Name: 플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 라이 제이션 연구를위한 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: 학습하세요 플런지 프리즈와 프리즈 서브스티튜션을 이용한 서스펜션 세포의 초미세구조 및 면역로컬라이제이션 연구 방법입니다. 이 저비용 기술은 투과전자현미경에서 세포 구조를 완벽하게 보존하여 다양한 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 원고에 대한 그들의 도움과 의견을 M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, 그리고 A. 데빈에 대한 우리의 감사를 표현한다. 우리는 이미지가 촬영 한 보르도 이미징 센터의 전자 영상 극에 감사하고 있습니다. 이 작품은 센터 국립 드 라 공들인 과학원에 의해 지원되었다.

Formvar 그리드 필름 1. 준비 참고 : 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 코트, 안경)를 사용하여 흄 후드 클로로포름 조작을 수행합니다. 400 메쉬 전자 현미경 구리 그리드를 사용합니다. 다른 그리드 유형 (다른 메쉬 크기, 금과 니켈 그리드)으로 동결의 품질이 나쁘다. <ol><li> 클로로포름 0.3 % formvar의 100 mL의 용액을 제조 하였다. 이 동요없이 하룻밤을 용해 할 수 있습니다. </li><li> 400 메쉬 전자 microscopycopper 그리드 (직경 3.05 mm) 유리 바이알 (높이 3cm 직경 2cm)을 함유하는 아세톤 (제곱 인치당 구멍 수)을 넣어. 손의 순환 이동에 유리 바이알을 교반한다. 플라스틱 전송 피펫으로 아세톤을 제거합니다. 용매를 5 분 동안 증발하도록 허용. 여과지 상에이를 부어 그리드 전송하고 5 분 동안 건조 할 수있다. </li><li> 미끄러운 / 반짝이까지 보풀이없는 천으로 닦아 76 X 26mm 2 유리 슬라이드 폴란드어.</li><li> 결정 화기 (직경 15cm, 높이 7cm 용량 1,200 ㎖)에 취하여 증류수 가장자리에 채운다. 먼지를 제거하기 위해 두 표면 위에 유리 막대를 통과시킴으로써 물 표면을 청소한다. </li><li> 두 손가락 사이의 유리 슬라이드를 잡고 몇 초 동안 formvar 솔루션에 담근다. 이 똑바로 5 분 동안 거꾸로 비커에서 건조 잡습니다. </li><li> 필름이 건조하면, 필름의 한계 슬라이드에서 탈락 할 정의 날카로운 면도날 유리 슬라이드의 가장자리 점수. </li><li> 심호흡을 가지고에 약간 불투명 필름을 렌더링하고 가시성을 향상시키기 위해 필름에서 수증기 층을 얻을 수있는 슬라이드에 크게 내쉬고. <ol><li> 즉시 약 30 °의 각도로 슬라이드의 바닥을 터치하여 정석 물 표면에 막을 로트. 슬라이드에서 개봉을하자 정석 물 표면에 그것을 벗겨. 부드럽게와 필름을 떼어핀셋, 필요한 경우. </li></ol></li><li> 부드럽게 그리드는 적절한 두께 (약 10 ㎚)의 주름이없는 영역에있는 수면에 부유 막 위에 뒤집어서 누워. </li><li> 그들은 정석 물 표면에 부유 조셉 종이 그리드 감싸는 필름 픽업. <ol><li> 한 손으로 요셉 용지를 잡고 필름의 한쪽 끝을 요셉 종이의 한쪽 끝을 누릅니다. 조셉 용지가 완전히 젖었을 때까지 기다립니다. 에 붙어 그리드와 요셉의 용지를 제거합니다. </li></ol></li><li> 최종 건조하고, 실온에서 사용하기 전에 저장하는 덮여 페트리 접시에서 24 시간 동안 그리드를 놓는다. </li></ol> 동결 교체 매체의 제조 2 참고 : 오스뮴 테트 록 사이드 (OSO 4)와 우라 닐 아세테이트는 유해 화학 물질이다. 실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 흄 후드를 처리합니다. FOLL취급의 안전 경고 (OSO 4) 우라 닐 아세테이트 오우. OSO 4의 누설을 방지하기 위해 O 링 크리오 바이알 (cryovial)를 사용합니다. <ol><li> 미세 구조 연구 <ol><li> 유리 플라스크에 유리 OSO 4 앰플을 넣어. </li><li> 플라스크를 흔들어 앰플 휴식. </li><li> 4 %의 최종 농도를 얻기 위해 아세톤의 적합한 양을 100 % 추가. </li><li> 저어 1.8 ML의 크리오 바이알 (cryovial)에 1.5 mL의 씩 분배. </li></ol></li><li> 단백질 immunolabeling <ol><li> 유리 플라스크 우라 닐 아세테이트 0.05 g을 놓는다. </li><li> 100 % 아세톤 50 mL를 추가. </li><li> 자기 교반기로 교반 용액. 용액 분명 해지면, 0.2 ㎛의 필터를 사용하여 필터링. </li><li> 1.8 ML의 크리오 바이알 (cryovial)에 1.5 mL의 분취 량을 분배. 참고 : 플 런지 냉동 처리하기 위하여 동결 대체 매체를 포함하는 크리오 바이알 (cryovial)를 준비하고 -84 ° C 형 냉장고에 보관하십시오. 멀리 던져 유리 플라스크를 반전하려면유해 폐기물의 OSO 4 앰플. </li></ol></li></ol> 3. 셀의 제조 참고 :이 단계는 방법의 성공을 위해 중요하다. 모든 세포 유형, 세포의 표시 번호를 얻기 위해 세포를 성장. 지정된 시간과 속도로 표시된 튜브에 원심 분리기. <ol><li> 다음과 같이 서로 다른 세포 유형에서 펠렛의 적절한 일관성을 얻기 위해, 세포 성장 : <ol><li> 사카 cerevisiae를하고, 분열을 pombe 들어 최소 또는 완전 액체 배지 5ml에 효모 접종. 28 ° C, 회전 (180 RPM)에서 밤새 인큐베이션. 밤새 배양 600nm의 (OD 600)에서의 광학 밀도를 측정한다. 0.2 ml의 50에 신선한 선택 배지의 OD 600 효모 세포를 희석. 1 × 109 효모 7을 얻었다 회전, 28 ° C에서 세포를 배양하는 것을 계속한다. </li><li> 슈만 편모충의 편모를 들어, 가지마7.5 % FCS (소 태아 혈청)을 5 ㎖의 AM 매체 culate 기생충. 24 ° C, 회전 (180 RPM)에서 밤새 인큐베이션. 밤새 배양 OD (600)를 측정한다. 0.2 ml의 50에 신선한 선택 배지의 OD 600 기생충 세포를 희석. 5 × 108 기생충 셀 (12)을 얻기 위해, 회전, 24 ℃에서 세포를 배양하는 것을 계속한다. </li><li> 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei 들면, 10 % FCS 및 30 ㎍ / mL의 하이 그로 마이신을 가진 SDM-79 배지 5ml에 접종 기생충. 27 ° C, 회전 (180 RPM)에서 밤새 인큐베이션. 밤새 배양 OD (600)를 측정한다. 50 mL의 신선한 선택 배지에 0.2의 OD 600 기생충 세포를 희석. 5 × 108 세포 기생충 13을 수득 회전, 27 ℃에서 세포를 배양하는 것을 계속한다. </li><li> 대장균, 100 ㎍ / ㎖의 암피실린으로 DYT 배지 5ml에 접종 박테리아. (회전, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 180RPM). 밤새 배양 OD (600)를 측정한다. 0.2 ml의 50에 신선한 선택 배지의 OD 600 박테리아 세포를 희석. 5 × 10 14 박테리아 세포를 얻기 위해, 회전, 37 ℃에서 세포를 배양하는 것을 계속한다. 참고 밤새 항온 배양은 배양 세포 중 또는 정지 대수 성장기 일 수있다. 경험적으로 결정되는 매우 느리게 성장하는 세포 균주는, 어느 날 밤, 또는 세포의 더 많은 수의 접종에 비해 배양 시간이 더 필요할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 모든 세포 유형의 경우, 1,500 × g으로 3 분 동안 50 ㎖ 폴리 프로필렌 원심 분리 튜브에 세포를 포함하는 배양 배지를 옮긴다. </li><li> 상등액을 제거하고 적절한 세포 배양 배지 1 ml의 모든 종류의 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 원심 3,900 × g으로 1 분 동안 미세 원심 분리 튜브 내의 모든 세포 유형. 완전히 뜨는을 제거합니다. </li><li> 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol> 참고 :주의 액체 질소를 처리합니다. cryogloves와 구글을 포함한 개인 보호 장비를 사용합니다. 프로판은 잠재적으로 폭발성이므로, 통풍이 잘 나 흄 후드 액화를 수행한다. 아니 불꽃이 허용되지 않습니다. <ol><li> 폴리스티렌 트레이에서 액체 질소의 약 150 ㎖을 넣어. 이를 동결 액체 질소에 황동 컵 (높이 3.6 cm, 직경 2cm, 두께 1.5 mm)를 놓는다. 액체 질소는 황동 컵에 침투하지 마십시오. </li><li> 거품이 황동 컵이 고정되어 있는지 확인하기 위해 가라 앉을 때까지 기다리십시오. </li><li> 황동 컵 벽과 접촉 프로판 실린더에 연결된 호스를 넣습니다. </li><li> 부드럽게 프로판 실린더 밸브를 연다. 참고 :이 단계에서, 프로판은 황동 컵에 액화. </li><li> 프로판 실린더 밸브를 폐쇄하고 신속하게 가스 호스를 분리하여 액화를 중지. </li><li> 액체 NI와 폴리스티렌 트레이 채우기황동 컵의 상단에서 5mm까지 트로겐. 액체 질소는 황동 컵에 침투하지 마십시오. </li></ol> 시료 5. 런지 동결 <ol><li> 폴리스티렌 트레이에서 액체 질소의 약 200 ㎖을 넣어. 액체 질소에 이르렀 조금씩 황동 컵 (높이 1.5 cm 직경 2.5 cm, 두께 1mm)를 고정. 하나 개의 서스펜션 세포 샘플에 대해 하나의 컵을 넣습니다. 샘플을 혼합하지 않도록주의하십시오. 이를 위해, 등 컵 2에, 컵 1 샘플 2 샘플 1을 넣어. </li><li> 액체 질소 중에서 그들의 팁 급락하여 핀셋 동결. </li><li> 3.5에서 수득 된 펠릿에 더블 에지 해부 바늘 런지. </li><li> 핀셋을 사용하여, 제 1 단계에서 제조 된 formvar로 코팅 된 400 메쉬 구리 현미경을 그리드. </li><li> 해부 바늘을 사용하여, 그리드에 3.5에서 얻어진 펠렛 방울을 놓는다. 다른 드롭 크기 (예 : 2, 5, 10 μL)를보십시오. </li><li> 매우 빠르게 액체 프로판 유전자에 의해 유지 핀셋 그리드 급락제 4 항에 보통 수 초 동안 원 운동으로 그리드 교반한다. </li><li> 신속하게 5.1 절에 동결 작은 황동 컵에 핀셋으로 고정 된 격자를 전송합니다. 참고 : 각 샘플의 경우, 최소 3 그리드를합니다. 항상 구리 그리드를 촬영하기 전에 핀셋을 동결. </li></ol> 6. 동결 교체 참고 : 오스뮴 테트 록 사이드 잠재적으로 휘발성이기 때문에, 증기 카트리지와 공기 정화 호흡기를 사용합니다. 플 런지 동결 전에 액화 질소에서 냉동 정착액 또한 용액이다. <ol><li> 미세 구조 연구를 들어, 섹션 2.1에서 제조 한 동결 대체 배지를 함유하는 1.8 mL의 cryovial 튜브를 연다. 의 면역 시험은 섹션 2.2에서 제조 한 동결 대체 배지를 함유하는 1.8 mL의 cryovial 튜브를 연다. 크리오 바이알 (cryovial)에 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 액체 질소 중에서 그들의 팁 급락하여 핀셋 동결. </li><li> 빠르게 캡을 제거하고 냉동 그리드에게 내가 전송핀셋을 사용하여 크리오 바이알 (cryovial)를 NTO. </li><li> 다시 크리오 바이알 (cryovial)에 뚜껑을 넣습니다. </li><li> 각 샘플의 각 격자에 대한 작업을 반복합니다. </li><li> 샘플을 동결 교체 매체에 있도록 손의 원 운동으로 크리오 바이알 (cryovial)을 모두 캡을 닫고 교반 하였다. </li><li> 동결 교체 과정에서 -84 ° C에 냉동 3 일 동안 밀폐 된 상자에 크리오 바이알 (cryovial)를 놓는다. </li></ol> 7. 샘플 온난화 <ol><li> 미세 구조 연구 <ol><li> 폴리스티렌 트레이에 크리오 바이알 (cryovial)를 나른다 -30 ° C에 냉동 (급격한 온도 상승을 방지하기 위해). 1 시간 동안 -30 ° C 냉장고에 넣습니다. </li><li> 2 시간 동안 -15 ° C에 냉동의 크리오 바이알 (cryovial)를 놓는다. 실온에서 30 분 후, 2 시간 동안 4 ℃에서의 샘플을 놓고. </li><li> 플라스틱 전송 피펫으로 동결 대체 매체를 제거합니다. 100 % 아세톤 약 500 μL를 추가합니다. </li><li> 1.8 ml의 cryovial 볶음신속 원형 손의 움직임과 함께 유리 바이알에 그리드 (높이 3cm 직경 2cm)을 함유하는 아세톤 (1.5 ml)에 붓는다. </li><li> 모든 그리드를 전송 한 반드시 100 % 아세톤 1 ㎖와 동일한 cryovial 린스. 손의 원형 움직임으로 cryovial 교반하고 유리 바이알에 cryovial의 내용을 붓는다. </li><li> 10 분 동안 100 % 아세톤으로 3 회 3 mL로 각 유리 바이알을 헹군다. </li><li> 기준 (15)에 기술 된 바와 같이 매립 및 포함 절차를 수행. 아세톤 (25 %, 50 %, 75 %), 에폭시 수지의 농도가 증가함에 따라, 샘플을 함침하고 젤라틴 캡슐에서 100 %의 에폭시 수지 시료를 포함. </li></ol></li><li> 연구를 Immunolabeling <ol><li> 폴리스티렌 트레이의 1.8 mL의 크리오 바이알 (cryovial)의 캐리 -30 ° C에 냉동 장치 (급격한 온도 상승을 방지하기 위해). </li><li> -30 ° C의 냉동고에 2 시간에 대한 크리오 바이알 (cryovial)를 놓는다. </li><li> -30 °에서<html> C 냉동기는 손의 원 운동으로 cryovial 교반 빠르게 폴리 프로필렌 바이알 (높이 5cm 지름 1.5 cm)에 동결 교체 매체를 붓는다. </li><li> 신선 동결 대체 매체의 2 ml로 동결 대체 매체를 교체합니다. </li><li> -30 ° C의 냉동고에 2 시간 동안 폴리 프로필렌 바이알을 놓는다. </li><li> 100 %의 아세톤 용액 (2) 100 % 에탄올 2 mL를 1 시간 동안 3 회 1 시간 프로필렌 바이알을 헹군다. </li><li> 기준 (15)에 기술 된 바와 같이 매립 및 포함 절차를 수행. 아크릴계 수지의 농도를 증가 (25 %, 50 %, 75 % 아세톤)로 샘플을 함침하고 젤라틴 캡슐에 100 % 아크릴 수지 시료를 포함. </li></ol></li></ol> 시료 8. 시각화 <ol><li> 삽입 후, 샘플을 Ultramicrotome으로 80 nm의 매우 얇은 부분을 만든다. 1 분 동안 실온에서 2 % 납 시트르산 섹션 대조엉덩이 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 15. </li><li> 섹션 (15)을 관찰하기 위해 80 kV의 120 kV의 전자 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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<li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+%28BY-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li>
<li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li>
</ol>

저자는 관심의 충돌이 없음을 선언합니다.

TEM은 소기관, 세포 및 조직의 미세 구조의 관찰을위한 강력한 방법이다. Cryofixation / 동결 대체는 현재 모두 미세 구조 및 단백질 항원의 보존을위한 최선의 방법입니다. 화학 고정 제를 침투 및 미세 구조 (2)의 전체 구조 안정화되기 전에 재 배열을 가능하게함으로써 매우 천천히 작동한다. 반대로, cryofixation / 동결 대체 즉시 세포 구조 (4)를 안정화시킨다. 그러나 cryofixation / 동결 대체 기술함으로써 응용 프로그램의 자신의 범위를 제한하는 제약과 어려움의 수를 포함한다. 이 샘플 동결 유물, 기술, 비용, 장비의 실현에 관한 것이다. 고압 동결 / 동결 대체 기술은 셀룰러 상세 (6)의 보존, (7)의 높은 수준을 가능하게했다. 대조적으로, PF 이미 OBS에 사용얼음 <sup class="xr...

샘플 준비는 전자 현미경 연구의 성공을 위해 중요하다. 종래 EM 고정은 투과형 전자 현미경 (TEM) 1 조직 또는 세포를 고정하기위한 주요 방법이다. 먼저, 알데히드 및 ​​산화 오스뮴 화학적 실온에서 재료를 고정하기 위해 사용된다. 그 후, 재료는 유기 용매 탈수 함침 한 에폭시 수지에 포함된다. 이 방법은 셀에 고정 제의 침투 속도에 의존한다. 따라서, 세포 내용물의 생성물 추출은 일반적으로 2가 관찰된다. Cryofixation 명확 세포 구조 3의 보존을위한 더 나은 대안 그대로를 유지하고있다. 얇은 수지 부분의 TEM 이미지 (4)의 높은 품질은 cryofixation / 동결 대체 방법을 사용하여 얻을 수있다. 이 기술의 목적은 유리화 BI를 얻는 것입니다얼음 결정 형성 또는 세포의 미세 구조가 손상되지 않도록 충분히 작은 포함 된 얼음 결정이없는 론적 샘플. 고압 동결 (HPF) 또한 (PF)을 동결 런지라고 매우 빠른 cryofixation는 샘플 cryofix 두 가지 방법이다. HPF 순간적 셀 분자를 고정화 종래 EM 고정에 의한 피해를 방지한다. 냉동 기계 및 자동 대체 장치의 몇 가지 유형의 5 개발되었다. 냉동 시스템 및 소모품 (액체 질소, 등 캐리어 표본) 비싸지 만 고품질의 전자 현미경 (6, 7)를 제조 할 수 있습니다. PF는 1950 년대에 사용되었으며 간단하고 PF 절차 .During 8 싸고 준비된 샘플을 얼음 결정 미만 3 내지 5 nm의 크기를 획득하기 위해 빠른 속도로 동결 같은 문헌에 기재되어있는 기술이다. 이를 위해, 샘플입니다에탄, 프로판, 에탄 또는 프로판 혼합물과 같은 액체 냉각제로 하락. 1950 년대 이후, PF의 개선은 더 많은 수의 사용자에이 기술을 사용할 수 있도록하기 위해 수행되었다. PF 넓게 (화상 작은 물체에 사용되는 반면, 고압 동결 현재 두꺼운 50㎛보다 5 (디스크 형 샘플은 200 ㎛의 두께까지) 샘플들의 큰 다양성을 고정 할 수있는 유일한 실용적인 방법이다 &lt;100 nm의 ), 비결정질 얼음 9의 박막에 현탁 고분자 복합체 등. 큰 샘플은 진핵 세포, 예를 들면, PF로 cryofixed하지만 모세관 구리 관 또는 샌드위치 시스템 8, 10, 11 등의 시험편 홀더를 필요로 할 수있다. 여기에, 빠른, 사용하기 쉬운 다양한 서스펜션 세포 배양에 사용 가능한 저가의 급락 동결 / 동결 대체 기술이 제공됩니다.

<table><tbody><tr><td>그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>프로판 N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>양날 해부 바늘</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>전자 현미경 과학</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알 8.5mL</td><td>전자 현미경 과학</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 100%</td><td>시그마</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아크릴 수지</td><td>전자 현미경 과학</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지 M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지 M 경화제</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>디부틸 프탈레이트&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지 M 가속 장치</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>결정화기</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph paper</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>황동 컵</td><td></td><td></td>은 <td>직접 쇼핑하거나 직접 만듭니다</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>밀폐 상자</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>공기 정화 호흡기</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>호흡기</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>미립자 필터</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11용 카트리지;</td><td></td></tr></tbody></table>

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

투과 전자 현미경 (TEM)은 단백질을 지역화하고 매우 높은 해상도에서 거대 분자 복합체를 시각화하기 위해 세포 미세 구조 연구를위한 특별한 도구입니다. 그러나, 기본 상태로 최대한 가까이 얻을, 완벽한 샘플 보존이 필요합니다. 알데히드와 기존의 전자 현미경 (EM) 고정은, 예를 들어, 좋은 미세 보존을 제공하지 않습니다. 고정 제의 느린 침투 세포 조직 개편 및 다양한 세포 구성 요소의 손실을 유도한다. 따라서, 종래의 고정은 EM 구조 및 항원의 순간 안정성 및 보존을 허용하지 않는다. 세포 내 이벤트를 검사하기위한 최선의 선택은 그 나라의 상태로 세포를 유지 동결 대체 고정 방법 다음 cryofixation을 사용하는 것입니다. 고압 냉동 세포 미세 구조의 무결성을 보존 / 동결 대체, 가장 일반적으로 사용되는 방법이지만 expensi이 필요장비를했습니다. 여기서, 현탁 세포 배양을위한 동결 교체 다음에 사용하기 쉽고 저렴한 동결 고정 방법이 제공된다.

이 문서에서, 미세 구조 (도 1 및도 2)와 immunolabeling (도 3)에 대한 연구에 사용하기 쉽고 저렴한 런지 냉동 방법은 제시된다. 우리는 동결 대체 절차와 온난화 절차 대신 전용 시스템을 사용하여 24 시간 미만 6 시간 걸리는 특수 장비이 필요하지 않다는 점을 보여줍니다. PF / 동결 교체 방법 사카 cerevisiae를 (도 1a 및도 1d-H), 분열 pombe의 (도 1b와의 세포 구조의 개선...

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

다음 실험의 목표는 투과 전자 현미경에서 시각화를 위해 현탁 세포의 초구조 및 면역 국소화 연구를 위한 도구를 제안하는 것입니다. 이 기술은 사용하기 쉽고 비용이 저렴하며 세포 구조를 탁월하게 보존합니다. 이것은 현탁 세포의 배양입니다.먼저, 미세 원심분리 튜브에서 펠릿을 얻기 위해 다양한 원심분리로 세포를 수확합니다. 두 번째 단계에서는 세포를 고정시키고 얼음 결정의 형성을 제한하는 플런지 동결에 의해 샘플을 빠르게 동결합니다. 다음으로, 세포 구조를 안정화하기 위해 고정액으로 사산화오스뮴을 함유한 용매로 물을 대체하기 위해 동결 치환을 수행합니다.결과는 급락, 동결 및 동결 치환이 세포의 인프라를 완벽하게 보존한다는 것을 보여줍니다. 화학적 고정은 투과 전자 현미경을 위해 조직이나 세포를 고정하는 주요 방법이었지만 이 방법을 사용하면 일반적으로 인공물 및 세포 내용물 추출이 관찰됩니다. 화학적 고정의 대안은 냉동 고정입니다.이 방법은 얇은 수지 섹션에서 최고 품질의 형태를 생성하기 위한 최상의 선택입니다. 플런지 동결은 기존의 화학적 고정으로 인한 손상을 방지하기 위해 세포의 분자를 즉시 고정시키는 동결 고정 기술입니다. 샘플을 급강하 동결하기 전에 Formvar 필름으로 절단된 그리드를 동결 지지대로 사용할 수 있도록 준비해야 합니다.보푸라기가 없는 천으로 유리를 광택이 날 때까지 닦고 깨끗이 닦습니다. 유리 슬라이드를 Formvar 0.3 % 클로로포름 용액에 몇 초 동안 담그고 비커에서 똑바로 건조시킵니다. 조작은 클로로포름의 존재로 인해 개인 보호 장비를 사용하여 흄 후드 아래에서 실현되어야 합니다.결정화기에 증류수를 채운 후 유리 막대를 물 표면에 통과시켜 먼지를 제거합니다. 필름이 마르면 날카로운 면도날로 가장자리를 긁어 필름이 벗겨질 수 있도록 합니다. 필름에 수증기 층을 얻기 위해 슬라이드에 숨을 크게 내쉬어 슬라이드를 서리로 만듭니다.즉시 물 표면에 대해 약 30도 각도로 슬라이드 바닥을 만져 필름을 물 표면에 띄웁니다. 슬라이드를 천천히 욕조로 내리고 필요에 따라 필름을 떼어냅니다. Formvar 필름은 물 표면에 천천히 가라 앉습니다.핀셋을 사용하여 결정화기 가장자리에 필름을 부착합니다. 400메쉬 구리 그리드를 적절한 두께와 주름이 없는 영역에 필름의 앞면이 아래로 향하게 하여 부드럽게 놓습니다. 격자가 있는 필름은 수면 위에 떠 있는 동안 조셉 종이로 덮어서 픽업합니다.Joseph 종이의 가장자리를 집어 들면 그리드가 있는 필름이 함께 제공됩니다. 손가락이 수면에 닿지 않도록 하거나 물에 필름이 남을 위험이 있습니다. 사용하기 몇 시간 전에 그리드를 건조시키십시오.초미세 구조 연구를 위해 사산화오스뮴 앰플을 유리 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 잘 흔들어 앰플을 깨뜨립니다. 적절한 부피의 아세톤을 100% 첨가하여 최종 농도가 4%가 되도록 동결 치환 매체가 들어 있는 플라스크를 저어주고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 1.5밀리리터 분취액을 극저온액으로 분주합니다.사용하기 전에 모든 뚜껑을 닫고 영하 84도의 냉동실에 보관하십시오. 단백질 면역 표지 연구를 위해 아세톤에 0.1%의 우라닐 아세테이트를 준비합니다. 용액이 투명해지면 0.2마이크로미터 필터를 사용하여 여과하고 1.5ml 분취액을 극저온액으로 분주합니다.사용하기 전에 영하 84도의 냉동실에 보관하십시오. 상이한 세포 유형으로부터의 펠릿의 적절한 일관성을 갖기 위해, 원료 효모 세포는 완전한 액체 배지의 최소한으로 10 내지 9개의 세포를 얻는다. DTY 배지에서 대장균을 사용하여 5개의 10 내지 10개의 박테리아 세포를 얻을 수 있습니다.AM 배지의 Leishmania flagellum 및 SDM79 배지의 Trypanosoma brucei는 5개의 10 내지 8개의 기생충 세포를 얻습니다. 현탁 세포를 포함하는 배양 배지를 50ml 프로필렌 튜브에 옮기고 1, 500g에서 3분 동안 원심분리합니다. 상등액을 제거하고 펠릿을 각 세포 배양 배지 1 밀리리터에 재현탁시킵니다.마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 3, 900g에서 1분 동안 원심분리기를 제거합니다. 플런지 동결 방법의 경우 프로판 실린더에 연결된 튜브가 있는 프로판 병을 사용해야 합니다.프로판은 잠재적으로 폭발성 이므로 환기가 잘되는 방이나 흄 후드에서 액화를 실현합니다. 화염은 허용되지 않습니다. 액체 질소를 사용할 때는 크라이오글러브를 포함한 개인 보호 장비를 항상 착용해야 합니다.폴리스티렌 트레이에 소량의 액체 질소를 넣으십시오. 황동 컵을 액체 질소에 넣습니다. 거품이 나타납니다.거품이 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음 놋쇠 컵을 얼립니다. 프로판 실린더에 연결된 튜브를 황동 캡 벽과 접촉시킵니다.프로판 실린더 밸브를 부드럽게 엽니다. 프로판이 액화되기 시작하지 않기 때문에 많은 연기가 형성됩니다. 프로판이 액화되기 시작하면 연기가 사라집니다.프로판 실린더 밸브를 닫고 프로판 실린더에 연결된 튜브를 빠르게 제거하여 액화를 중지하십시오. 폴리스티렌 트레이에 황동 컵 상단에서 최대 5mm까지 액체 질소를 채웁니다. 작은 황동 컵을 얼린 후 액체 질소에 넣어 샘플을 교체 할 곳입니다.샘플 1개에 1컵을 넣는다. 샘플을 혼합하지 않도록 주의하십시오. 펠릿의 적절한 일관성을 얻으려면 이전에 표시된 배양 조건과 원심분리 파라미터를 준수하기만 하면 됩니다.핀셋을 사용하기 전에 얼리십시오. Formvar로 절단된 400메쉬 구리 현미경 그리드를 예로 들어 보겠습니다. 펠릿에 양날 해부 바늘을 넣으십시오.도구를 사용하여 그리드에 펠릿 한 방울을 떨어뜨립니다. 그리드를 액체 프로판에 매우 빠르게 넣고 몇 초 동안 저어줍니다. 작은 황동 컵에 얼어붙은 그리드를 빠르게 옮깁니다.각 샘플에 대해 최소 3개의 그리드를 만듭니다. 그리드를 사용하기 전에 핀셋을 얼리는 것을 잊지 마십시오. 핀셋을 사용하기 전에 얼리십시오.컵을 신속하게 제거하고 핀셋을 사용하여 얼어붙은 그리드를 극저온으로 옮깁니다. 극저온에 캡을 다시 씌웁니다. 각 샘플의 각 그리드에 대해 작업을 반복합니다.캡을 닫고 cryovial을 저어 샘플이 동결 치환 매체에 있는지 확인합니다. 영하 84도의 냉동고에서 3일 동안 냉동 보관합니다. 냉동 식품을 폴리스티렌 트레이에 넣어 냉동고의 온도가 영하 30도까지 급격히 상승하는 것을 방지하십시오.영하 30도에서 1시간 동안 두십시오. 영하 15도에서 2시간 동안 극저온을 운반한 다음 샘플을 4도에서 2시간 동안 보관하고 실온에서 30분 동안 보관합니다. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 동결 대체 매체를 제거하고 명확하게 식별된 적절한 폐기물 병에 넣습니다.약 500 마이크로 리터의 100 % 아세톤을 넣으십시오. 유리 바이알을 열고 cryovial을 저어주고 유리 바이알에 동결 치환 매체를 빠르게 넣습니다. 100% 아세톤으로 하나의 cryovial을 헹굽니다.100% 아세톤으로 10분 동안 세 번 헹굽니다. 냉동 식품을 폴리스티렌 트레이에 넣어 냉동고의 온도가 영하 30도까지 급격히 상승하는 것을 방지하십시오. 영하 30도에서 2시간 동안 두십시오.샘플을 폴리프로필렌 바이알에 넣은 후 동결 치환 매체를 새 동결 치환 매체로 교체하고 영하 30도에서 2시간 동안 방치합니다. 100% 아세톤으로 1시간, 100% 에탄올로 1시간 동안 세 번 헹굽니다. 플런지 동결/동결 치환 방법은 현탁 세포의 세포 내 구조를 탁월하게 보존하는 결과를 가져왔습니다.Saccharomyces cerevisiae에서는 구조가 수축되지 않고 세포질이 조밀하게 나타납니다. 또한 멤브레인이 매끄럽기 때문에 보존이 잘되었다는 증거입니다. 핵, 미토콘드리아, 액포와 같은 모든 소기관을 완벽하게 식별할 수 있습니다.Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei 및 Escherichia coli에서도 우수한 보존이 관찰됩니다. 핵에서는 핵막을 형성하는 이중막, 핵공, 방추극체, 핵막의 외막에 부착된 리보솜이 뚜렷하게 보입니다. 미토콘드리아에서는 크리스타(cristae)라고 하는 내막 침습(internal membrane invaginations)이 명확하게 보입니다.중요한 세포 기관은 액포인데, 큰 얼음 결정이 쉽게 발달할 수 있기 때문입니다. 이미지에서 액포는 얼음 결정 손상 없이 완벽하게 보존되어 있습니다. 플런지 동결/동결 치환 방법도 단백질 면역국소화를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.이 절차는 단백질 항원성을 완벽하게 보존하며, 앞서 언급했듯이 세포 기관이 명확하게 식별됩니다. 항-ATP 합성효소(anti-ATP synthase) 및 항-포린(anti-porine)과 같은 효모의 다른 단백질을 표적으로 하는 다양한 항체가 이미 테스트되었습니다. 이러한 실험은 플라바린 단백질이 국소화된 리슈마니아(Leishmania)에서와 같이 다양한 실험 시스템에서도 가능합니다.이 비디오를 시청한 후에는 투과 전자 현미경에서 샘플을 시각화하기 위해 플런지 동결/동결 대체 방법으로 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 빠르고, 사용하기 쉽고, 비용이 저렴하고, 세포 인프라를 탁월하게 보존합니다. 액체 질소, 특히 사산화오스뮴과 아세트산 우라닐에 주의하십시오.그들은 실험실 코트와 장갑을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용한 상태에서 흄 후드에서 다루어야 합니다.

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

미세 구조 분석을 위해 신경 프로세스를 유지하기 위해, 우리는 유리 같은 얼음의 층에 현탁 샘플을 항복, 플래시 냉동으로 다음 전자 현미경 그리드에 대한 기본 뉴런의 도금을위한 프로토콜을 설명합니다. 이들 샘플은 나노 미터 스케일에서 구조를 시각화하는 극저온 전자 현미경으로 관찰 할 수있다.

극저온 전자 단층 촬영을 사용하여 냉동 수화 상태에서 신경 돌기를 시각화에 대한 기본 뉴런의 준비

기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

우리는 MS 시간적 해상도 막 역학의 시각화를 가능하게 전자 현미경, "플래시와 동결"에서 새로운 기술을 개발했다. 이 기술은 고압 동결 optogenetic 뉴런의 자극을 결합한다. 여기서 우리는 절차를 설명하고 상세하게 프로토콜을 설명합니다.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

여기에 제시된 것은 싱크로트론 극저온 X선 나노프로브를 사용한 X선 형광 이미징 이전에 실리콘 질화물 멤브레인 및 플런지 동결에 대한 세포 배양 프로토콜이다. 실온 나노 분석만 이 제공되면, 동결된 시료는 더욱 동결건조될 수 있다. 이들은 세포내 원소 조성물에 대한 정보를 얻기 위한 중요한 단계이다.

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

학습하세요 플런지 프리즈와 프리즈 서브스티튜션을 이용한 서스펜션 세포의 초미세구조 및 면역로컬라이제이션 연구 방법입니다. 이 저비용 기술은 투과전자현미경에서 세포 구조를 완벽하게 보존하여 다양한 생물학 연구에 활용됩니다.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

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