플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

다음 실험의 목표는 투과 전자 현미경에서 시각화를 위해 현탁 세포의 초구조 및 면역 국소화 연구를 위한 도구를 제안하는 것입니다. 이 기술은 사용하기 쉽고 비용이 저렴하며 세포 구조를 탁월하게 보존합니다. 이것은 현탁 세포의 배양입니다.

먼저, 미세 원심분리 튜브에서 펠릿을 얻기 위해 다양한 원심분리로 세포를 수확합니다. 두 번째 단계에서는 세포를 고정시키고 얼음 결정의 형성을 제한하는 플런지 동결에 의해 샘플을 빠르게 동결합니다. 다음으로, 세포 구조를 안정화하기 위해 고정액으로 사산화오스뮴을 함유한 용매로 물을 대체하기 위해 동결 치환을 수행합니다.

결과는 급락, 동결 및 동결 치환이 세포의 인프라를 완벽하게 보존한다는 것을 보여줍니다. 화학적 고정은 투과 전자 현미경을 위해 조직이나 세포를 고정하는 주요 방법이었지만 이 방법을 사용하면 일반적으로 인공물 및 세포 내용물 추출이 관찰됩니다. 화학적 고정의 대안은 냉동 고정입니다.

이 방법은 얇은 수지 섹션에서 최고 품질의 형태를 생성하기 위한 최상의 선택입니다. 플런지 동결은 기존의 화학적 고정으로 인한 손상을 방지하기 위해 세포의 분자를 즉시 고정시키는 동결 고정 기술입니다. 샘플을 급강하 동결하기 전에 Formvar 필름으로 절단된 그리드를 동결 지지대로 사용할 수 있도록 준비해야 합니다.

보푸라기가 없는 천으로 유리를 광택이 날 때까지 닦고 깨끗이 닦습니다. 유리 슬라이드를 Formvar 0.3 % 클로로포름 용액에 몇 초 동안 담그고 비커에서 똑바로 건조시킵니다. 조작은 클로로포름의 존재로 인해 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드 아래에서 실현되어야 합니다.

결정화기에 증류수를 채운 후 유리 막대를 물 표면에 통과시켜 먼지를 제거합니다. 필름이 마르면 날카로운 면도날로 가장자리를 긁어 필름이 벗겨질 수 있도록 합니다. 필름에 수증기 층을 얻기 위해 슬라이드에 숨을 크게 내쉬어 슬라이드를 서리로 만듭니다.

즉시 물 표면에 대해 약 30도 각도로 슬라이드 바닥을 만져 필름을 물 표면에 띄웁니다. 슬라이드를 천천히 욕조로 내리고 필요에 따라 필름을 떼어냅니다. Formvar 필름은 물 표면에 천천히 가라 앉습니다.

핀셋을 사용하여 결정화기 가장자리에 필름을 부착합니다. 400메쉬 구리 그리드를 적절한 두께와 주름이 없는 영역에 필름의 앞면이 아래로 향하게 하여 부드럽게 놓습니다. 격자가 있는 필름은 수면 위에 떠 있는 동안 조셉 종이로 덮어서 픽업합니다.

Joseph 종이의 가장자리를 집어 들면 그리드가 있는 필름이 함께 제공됩니다. 손가락이 수면에 닿지 않도록 하거나 물에 필름이 남을 위험이 있습니다. 사용하기 몇 시간 전에 그리드를 건조시키십시오.

초미세 구조 연구를 위해 사산화오스뮴 앰플을 유리 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 잘 흔들어 앰플을 깨뜨립니다. 적절한 부피의 아세톤을 100% 첨가하여 최종 농도가 4%가 되도록 동결 치환 매체가 들어 있는 플라스크를 저어주고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 1.5밀리리터 분취액을 극저온액으로 분주합니다.

사용하기 전에 모든 뚜껑을 닫고 영하 84도의 냉동실에 보관하십시오. 단백질 면역 표지 연구를 위해 아세톤에 0.1%의 우라닐 아세테이트를 준비합니다. 용액이 투명해지면 0.2마이크로미터 필터를 사용하여 여과하고 1.5ml 분취액을 극저온액으로 분주합니다.

사용하기 전에 영하 84도의 냉동실에 보관하십시오. 상이한 세포 유형으로부터의 펠릿의 적절한 일관성을 갖기 위해, 원료 효모 세포는 완전한 액체 배지의 최소한으로 10 내지 9개의 세포를 얻는다. DTY 배지에서 대장균을 사용하여 5개의 10 내지 10개의 박테리아 세포를 얻을 수 있습니다.

AM 배지의 Leishmania flagellum 및 SDM79 배지의 Trypanosoma brucei는 5개의 10 내지 8개의 기생충 세포를 얻습니다. 현탁 세포를 포함하는 배양 배지를 50ml 프로필렌 튜브에 옮기고 1, 500g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 펠릿을 각 세포 배양 배지 1 밀리리터에 재현탁시킵니다.

마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 3, 900g에서 1분 동안 원심분리기를 제거합니다. 플런지 동결 방법의 경우 프로판 실린더에 연결된 튜브가 있는 프로판 병을 사용해야 합니다.

프로판은 잠재적으로 폭발성 이므로 환기가 잘되는 방이나 흄 후드에서 액화를 실현합니다. 화염은 허용되지 않습니다. 액체 질소를 사용할 때는 크라이오글러브를 포함한 개인 보호 장비를 항상 착용해야 합니다.

폴리스티렌 트레이에 소량의 액체 질소를 넣으십시오. 황동 컵을 액체 질소에 넣습니다. 거품이 나타납니다.

거품이 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음 놋쇠 컵을 얼립니다. 프로판 실린더에 연결된 튜브를 황동 캡 벽과 접촉시킵니다.

프로판 실린더 밸브를 부드럽게 엽니다. 프로판이 액화되기 시작하지 않기 때문에 많은 연기가 형성됩니다. 프로판이 액화되기 시작하면 연기가 사라집니다.

프로판 실린더 밸브를 닫고 프로판 실린더에 연결된 튜브를 빠르게 제거하여 액화를 중지하십시오. 폴리스티렌 트레이에 황동 컵 상단에서 최대 5mm까지 액체 질소를 채웁니다. 작은 황동 컵을 얼린 후 액체 질소에 넣어 샘플을 교체 할 곳입니다.

샘플 1개에 1컵을 넣는다. 샘플을 혼합하지 않도록 주의하십시오. 펠릿의 적절한 일관성을 얻으려면 이전에 표시된 배양 조건과 원심분리 파라미터를 준수하기만 하면 됩니다.

핀셋을 사용하기 전에 얼리십시오. Formvar로 절단된 400메쉬 구리 현미경 그리드를 예로 들어 보겠습니다. 펠릿에 양날 해부 바늘을 넣으십시오.

도구를 사용하여 그리드에 펠릿 한 방울을 떨어뜨립니다. 그리드를 액체 프로판에 매우 빠르게 넣고 몇 초 동안 저어줍니다. 작은 황동 컵에 얼어붙은 그리드를 빠르게 옮깁니다.

각 샘플에 대해 최소 3개의 그리드를 만듭니다. 그리드를 사용하기 전에 핀셋을 얼리는 것을 잊지 마십시오. 핀셋을 사용하기 전에 얼리십시오.

컵을 신속하게 제거하고 핀셋을 사용하여 얼어붙은 그리드를 극저온으로 옮깁니다. 극저온에 캡을 다시 씌웁니다. 각 샘플의 각 그리드에 대해 작업을 반복합니다.

캡을 닫고 cryovial을 저어 샘플이 동결 치환 매체에 있는지 확인합니다. 영하 84도의 냉동고에서 3일 동안 냉동 보관합니다. 냉동 식품을 폴리스티렌 트레이에 넣어 냉동고의 온도가 영하 30도까지 급격히 상승하는 것을 방지하십시오.

영하 30도에서 1시간 동안 두십시오. 영하 15도에서 2시간 동안 극저온을 운반한 다음 샘플을 4도에서 2시간 동안 보관하고 실온에서 30분 동안 보관합니다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 동결 대체 매체를 제거하고 명확하게 식별된 적절한 폐기물 병에 넣습니다.

약 500 마이크로 리터의 100 % 아세톤을 넣으십시오. 유리 바이알을 열고 cryovial을 저어주고 유리 바이알에 동결 치환 매체를 빠르게 넣습니다. 100% 아세톤으로 하나의 cryovial을 헹굽니다.

100% 아세톤으로 10분 동안 세 번 헹굽니다. 냉동 식품을 폴리스티렌 트레이에 넣어 냉동고의 온도가 영하 30도까지 급격히 상승하는 것을 방지하십시오. 영하 30도에서 2시간 동안 두십시오.

샘플을 폴리프로필렌 바이알에 넣은 후 동결 치환 매체를 새 동결 치환 매체로 교체하고 영하 30도에서 2시간 동안 방치합니다. 100% 아세톤으로 1시간, 100% 에탄올로 1시간 동안 세 번 헹굽니다. 플런지 동결/동결 치환 방법은 현탁 세포의 세포 내 구조를 탁월하게 보존하는 결과를 가져왔습니다.

Saccharomyces cerevisiae에서는 구조가 수축되지 않고 세포질이 조밀하게 나타납니다. 또한 멤브레인이 매끄럽기 때문에 보존이 잘되었다는 증거입니다. 핵, 미토콘드리아, 액포와 같은 모든 소기관을 완벽하게 식별할 수 있습니다.

Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei 및 Escherichia coli에서도 우수한 보존이 관찰됩니다. 핵에서는 핵막을 형성하는 이중막, 핵공, 방추극체, 핵막의 외막에 부착된 리보솜이 뚜렷하게 보입니다. 미토콘드리아에서는 크리스타(cristae)라고 하는 내막 침습(internal membrane invaginations)이 명확하게 보입니다.

중요한 세포 기관은 액포인데, 큰 얼음 결정이 쉽게 발달할 수 있기 때문입니다. 이미지에서 액포는 얼음 결정 손상 없이 완벽하게 보존되어 있습니다. 플런지 동결/동결 치환 방법도 단백질 면역국소화를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차는 단백질 항원성을 완벽하게 보존하며, 앞서 언급했듯이 세포 기관이 명확하게 식별됩니다. 항-ATP 합성효소(anti-ATP synthase) 및 항-포린(anti-porine)과 같은 효모의 다른 단백질을 표적으로 하는 다양한 항체가 이미 테스트되었습니다. 이러한 실험은 플라바린 단백질이 국소화된 리슈마니아(Leishmania)에서와 같이 다양한 실험 시스템에서도 가능합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 투과 전자 현미경에서 샘플을 시각화하기 위해 플런지 동결/동결 대체 방법으로 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 빠르고, 사용하기 쉽고, 비용이 저렴하고, 세포 인프라를 탁월하게 보존합니다. 액체 질소, 특히 사산화오스뮴과 아세트산 우라닐에 주의하십시오.

그들은 실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 흄 후드에서 다루어야 합니다.