화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

이 프로토콜의 목표는 화학발광을 사용하여 트리요오드화물 및 염화바나듐 환원 용액을 사용하여 아질산염 및 질산염 수준을 정량화함으로써 생물학적 샘플의 산화질소를 정량화하는 것입니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 샘플에서 지역적 및 종단적으로 산화질소 대사 및 신호 전달을 추적하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 단순성과 높은 감도입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 IRTA 펠로우인 Katelyn Cassel입니다. 그녀는 트리요오드화물 용액과 결합된 화학발광으로 아질산염을 측정하는 방법을 보여줄 것입니다. 시작하려면 아질산염 보존 용액을 만드십시오.

증류수에 118 밀리몰 NEM 1개와 890 밀리몰 칼륨-페로시아나이드가 포함된 용액을 준비합니다. 용액이 결정이 없는 맑은 노란색이 될 때까지 고체를 용해합니다. 그런 다음 이 용액을 NP 40에 9:1 부피 비율로 추가합니다.

거품이 나지 않도록 용액을 부드럽게 섞으십시오. 이 혼합물을 소용돌이치지 마십시오. 아질산염 보존 용액은 섭씨 4도에서 보관하면 약 일주일 동안 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 새로 얻은 많은 생물학적 샘플에 사용할 수 있습니다. 이 경우, 갓 채취한 혈액을 원심분리하여 검사를 위한 혈장 샘플을 채취했습니다. 헤모글로빈 또는 미오글로빈과 같은 다량의 헴 단백질을 포함하는 혈액 또는 생물학적 샘플을 가능한 한 빨리 처리하는 것이 매우 중요한데, 이는 헴 단백질이 아질산염과 반응하여 아질산염을 파괴하기 때문입니다.

이제 대부분의 내인성 혈액 아질산염을 보존하기 위해 혈장을 아질산염 보존 용액과 1 대 4 부피 비율로 즉시 혼합하십시오. 이 준비의 모든 단계에서 샘플은 드라이 아이스에서 얼 수 있습니다. 샘플을 단백질을 제거하려면 동일한 양의 차가운 메탄올과 혼합하십시오.

다음으로, 섭씨 4도에서 15분 동안 13000G에서 샘플을 원심분리하여 단백질을 침전시킵니다. 상등액을 취하여 아질산염 측정에 사용하십시오. 아질산염의 민감한 측정의 경우 트리요오드화물 환원 용액이 가장 효과적인 것으로 간주됩니다.

준비할 때 모든 결정이 용해되는지 확인하십시오. 용액을 어두운 병에 보관하고 준비 후 일주일 이내에 사용하십시오. 염화 바나듐 환원 용액은 질산염 측정에 가장 높은 정밀도를 제공합니다.

아질산염의 1 마이크로 몰 용액은 질산염뿐만 아니라 아질산염에 대한 표준 곡선을 결정하는 데 사용됩니다. 제조업체의 지침에 따라 산화질소 분석기를 설정하십시오. 먼저 산소 탱크를 열고 기기를 켠 다음 1 몰 수산화물이 들어있는 산 트랩에 연결합니다.

다음으로, 헬륨 탱크를 연 다음 유리 반응 챔버를 헬륨 탱크에 연결합니다. 이제 아질산염 측정을 위해 반응 챔버에 트리요오드화물 용액을 로드합니다. 소포제를 첨가하십시오.

버블링을 늦추기 위해 가스 유량을 조정하십시오. 그런 다음 산 트랩을 반응 챔버에 연결합니다. 시행 착오를 거쳐 기기의 흡입에 맞게 헬륨 흐름을 올바르게 조정하십시오.

이제 비주얼 프로그래밍 기반 액체 소프트웨어를 시작하십시오. 먼저 Data 메뉴에서 기기와 수집 소프트웨어 간의 통신을 활성화한 다음 전면 패널의 메인 메뉴에서 분석을 시작합니다. 광전자 증배관이 섭씨 영하 12도 이하로 냉각되고 광전자 증배관이 안정화될 때까지 기다립니다.

약 30분 후에 기준선이 1 또는 2밀리볼트 이내로 안정화됩니다. 값의 안정성은 값 자체가 아니라 중요합니다. 분석기가 안정화된 후 잘 세척된 Hamilton 주사기를 사용하여 용액을 주입합니다.

먼저, 1 마이크로몰 아질산염 표준물질을 최소 3가지 부피로 주입합니다. 격막을 통해 환원 용액에 용액을 주입합니다. 모든 표준물질 또는 시료를 두 번 주입합니다.

높은 아질산염 수준과 샘플이 예상되는 경우, 표준 곡선의 기울기를 더 잘 측정하기 위해 대량의 표준 아질산염 용액을 4차 대량으로 주입하는 것을 고려하십시오. 항상 출력을 관찰하고 분석기가 기준선으로 다시 안정화될 때까지 기다렸다가 다음 샘플을 주입합니다. 이 작업은 최소 1분 정도 걸립니다.

정확한 결과를 위해 최대 700mV 미만의 시료량을 사용하십시오. 실행 사이에 주사기를 탈이온수로 철저히 씻으십시오. 주사기를 철저히 세척하는 것이 매우 중요합니다.

모든 측정이 끝나면 소프트웨어에서 중지 옵션을 누릅니다. 데이터가 자동으로 저장됩니다. 중단을 누르면 데이터를 저장하지 않고 측정이 종료됩니다.

반응 용기 상단의 스톱 콕을 닫고 산 트랩과 반응 용기를 연결하는 튜브를 분리합니다. 실험이 끝나면 분석기를 대기 상태로 전환합니다. 메인 패널에서 분석을 누르고 대기 모드로 들어가는지 확인합니다.

다음으로 공급 산소를 끕니다. O2 탱크에서 산 트랩으로 튜브를 분리합니다. 그런 다음 헬륨을 사용하여 트리요오드화물 용액을 씻어냅니다.

그런 다음 유리 반응 용기에서 헬륨 탱크를 닫고 분리합니다. 마지막으로 필요에 따라 에탄올과 물을 사용하여 용기를 청소합니다. 플라즈마 샘플과 함께 테스트 표준물질에 따르면 주입 직후 광전자 증배관 전압이 증가하여 모든 아질산염이 감소하면 기준선으로 돌아가며, 이는 최대 1분이 걸릴 수 있습니다.

신호를 정량화하기 위해 전압 점프 피크 아래 영역을 사용하여 표준에서 표준 곡선을 구성했습니다. 표준 곡선을 사용하여 샘플의 정량화는 중복 주입 간에 매우 재현성이 높았습니다. 화학발광은 아질산염 농도를 결정하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다.

일단 숙달되면 아질산염의 감도 한계는 20밀리몰 정도로 낮아집니다. 화학발광 작업에서 가장 중요한 것은 정밀도입니다. 이 방법의 감도가 높기 때문에 모든 실수가 최종 결과에 영향을 미칩니다.

그러니 시간을 갖고 서두르지 마십시오. 2000년대 초반에 이 기술이 개발된 후, 연구자들은 산화질소 대사 경로를 탐색하고 산화질소의 결핍이 많은 질병, 특히 심혈관 질환을 유발한다는 사실을 알게 되었습니다.