또는 잘못된 결과를 제공한다. 이러한 장애를 극복하기 위해, 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 SAXS의 조합은 데이터 품질을 보장하고 어려워 시료 6-11이 기술은 더 접근 할 수 있도록 다수의 빔라인에서 구현 하였다. 최근에, 우리는 온라인으로 이온 교환을 개발하여 레퍼토리에 새로운 방법을 추가크로마토 그래피 (IEC)는 SAXS 12 -coupled. 두 기술은 분석하기 이전에 불가능한 생물학적 입자들의 광범위한 SAXS를 개방한다. 사용되는 방법의 선택은 관심의 입자의 생물 리 학적 특성에 의존한다. SEC는 겉보기 분자 질량의 적어도 10 % 차이가 분리된다 필요한 크기에 의해 고분자를 분리한다. 칼럼과 시료의 생리 학적 특성의 물리적 제한은 소수성 표면, 유연성, 안정성의 부족과 같이 또한 데이터 수집, 분석과 해석을 복잡. 은 IEC 칼럼, 따라서, 그들의 결합 친화도를 그 전하에 기초하여 분자를 분리하고, 이온 교환 크로마토 그래피는 대신 또는 SEC에 더하여 사용될 수있다. 총 전하를 용이하게 제어 EL 비교적 간단한 방법을 pH를 변경 또는 버퍼의 염 농도를 변화 제공함으로써 조작 될 수있다은 IEC 열에서 분자의 ution. 전하를 사용함으로써, 별도로 분리하기 어렵 유사한 종류 및 크기의 분자의 분리는, IEC에 일상적으로 수행 될 수있다. 또한, IEC 하나의 단백질을 변성의 위험을 가지고 농도 단계를 피할 수 있도록 희석하여 시료를 처리 할 수 ​​있다는 장점을 갖는다. 전하 분포가 높은 샘플에 의존 불행히도, IEC는 pH와 염 농도 (13, 14)에 대한 최적화가 필요합니다. 표현 정화, 또는 두 가지 모두 어려운 많은 단백질의 경우, 샘플의 낮은 양의 공부를 할 수 있습니다. 이는 효율적으로하고, 따라서, 손실을 정제 단계의 수를 최소화하는 것이 중요하다. 이 때문에, 최종 정제 단계는 양호한 데이터 세트를 수집 할 가능성을 증가시키기 위해, 온라인 SAXS 데이터 취득 직접 종래이다. 이리우리는 선물 및 온라인 SEC-SAXS 및 IEC-SAXS를 비교합니다. 두 기술은 그르노블, 프랑스 15 유럽 방사광 시설 (ESRF)에서 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현되었다. 테스트 케이스로서, 우리는 다른 방법을 이용하여 구조적으로 분석 오히려 곤란했던 백시 니아 바이러스 단백질 D5의 D5N 및 헬리 케이즈 도메인을 사용 하였다. 백시 니아 바이러스는 Poxviridae 가족의 일원이며, 천연두 바이러스, 천연두의 원인으로 98 % 동일하다. 백시 니아 시스템을 사용하여, 우리는 필수 헬리 케이즈 - 프리 메이스의 D5에 여기에 집중 복제 장치를 연구한다. D5는 시스테인 클러스터 영역 (입술. 240-345) (16) 다음에 N 말단 archeo 진핵 프리 메이스 (AEP) 도메인 (16) 95-kDa 단백질이다. 또한 C 말단쪽으로 D5N 도메인 (입술. 340-460)을 제공 항상 D5 형 헬리과 관련된, 그리고 마지막 세 수퍼 패밀리 (SF3) 헬리 케이즈 도메인된다 (입술. 460-785)을 17 (Figur전자 1A). D5의 헬리 케이즈 도메인 꽉 DNA에 결합하는 데 필요한 hexameric 환 구조를 구축한다. 감사 및 EM SAXS 최근 연구에 상기 프리 메이스의 저해상도 구조 및 헬리 케이즈 도메인은 이제 18 알려져있다. 여기, 우리는 D5의 (323-785 잔류 물) C- 말단 단편의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 ESRF의 BioSAXS 빔라인 BM29에 구현 된 온라인 크로마토 그래피 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-디티오트레이톨 [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR 마스터 믹스</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>빙하 VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 원심 필터 Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin 나트륨 소금</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>완전한 프로테아제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG 탈염 컬럼</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR 화학 물질 (BDH Prolabo)</td> <td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF 니켈 친화성 젤</td><td>시그마</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>VWR 화학(BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수 Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR 화학 물질 (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>발효</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb 벡터&nbsp;</td><td>애드진</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>프라이머</td><td>&nbsp; Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 키트</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 안전한 DNA 젤 염색</td>제 <td>Invitrogen 생명 기술</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>집에서 만든</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen 생명 기술</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R 칼럼&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline 제어 소프트웨어 BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>로컬 개발</td></tr><tr><td>Camserver 소프트웨어</td><td>Dectris</td><td>n.a.detector</td> <td>제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio 모델 정렬 프로그램&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio 모델 재구성 프로그램</td></tr><tr><td>HPLC 프로그램 Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC 프로그램</td><td>LabSolutions Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>지역 개발</td></tr>실험용 SAXS <tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td></td>로 조작을 수행하는 PRIMUS ATSAS 2.6.0 http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html 프로그램 https://www.pymol.org/ <td>시각화를 위한</td></tr><tr><td>소프트웨어 SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td></td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html 3D 구조를 중첩하는 프로그램</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologic Biofrac 분획 분취기</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC 시스템</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim 생명공학</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

saxs 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

생물학적 소각 X 선 산란 (BioSAXS)의 용액 구조, 입자 크기 및 형상, 및 고분자의 표면 대 부피 비율을 결정하는 데 사용되는 분자 구조 생물학에서 강력한 기술이다. 기술 등의 농도, pH 값, 이온 세기, 온도, 첨가제, 넓은 범위에 걸쳐 용액 상태의 매우 다양한 적용이지만, 단 분산 샘플 할 필요가있다. 이주의해야 할 점은 SAXS 빔라인에 액체 크로마토 그래피 시스템의 구현되었다. 여기서, 우리는 빔라인의 크기 - 배제 (SEC), 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC)의 상류의 통합을 설명하는 최적 배경 차감하고, 데이터 감소하는 다른 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 우리는 우리가 D5N의 헬리 케이즈 도메인으로 구성된 필수 우두 바이러스 단백질 D5의 단편에 사항을 유의 및 IEC-SAXS를 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 번째의 hexameric 구조를 보여주는 전체적인 형상 및 분자량을 결정전자 단백질.

모델없이 불변 분석의 결과는 표 1에 나열되어있다. D5 323-785 SEC-SAXS 데이터의 분석은 338 kDa의 대 345 kDa의의 (a Porod 분석)에서 분자 질량 추정을 보였다 IEC-SAXS을 사용하여 관찰 하였다. 둘 다 헥사 6 회 53.5 kDa의 (321 kDa의)의 예상 질량과 일치한다. 두 데이터 세트의 순이 론적 모델링은 더 부과 대칭으로 수행되었다 (SEC-SAXS : χ 2 = 0.88, IEC-SAXS : χ 2 = 3.1) 및 C6 대칭을 사용하여 (SEC-SAXS를 : χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ (2) = 4). 모두 복원을위한 산란 데이터 전체 맞는 두 가지 경우 (도 1D 및 E)에 비교할 때, C6 대칭을 가정 할 수있다. 따라서, 모델 (SEC 부분적으로 차단 된 중앙 채널 표시와 육각 콘형 구조에 대응한다 :도 1 층;을 IEC : <str>그림 1H). 평균화 전에 개별 모델 시험이 방해가 평균화 처리의 이슈가 될 가능성이 있음을 보여준다. </str><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> 그림 1 : SAXS 데이터 분석 및 비교 D5 (323)의 -785 (그림 참조 12 및 18에서 적응). D5 단백질 및 D5 323-785의 A) 도식 도메인 구조. B)이 세 개의 피크의 표시와 함께 오프라인 이온 교환 크로마토. 오렌지 곡선 : 280 nm의 (노소), 파란색 곡선에서 흡광도 : 피크에서 버퍼 B의 버퍼 B. 백분율의 비율이 표시됩니다. C) 온라인 이온 교환 크로마토 그램. B.에서와 같은 색상 키 또한, 측정 된 강도는 녹색으로 표시됩니다. 실험 산란 곡선 AND SEC-SAXS D) 및 IEC E) 323-785 D5의 데이터 분석에 의해 얻어진 모델 곡선을 계산 하였다. SEC 데이터와 G) IEC 데이터에 기초 D5 323-785의 F) 비드 모델. 증권 거래위원회 (SEC)와 IEC 모델 H) 오버레이. F의 패널) H에)는 분자 시각화 소프트웨어 (24)를 사용하여 만들어졌습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 데이터 수집 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> 악기: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> 파장 (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> Q-범위 (A-1) </td><td> 0.0032-0.49 </td></tr><tr><td> 샘플 대 검출기 거리는 </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> 노출 시간 (초) </td><td> 프레임 당 1 </td></tr><tr><td> 농도 범위 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 온도 (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> 탐지기 </td><td> 필라투스 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> 플럭스 (광자 / s의) </td><td> 1 × 10 (12) </td></tr><tr><td> 빔 크기 (μm의 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, 삼성 전자 구조 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) 기니 어에서] </td><td> 0.0237 </td></tr><tr><td> RG (Å)에서 기니 어] </td><td> (48) </td></tr><tr><td> R의 g 분 Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g </td><td> 0.77-1.24 </td></tr><tr><td> D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] </td><td> (145) </td></tr><tr><td> 페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1)</td><td> 0.02-0.17 </td></tr><tr><td> Porod 볼륨 V p를 (3) 분산에서] </td><td> (570 ± 5) (10) (3) × </td></tr><tr><td> 분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] </td><td> (345) </td></tr><tr><td> 시퀀스에서 단량체 미스터 계산 (kDa의) </td><td> (321) </td></tr><tr><td> D5 323-785, IEC에 대한 구조 매개 변수 </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) 기니 어에서] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> RG (Å)에서 기니 어] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> R의 g 분 Q - 기니 어에 사용되는 Q 최대 R의 g </td><td> 0.44-1.29 </td></tr><tr><td> D 최대 (Å) 페이지에서 (R)] </td><td> (120) </td></tr><tr><td> 페이지에 사용되는 Q-범위 (R) (A-1) </td><td> 0.03-0.18 </td></tr><tr><td> Porod 볼륨 V 피 (&amp; #197; 3) 분산에서] </td><td> (577 ± 5) (10) (3) × </td></tr><tr><td> 분자 질량 M의 R (kDa의) [V 피에서] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> 시퀀스에서 hexameric 미스터 계산 (kDa의) </td><td> (321) </td></tr></tbody></table> 표 1 : SAXS 데이터 파라미터. SAXS 표는 데이터 수집 및 분석의 파라미터를 요약 한 것이다.

소각 X 선 산란 (SAXS)에 의한 단백질의 용액 구조의 결정은 단 분산 샘플을 필요로한다. 여기에서는, 샘플 준비 및 데이터 수집 간의 최소 지연을 보장하기 위해 두 가지 가능성을 제시 : 온라인 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC) 및 온라인 이온 교환 크로마토 그래피 (IEC).

SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

소각 X선 산란 빔 라인에서 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피를 구현하는 전반적인 목표는 시료 준비와 데이터 수집 사이의 지연을 최소화하여 더 나은 품질의 저해상도 모델 데이터를 얻는 것입니다. 이러한 방법은 구조 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 반경 작동, 가장 큰 특정 내 거리, 입자 모양, 접힘 변성 또는 무질서의 정도와 같습니다.SAXS에는 몰 분산 시료가 필요합니다. 이 기법의 주요 장점은 정제와 측정 사이의 시간이 짧아 시료 변성 또는 비축을 방지하는 데 도움이 된다는 것입니다. 빔라인 시설로 이동하기 전에 이전에 발표된 방법을 사용하여 농축 샘플을 준비하고 SEC 테스트 실행을 수행합니다.빔라인 시설에서 1.5ml 반응 튜브에 1ml의 겔 여과 버퍼를 넣습니다. 그런 다음 SAXS 설정의 플로우 스루 캐필러리에 따라 겔 여과 버퍼 병을 HPLC 시스템에 연결합니다. 유속, 최대 컬럼 압력 및 획득 시간을 설정합니다.컬럼이 없는 배압에 유의하십시오. 라인을 퍼지한 다음 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 연결하고 평형을 이룹니다. 1mL 버퍼 샘플을 샘플 교환기에 로드합니다.실험용 허치를 종료하고 고정하거나 내부 잠근 다음 샘플 교환기 모드에서 빔라인 제어 소프트웨어에 로그인합니다. Sample Changer의 버퍼 샘플을 SAXS flow-through capillary를 통해 직접 보냅니다. 짧은 SAXS 테스트를 수행하고 사운드 X선 산란 강도에 방사선 손상의 징후가 없는지 확인합니다.빔라인 제어 시스템을 HPLC 모드로 전환하고 전체 HPLC SAXS 시스템을 통해 버퍼의 SAXS 테스트 실행을 수행합니다. 데이터가 첫 번째 측정과 일치하지 않으면 다시 평형을 이루고 다른 테스트 실행을 수행합니다. 다음으로, 실험실에서, 응집체를 제거하기 위하여 13, 000배 G 10 분에 단백질 견본을 원심 분리하십시오.상층액을 HPLC 호환 유리 바이알로 옮깁니다. 바이알을 자동 샘플러에 넣고 샘플 위치를 확인합니다. 허치를 연동하고 빔라인 제어 시스템에서 실험 데이터를 위한 폴더를 만듭니다.그런 다음 HPLC 소프트웨어에서 빠른 배치를 클릭합니다. 파일 경로를 설정하고 UV Vis 데이터의 자동 ASCII 변환을 활성화합니다. 주입 부피와 시료 위치를 자동 시료 주입기에 입력합니다.시작을 클릭하여 대기열에 실행을 추가합니다. 파일 이름을 입력하되 아직 저장을 클릭하지는 마십시오. 빔라인 제어 소프트웨어에서 SAXS 데이터 수집 시간이 HPLC 수집 시간보다 약간 길어지도록 데이터 프레임 수를 설정합니다.빔라인 셔터를 열고 SAXS 데이터 수집을 시작합니다. HPLC 소프트웨어로 전환하고 save'를 클릭하여 샘플을 주입합니다. UV Vis 데이터 수집 시작 부분의 프레임 번호를 기록하고 시간 경과에 따른 합산 강도를 모니터링합니다.시료 전처리 중에 25밀리몰에서 1몰까지 선형 염화나트륨 구배로 IEC 테스트를 수행합니다. 각 관심 피크에 대해 이동상에서 해당 양의 고염 완충액 B를 측정합니다. IEC SAXS 실험을 시작하려면 버퍼 A 및 B의 샘플 1ml를 따로 보관한 다음 버퍼를 HPLC 시스템에 연결합니다.HPLC 매개변수를 설정한 다음 시스템을 퍼지하고 저염 완충액 A로 라인을 플러시합니다.이온 교환 컬럼을 완충액 A로 연결하고 평형을 이룹니다.완충액 A와 B의 1밀리리터 샘플을 샘플 교환기에 로드합니다. 허치를 연동하고 샘플 교환기 모드에서 각 버퍼 샘플에 대해 짧은 SAXS 테스트 실행을 수행하여 방사선 손상에 대한 버퍼 민감도를 확인합니다. 그런 다음 HPLC 모드로 전환하고 버퍼 A에 대해 다른 SAXS 테스트 실행을 수행합니다. 산란 패턴을 샘플 교환기 테스트 실행에서 얻은 패턴과 비교합니다.다음으로, 실험 데이터에 대한 폴더를 만듭니다. 그런 다음 0% 고염 완충액 B로 시작하여 2개의 컬럼 부피 간격으로 5%를 증가시켜 100% 완충액 B에 도달하는 단계별 HPLC 그래디언트를 설계합니다. 샘플이 주입되지 않는 단일 그래디언트 실행을 설정합니다. 빔라인 셔터를 열고 SAXS 데이터 수집을 시작한 다음 HPLC 실행을 시작합니다.UV Vis 데이터 수집이 시작될 때 경과된 프레임 수를 확인합니다. 자료 수집 후에, 합산한 강렬이 적어도 100개의 구조 동안 일정하게 남아 있었다는 것을 검사하고, 완충기 A와 B.Then.Then, 0 퍼센트 완충기 B.Create에서 출발 또 다른 단계적인 현명한 증언도 HPLC 방법을 만드십시오, 따로 잇기 IEC 증감 시험 실행에서 결정된 각 퍼센트 B 가치를 위한 단계를 만드십시오. 각 값보다 1% 포인트 아래에 그라디언트 단계를 추가하고 각 값보다 1.5포인트 위에 추가합니다.각 단계 간격을 2.5 컬럼 부피로 설정하고 그래디언트의 마지막 단계를 100%로 설정합니다. B. 완충액 A의 조성을 달성하기 위해 필요에 따라 상층액을 희석합니다. HPLC 펌프를 중지하고 검출기에서 컬럼 튜브를 분리한 다음 라인 끝을 용기에 넣어 컬럼 흐름을 수집합니다. 그런 다음 버퍼 A 라인을 희석된 샘플로 옮겨 튜브에 기포가 갇히지 않도록 합니다. 펌프를 시작하여 샘플을 컬럼으로 끌어들입니다.샘플 용기가 거의 비워지면 펌프를 멈추고 버퍼 A 병을 다시 라인에 놓습니다. 펌프를 시작하고 두 개의 컬럼 부피에 대해 컬럼을 통해 버퍼 A를 실행한 다음 펌프를 중지하고 컬럼을 검출기에 다시 연결합니다. 새로운 단계별 분석법을 사용하여 자동 시료 주입 없이 단일 HPLC 실행을 설정할 수 있습니다.빔라인 셔터를 열고 SAXS 및 UV Vis 데이터를 획득합니다. 시간 경과에 따른 합산된 강도를 모니터링합니다. 그런 다음 후처리 소프트웨어를 사용하여 HPLC 데이터를 ASCII 형식으로 변환합니다.온라인 데이터 관리자를 사용하여 시료 용리 피크에 해당하는 SAXS 프레임을 식별합니다. giyration의 반경이 피크 전체에서 안정적인지 확인합니다. 피크 프레임을 SAXS 데이터 처리 프로그램으로 가져와서 보정되지 않은 평균 산란 곡선을 생성합니다.SCC SAXS의 경우, 보정되지 않은 산란 곡선뿐만 아니라 평균 버퍼의 높은 Q 영역이 있는지 확인합니다. 피크에서 자동 감산된 프레임을 로드하고 크기를 조정하며 시스템적 차이가 없는지 확인합니다. 모든 곡선의 평균을 구하여 최종 SAXS 곡선을 구합니다.IEC SAXS의 경우 각 그래디언트 단계에서 평균 50프레임을 사용합니다. 이러한 평균을 보정되지 않은 곡선과 비교하고 Q가 가장 잘 일치하는 그래디언트 단계를 선택합니다. 보정되지 않은 곡선에서 선택한 평균을 빼서 최종 SAXS 곡선을 만듭니다.마지막으로, 쌍 거리 분포를 결정하고 절대 초기 모델링을 수행하여 단백질의 가장 대표적인 모델을 결정합니다. D5 단백질의 SEC 및 IEC SAXS에서 얻은 구조 데이터 매개변수는 매우 유사했습니다. 분자 질량 추정치는 예측된 질량과 일치하는 둘 다 이었습니다.Ab initio 모델링은 부과된 대칭 없이 C6 대칭으로 수행되었습니다. 두 모델 모두 실험 데이터와 호환되며, 이는 단백질 구조가 C6 대칭을 가지고 있음을 나타냅니다. 분자 모델링은 부분적으로 막힌 중앙 채널을 가진 육각형 피라미드와 같은 구조를 생성합니다.평균적인 SEC 및 IEC 모델은 매우 유사했습니다. 개별 모델을 조사한 결과, 수로 장애물은 평균화 과정의 인공물일 가능성이 있는 것으로 밝혀졌습니다. SAXS는 점점 더 표준이 되고 있지만, 많은 정제 및 기타 이온 교환 크로모토그래피 단계에서 응집체 또는 오염 물질을 제거하는 데 필요합니다.이 프로토콜에서는 bio SAXS 빔라인에서 온라인 크기 배제 크로모토그래피와 온라인 이온 교환 크로모토그래피의 두 가지 기술을 제시했습니다. 두 기술 모두의 주의 사항은 정확한 단백질 농도를 알 수 없기 때문에 분자 질량 산란을 결정할 수 없다는 것입니다. 그러나 구형 단백질의 경우 여전히 질량 부피를 추정할 수 있습니다.이온 교환 크로모토그래피에서 사용한 step-wise gradient 대신 선형 gradient가 적용될 수 있지만, 이를 위해서는 피크의 최적 분리를 위해 완충액 조건의 최적화가 필요합니다. 이러한 기술을 통해 복잡한 시스템에서도 우수한 품질의 SAXS 데이터를 수집할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

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