Name: 화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 아질산염과 질산염을 측정하는 방법을. 이 기술은 산화 질소 대사 및 신호 전달을 추적하는 데 높은 감도와 단순성을 제공합니다.

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저자는 혈액에서 아질산염 측정을위한 아질산 보존 용액의 사용을 개발 박사 A. Dejam와 MM의 Pelletier의 중요한 기여를 인정합니다.

동물의 사용을 포함한 모든 프로토콜은 NIDDK 동물 관리 및 사용위원회에 의해 사용이 승인되었고, 인간의 혈액은 건강한 기증자로부터 NIH 혈액 은행에서 얻었다. 1. 샘플 준비 <ol><li> 아질산염 보존 용액의 조제 <ol><li> 890 MM의 페리 시안화 칼륨 함유 한 용액 준비 (K 3의 Fe (CN)을 6) 및 증류수에 118 밀리미터 NEM (N-에틸 말레이 미드). 그것은 현재없이 결정 노란색 선명해질 때까지 잘 녹여. 9 비율 (V / V를, NP-40 / 솔루션) : 1에서 NP-40 (옥틸 phenoxylpolyethoxylethanol)를 추가합니다. )에 대한 주 동안 4 ° C에서 발포 및 저장을 피하기 위해 부드럽게 섞는다. </li></ol></li><li> 수집 및 혈액 샘플의 제조 <ol><li> 응고 (5 U / ㎖)을 방지하기 위해 헤파린 용혈을 방지하기 위해 적어도 20 G 바늘을 사용하여 혈액을 수집한다. (4 비율 절 : 전체 혈액 샘플의 경우, 아질산염은 1에서 즉시 해결책을 유지하여 혈액을 혼합/ V 솔루션 / 혈액). </li><li> 혈장과 적혈구 샘플은 원심 분리 4 ℃에서 4,000 × g으로 5 분에 수집 된 혈액을 적혈구 (RBC) 및 혈장을 분리한다. 상층 액 (혈장)을 가지고 플라즈마 아질산염 농도의 측정에 대해 상술 한 바와 같이 아질산 용액을 유지와 함께 혼합한다. </li><li> 조심스럽게 차단 피펫 팁을 이용하여 혈액 세포의 다른 형태에 의한 오염을 방지하기 위해 관의 하단에서 샘플 피펫 RBC 샘플로부터 혈장과 버피 코트를 나머지 제거 같은 아질산염 보존 용액을 함유하는 관에 옮긴다 상기와 비율. </li><li> 1 또는 1 : 비율 1 냉 메탄올 각 샘플 (플라즈마 및 RBC)를 혼합 2 (v / V를 샘플 / 메탄올)과 단백질을 침전시켜 15 분 동안 4 ° C에서 13,000 XG에 그들을 원심 분리기. -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 필요한 경우, 상층 액을 가지고 아질산염 측정을 위해 사용하거나 준비된 샘플을 동결. 참고 : 아질산염이 빠르게 REA혈액 형성 질산에 산화 헤모글로빈 (oxyHb)와 캐럿. oxyHb 항상 아질산 이상의 과량으로 존재하기 때문에,이 반응은 10 분 ~의 시간 프레임 네이티브 혈액 아질산 거의 완전히 소멸 리드. 내인성 혈액 아질산염의 대부분을 보존하기 위해, 아질산 보존 용액은 즉시 채혈 후의 전혈 샘플에 첨가한다. 용액을 신속하게, 화학적 아질산과 반응하지 않는 헤모글로빈의 비활성 형태 적혈구 용균 및 메트 헤모글로빈 (metHb) oxyHb로 산화된다. </li></ol></li><li> 다른 유형의 체액 샘플에서의 제조 <ol><li> 적당한 용기에 시료 채취 후, 아질산 보존 솔루션, deproteinate과 잘 혼합하고 즉시 측정하거나 -80 ° C에서 동결 및 저장. </li></ol></li><li> 수집 및 조직 샘플의 제조 <ol><li> 헤파린 염수 용액 (10 U 헤파 관류 동물 조직 수집린 / ㎖). 원하는 조직의 소비세 약 1 g 및 균질화 중 하나를 수동으로 균질화 또는 자동화 된 호모 게 나이저를 사용하여. </li><li> 부드러운 균질를 달성하기 위해 필요한 솔루션을 보존 아질산염의 알려진 금액을 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 39 ° C에서 전술 한 바와 같이 (2 비 V / V 샘플 / 메탄올 : 1 또는 1) 13,000 XG에서 원심 분리 한 후 시료의 조직이 균질화되면, 냉 메탄올을 사용하여 단백질을 침전. </li><li> 뜨는 및 측정 아질산염 수준을 수집합니다. 필요한 경우, -80 ° C에서 드라이 아이스 및 저장에 대한 준비의 모든 단계에서 샘플을 동결. </li></ol></li></ol> 솔루션을 감소 2. 준비 <ol><li> 트라이 - 요오드 (I 3) 아질산염 및 R- (X) -NO 종 결정 1,3,4에 대한 솔루션을 감소 <ol><li> 물에 138 밀리미터 I 2 용액과 함께 301 mM의 KI 용액을 준비합니다. 모든 때까지 ~ 30 분 동안 자기 교반기 7 비율 (V /의 / v 용액 산) : 2 빙초산과 혼합결정을 용해시킨다. 바람직하게는 요오드화 민감한 빛으로 어두운 병에 보관하고, 제조로부터 1 주일 이내에 사용한다. 참고 :이 솔루션은 NO에 아질산염을 줄일 수 있으며 또한 R-SNO, R-NNO 및 Fe-NO 작용기 (R-(X) -NO)에서 NO 해제되지만, 질산염은 영향을받지 않습니다. 상기 NO 계 관능기로부터 신호 산성화 설파 닐 아미드 (AS) 및 AS 처리 비교 미처리 신호 샘플의 절반의 처리에 의해 참된 아질산 신호로부터 분리 될 수있다. AS 비가 역적으로 아질산으로 디아 조늄 양이온을 형성하고,이 복합체는 I 3 용액에 의해 감소 될 수 없다. 치료 AS를 들어, 1 M 염산에 설파 닐 아미드의 290 mM의 용액을 제조하고 비 1 시료의 분취 량에 추가 : 9 (v / V를 AS / 샘플). 샘플의 AS 처리 및 치료 부분에서 CL 신호를 측정한다. 샘플의 AS 처리 및 처리되지 않은 부분의 차이로 실제 아질산염 신호를 계산합니다. 아질산염은 선택적 NIT를 사용하여 측정 할 수있다라이트 저감 ​​부 2.2에 기재된 아스코르브 / 아세트산 혼합물 용액. 그러나, 본 -NO 종 R- (X)의 보통 소량 AS 미처리 샘플을 이용하여 측정 아질산 총 함량의 좋은 근사 대부분의 경우에 의한. </li></ol></li><li> 아질산염 2의 선택적 결정을위한 아스코르브 산 / 아세트산 (4A) 솔루션 <ol><li> 물에 500 밀리미터의 아스 코르 빈산을 준비합니다. 반응 혼합물을 제조 7 (V / V, 아스코르브 산 / 아세트산) 비율 1 빙초산이 용액을 혼합한다. 참고 :이 솔루션은 아질산염에 대한 특정이며, 모든 R- (X) -NO 종 또는 질산에서 NO 공개하지 않습니다. 아스코르브 산 용액에 쉽게 산화 그러나 아스코르브 아세트산 용액을 매일 측정 전에 신선하게 제조되어야한다. 아질산 환원 완료 아스코르브 산 농도에 의존한다; 적어도 50 MM의 아스 코르 빈산는 전체 R을 권장합니다플라즈마 아질산 냄. 그러나, 이전의 마지막 샘플의 측정을 기대 아질산염 농도 범위 아스코르브 산과 아질산 표준 상이한 농도로 몇 파일럿 실험을 수행 할 것을 권장한다. 아스 코르 빈산 약간 측정하는 동안 고갈 있다는 사실을 숙지, 유리 반응 챔버의 반응 혼합물을 너무 자주 변경을 권장합니다. </li></ol></li><li> 질산 판정 9 바나듐 (III) 클로라이드 환원 용액 <ol><li> 1 M 염산에 식 VC1 3의 51 mM의 솔루션을 준비합니다. 어두운 병에 200 μm의 필터와 매장을 통해 필터 솔루션은 2 주 이내에 사용한다. 참고 :이 솔루션은 질산염, 아질산염 및 모든 R- (X) -NO 종을 줄일 수 있으므로 계산하는 아질산염 또는 기타 R-의 비교 양 (X) -NO 종을 함께 질산과 존재, 최종 질산염 함량이 경우 식 VC1 3 I 얻어진 CL 신호들 간의 차이로서세 용액을 감소시킨다. </li></ol></li></ol> 3. 화학 발광 (CL) 분석기 설치 및 측정 <ol><li> 표준 용액 <ol><li> 아질산 나트륨 용액을 1 μM (에 NaNO 2)을 준비한다. 동일한 용액 아질산염 및 질산염 결정에 사용될 수있다. </li></ol></li><li> NO 분석기를 사용하지 참고 : 현재 생물학적 연구 목적으로 충분히 구분이 상업적으로 사용 가능한 분석기가 없습니다 - SIEVERS NOA와 Ecophysics CLD의 88Y이. 이들은 모두 동일한 원리로 동작; 주요 차이점은 CLD 88Y 오존 있도록 실내 공기로부터 산소를 사용하는 것이다 (O 3) NOA이 목적을 위해 외부 산소 탱크를 필요로있다. 아래의 절차는 SIEVERS NOA의 설정을 설명합니다. <ol><li> 장비 설치 <ol><li> 제조업체의 권장 사항에 따라 NO 분석기의 초기 설정을 수행합니다로 그림 1에서 볼. </li><li> 악기에 연결 열기 O 2 탱크. &quot;분석&quot;을 선택하고 전면 패널의 주 메뉴에서 &quot;입력&quot;. 다음 화면에서 선택 &quot;시작&quot;을 누르면 &quot;입력합니다.&quot; 그림 1에서 볼 수 있듯이 악기 (1 M NaOH를 함유) 산 트랩을 연결합니다. </li><li> 광전자 증은 -12 ° C 이하의 온도로 냉각하고, 반응 챔버는 6 토르에 철수 될 때까지 기다립니다. 그것은 안정된 평면 기준에 도달하기 약 30 분 소요됩니다. 베이스 라인은 (1) 내에 안정 필요 - 2 MV, 공칭 값은 안정성보다 중요하다. 참고 : 질산염을 측정하는 경우, 냉각 (산, 물, 증기뿐만 냉각 트랩을 제공 4 ° C에서 설정) 수조 및 가열 수조 (주 반응 챔버, 95 ° C)를 켭니다. 식 VC1 3 용액에 질산 NO의 감소율은 온도 의존적이며, 실내 템페 매우 느리다rature는 온도 정도로 크게 증가하여 반응을 관찰 할 필요가있다. </li><li> 헬륨 탱크를 열고 그림 1에서와 같이 산 함정에 유리 반응 챔버를 연결합니다. 적절한 환원 용액과의 반응 챔버를 채우고 최소 버블을 감소시키고 산 트랩에 반응 챔버를 연결한다. 시행 착오를 사용하여 악기 흡입 속도 (Siever의 NOA에 대한 보통 ~ 200 ml / 분)와 일치하는 그는 버블 링 속도를 조정합니다. </li><li> 기기를 제어하는 ​​컴퓨터를 켜고와 LabVIEW 기반의 액체 소프트웨어를 시작합니다. 악기와 수집 소프트웨어를 누르 사이의 통신을 설정하려면 화면이 표시 될 때까지 &quot;데이터 메뉴&quot;의 &quot;출력 활성화&quot;할 때, 다음 &quot;명확한&quot;를 눌러 데이터 화면으로 다시 돌아갑니다 &quot;입력&quot;. </li><li> 화면에 안정적인베이스 라인 추적 기다린 격막을 통해 솔루션을 감소로 샘플 및 아질산염 기준을 주입 시작합니다. 항상 안정된베이스 라인 후방에 도달하는 대기피크 어. 이 2 분까지 걸릴 수 있습니다. 액상 소프트웨어는 주입의 옵션을 &quot;마크&quot;시간을 가지고 있으며, 사출 주석과 데이터 파일 (filename.data)에 유용한 보완와 같은 별도의 파일 (filename.info)에 이러한 의견을 내 보냅니다. </li><li> 시료와 표준 측정되면, 선택 액체 소프트웨어 메뉴에서 옵션을 &quot;중지&quot;-이 &quot;filename.data&quot;로 알려진 영구 파일에 임시 파일에서 데이터를 기록합니다. 누르면 &quot;중단&quot;옵션은 영구적 인 파일로 수집 된 데이터를 작성하지 않고 측정을 종료합니다. </li><li> 실험 종료 반응 용기의 상부에 콕을 해제하여 반응 용기에서 시스템을 분리하고 아세트산 트랩 반응기 튜브 사이를 분리하기 위해 (도 1 참조). 지금 NOA 분석기를 중지 -를 눌러 &quot;일반&quot;, &quot;대기 모드&quot;와 &quot;확인&quot;대기 기계를 넣어 &quot;분석&quot;로 이동합니다. 정기적으로 사용 된 경우기기는 몇 주 동안 대기 상태로 남아있을 수있다. 산소의 공급을 끕니다. 이어서, 반응 챔버로부터 단절 환원 용액을 비우고 유리 반응 용기에서 그 탱크를 닫고 반응 용기 세정을 완료. </li></ol></li><li> 표준 및 샘플 주사 <ol><li> 잘 세척 해밀턴 주사기를 이용하여 반응 혼합물에 1 μM 아질산 용액 50 ㎕를 주입한다. 피크의 좋은 분리를 달성하기 위해 주사 사이의 2 분 - 최소 1 기다립니다. 50 μL의 반복 주입은 각 데이터 포인트에 중복을 얻을 수 있습니다. 각 주사 후 탈 이온수로 주사기를 씻으십시오. </li><li> 1 μM 아질산염 용액 100, 150 μL의 중복 주사를 계속, 표준 곡선 데이터의 전체 세트를 획득하려면 (아질산염 또는 질산염의 높은 농도이 예상되는 경우 추가 200 μL 필요). 각각의 경우에, 신호가 기준으로 다시 떨어질 때까지 기다려야하는데주의를 기울여야하고 1 취득 - 2 마일베이스 라인의, n은 피크의 좋은 분리를 달성했다. 주 : 아질산염 표준은 실험하는 동안 언제든지 측정 할 수있다. 또한 기기의 기능의 독립적 체크로서 기능하지만, 이는, 데이터 측정하기 전에 표준 곡선을 취득하는 것이 바람직하다. 데이터가 수집되면, 시료의 양이 아니라 발음 봉우리로 연결되어야 주입. 그러나이 광전자 증 배관이 만 ~ 800 MV 최대 선형 있음을 명심해야한다 그래서 피크 아무도 ~ 700 MV보다 높을 수 없습니다. 이 주입 양은 시료의 감소 또는 탈 이온수를 이용하여 시료를 희석하여를 얻을 수있다. 각 점은 중복 적어도 측정해야한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

박사 앨런있는 Schechter는 심혈관 질환의 치료를위한 아질산 염의 사용을 위해 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 발행 된 여러 특허의 공동 발명자로 표시됩니다. 그는 임상 개발하지만 다른 보상을위한 특허의 NIH 라이선스에 따라 로열티를 받는다.

프로토콜 내에서 중요한 단계 원래 샘플을 준비 희석하거나 치료하는 데 사용 (물 포함) 모든 솔루션의 분취 량을 저장해야하고 가능 아질산염 또는 (더 자주) 질산염 오염 검사. 우리는 대부분의 오염 물에서 오는 많은 화학 물질이 또한 내생 질산 결정을 방해하는 몇 가지 많이에서 질산염 오염의 상당량을 함유 샘플 (특히 페리 시안화)을 치료하는 데 사용되는 것으로 나타났습니다. 우리는 일반 실험에 사용하기 전에 따라서 우리는 아질산염과 질산염 오염 물질에 대한 우리의 화학 물질을 모두 확인합니다. 샘플 희석 치료 동안 실질적으로 수 차례 실시 할 수 있으므로, 모든 조작은 샘플을 최종 농도 계산에 기록 될 필요가있다. 대부분의 실수는 프로토콜의이 부분에 만들어집니다. 아질산염의 측정으로 빠른 전송을 위해 샘플을 취급 할 때용액을 보존 아질산염은 아질산과 반응하여 질산으로 산화시킨다...

아질산염, 그리고 덜 확장 질산에, 혈액 수준은 신체의 전반적인 상태를 NO 신진 대사를 반영하지 않습니다. 마이크로 범위 - 아질산염의 혈중 농도와 대부분의 기관 및 조직은 높은 나노 몰거나 낮은 마이크로 몰 범위에서, 질산염이 훨씬 높은 금액에 일반적으로 존재한다. 인한 질병 진행에 아질산 수준의 변화 나 식생활의 변화는 상당히 작기 때문에 단지 매우 민감한 방법을 사용하여 측정 할 수있다. 때문에 매우 다른 수준과 다른 대사 과정의, 아질산염과 질산염 수준의 별도의 결정이 필수적이다. 아질산염과 질산염이 함께 측정 아주 작은 값을 가지고있다 &quot;질소 산화물의 결정&quot;소위 없습니다. 다양한 생물학적 시료의 아질산염의 정량을위한 여러 방법이 개발되어 - 가장 일반적인 원래도 현대 modificatio와 1879에서 설명되었던은 Griess 반응을 이용한 가장 오래된 하나 인NS는은 Griess &#39;방법에 의해 달성 아질산염의 감도 한계는 낮은 마이크로 몰의 범위이다. 트리 요오드 용액을 환원 결합 화학 발광 (CL)은, 현재 아질산염 농도 1-8,10,11 낮은 나노 몰 범위의 정량화를 허용 가장 민감한 방법으로 간주된다. 바나듐 (III) 클로라이드 용액을 줄이는 조합 같은 CL에있어서, 상기 나노 몰 범위 9 정밀도, 질산 민감한 측정에 사용될 수있다. CL은 무료 가스 NO를 감지합니다. 따라서, 아질산염, 질산염, R-nitrosothiols (R-SNO)는, R-니트로 소아 민 (R-NNO) 또는 금속 NO 화합물 (이후 원고라고도 &quot;R- (X) -NO&quot;)로 변환해야 CL을 통해 원래의 양을 정량화하기 위해 NO 가스를 해제하지 않습니다. NO로 변환은 NO 대사 산물의 특성에 따라 여러 가지 환원 용액을 사용하여 달성된다. 변환 후에, 무료 NO 가스는 캐리어 가스 (그는, N에 의해 ​​반응 용기에서 제거되지이 오존 (O 3) 이산화질소를 형성 NO와 결합 CL 분석기의 반응 챔버 내로 AR) (NO 2)의 활성화 된 상태이다. 그라운드 상태로 되돌아와, NO 2 * 적외선 영역에서 방출 및 방출 광자 CL 악기의 광전자 증 배관 (PMT)에 의해 검출된다. 발광 강도는 적절한 보정 곡선을 사용하여 원래 종의 농도의 산출이 가능 반응 챔버의 NO 농도에 정비례한다. 우리의 프로토콜에서는 가장 많이 사용되는 임상 설정에서 아질산염과 질산염의 첫 번째 본 CL 기반의 결정 - 혈액과 혈장, 그리고 우리는 조직 샘플에서 이러한 이온을 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 또한 혈액과 구획 혈장과 적혈구 등의 아질산염 - 반응성 환경에서 본래 생리 아질산염 농도를 보존하는 방법을 상세히 설명한다.

<table><tbody><tr><td>페리시아나이드 칼륨; K3Fe(CN)6</td><td>시그마</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-에틸말레이미드</td><td>시그마</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40;4-노닐페닐-폴리에틸렌 글리콜</td><td>시그마</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>설파닐아미드; 그대로&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>요오드화 칼륨; KI</td><td>시그마</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>요오드; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>빛에 민감하고 독성이 있는</td></tr><tr><td>아질산나트륨; 염화 바나듐 (III) NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr>;<tr><td> VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>민감하고 독성이 강한</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; 생태물리학&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

산화 질소 (NO), 혈관 항상성과 같은 신경 전달 물질의 주요 조절 분자이다. 효소 생성 된 NO는 다양한 옥시 헴 (heme) 단백질 및 기타 아직 잘 알려져 있지 경로와 상호 작용에 의해 아질산염과 질산염으로 산화된다. 역방향 프로세스는 NO로 아질산염 및 질산염의 환원은 지난 10 년 포유류에서 발견되었다 그것을 방지하거나 것으로 생각된다 심혈관, 대사 및 근육 질환의 전체 범위를 완화하는 하나의 가능한 경로들 중 하나로서 주목 받고있다 NO의 감소 된 수준과 연관 될 수있다. 혈액, 체액 및 다양한 조직 - 다른 신체 구획 NO 및 대사 물질의 양을 추정하는 것이 중요하다. 혈액 의한 쉬운 접근성, NO 대사 추정을 위해 사용되는 것이 바람직 함이다. 그것의 짧은 수명 (밀리 초)과 낮은 서브 나노 몰 농도, NO 혈액의 직접 신뢰할 수있는 측정에 &lt;EM&gt; 생체 본 큰 기술적 인 문제입니다. 따라서 예약 가능한 보통의 산화 생성물, 아질산, 질산의 양에 기초하여 추정되지 않는다. 이 두 대사는 항상 개별적으로 측정된다. 생물학적 체액 및 조직에서 자신의 농도를 결정하기 위해 몇 가지 잘 확립 된 방법이 있습니다. 여기에서 우리는 각각 트리 요오드 또는 바나듐 (III) 클로라이드 솔루션에 의해 아질산염이나 질산염 감소 후 NO의 spectrophotometrical 검출에 기초하여, 화학 발광 법 (CL)에 대한 프로토콜을 제시한다. 아질산염 및 질산염 검출 감도는 NO 대사 경로의 변화를 결정하기 위해 현재 이용 가능한 가장 민감한 방법으로 CL 설정 낮은 나노 몰 범위이다. 우리의 샘플에서 각각의 양을 결정하는 방법과 수집시 아질산염 및 질산염 본 원래 양을 보존하기 위해 생물학적 유체 및 조직으로부터 샘플을 준비하는 방법을 상세히 설명한다. CL 기술의 한계도 특급lained.

그림 2는 표준과 다섯 가지의 샘플에서 수집 한 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 도면에 도시 된 바와 같이, 광전자 전압 증가 아질산염 - 함유 용액 (표준 또는 샘플) 용액을 감소 주입 직후의 기준 값으로 복귀 주입에 한꺼번에 아질산 본 (주사 시간은 적색 곡선 아래의 화살표로 표시된다) 용액을 감소시켰다. 또한 정확한 부피 측정 재현성 높은 데이터를 얻기 위해 필요한 동 도면으로부터 분명하다. 우리는 사출 볼륨을 측정하는 정밀 해밀턴 주사기를 사용하는 것이 좋습니다. I (3) (또는 아스코르브 산 또는 식 VC1 3) 용액의 용량을 감소 손실은 에러의 또 다른 일반적인 원인이다. 피크의 기준 폭은 반응 실 내의 용액이 변경되어야 감소 상당히 넓게 시작 원칙적있다. 피크 폭은 NO로 가스 흐름에 따라(그림 1에 RC로 표시) 반응 챔버는, 그것은 약간 다른 설정 한 ...

산화질소(NO)는 혈관 항상성에서 중요한 신호 분자입니다. NO in vivo 생산량은 직접 측정하기에 너무 낮습니다. 화학발광(Chemiluminescence)은 전구체와 산화 생성물인 아질산염 및 질산염을 측정하여 NO cycle에 대한 유용한 통찰력을 제공합니다. 신체 조직과 체액에서의 아질산염/질산염 측정에 대해 설명합니다.

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

이 프로토콜의 목표는 화학발광을 사용하여 트리요오드화물 및 염화바나듐 환원 용액을 사용하여 아질산염 및 질산염 수준을 정량화함으로써 생물학적 샘플의 산화질소를 정량화하는 것입니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 샘플에서 지역적 및 종단적으로 산화질소 대사 및 신호 전달을 추적하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 단순성과 높은 감도입니다.이 절차를 시연하는 사람은 IRTA 펠로우인 Katelyn Cassel입니다. 그녀는 트리요오드화물 용액과 결합된 화학발광으로 아질산염을 측정하는 방법을 보여줄 것입니다. 시작하려면 아질산염 보존 용액을 만드십시오.증류수에 118 밀리몰 NEM 1개와 890 밀리몰 칼륨-페로시아나이드가 포함된 용액을 준비합니다. 용액이 결정이 없는 맑은 노란색이 될 때까지 고체를 용해합니다. 그런 다음 이 용액을 NP 40에 9:1 부피 비율로 추가합니다.거품이 나지 않도록 용액을 부드럽게 섞으십시오. 이 혼합물을 소용돌이치지 마십시오. 아질산염 보존 용액은 섭씨 4도에서 보관하면 약 일주일 동안 사용할 수 있습니다.이 프로토콜은 새로 얻은 많은 생물학적 샘플에 사용할 수 있습니다. 이 경우, 갓 채취한 혈액을 원심분리하여 검사를 위한 혈장 샘플을 채취했습니다. 헤모글로빈 또는 미오글로빈과 같은 다량의 헴 단백질을 포함하는 혈액 또는 생물학적 샘플을 가능한 한 빨리 처리하는 것이 매우 중요한데, 이는 헴 단백질이 아질산염과 반응하여 아질산염을 파괴하기 때문입니다.이제 대부분의 내인성 혈액 아질산염을 보존하기 위해 혈장을 아질산염 보존 용액과 1 대 4 부피 비율로 즉시 혼합하십시오. 이 준비의 모든 단계에서 샘플은 드라이 아이스에서 얼 수 있습니다. 샘플을 단백질을 제거하려면 동일한 양의 차가운 메탄올과 혼합하십시오.다음으로, 섭씨 4도에서 15분 동안 13000G에서 샘플을 원심분리하여 단백질을 침전시킵니다. 상등액을 취하여 아질산염 측정에 사용하십시오. 아질산염의 민감한 측정의 경우 트리요오드화물 환원 용액이 가장 효과적인 것으로 간주됩니다.준비할 때 모든 결정이 용해되는지 확인하십시오. 용액을 어두운 병에 보관하고 준비 후 일주일 이내에 사용하십시오. 염화 바나듐 환원 용액은 질산염 측정에 가장 높은 정밀도를 제공합니다.아질산염의 1 마이크로 몰 용액은 질산염뿐만 아니라 아질산염에 대한 표준 곡선을 결정하는 데 사용됩니다. 제조업체의 지침에 따라 산화질소 분석기를 설정하십시오. 먼저 산소 탱크를 열고 기기를 켠 다음 1 몰 수산화물이 들어있는 산 트랩에 연결합니다.다음으로, 헬륨 탱크를 연 다음 유리 반응 챔버를 헬륨 탱크에 연결합니다. 이제 아질산염 측정을 위해 반응 챔버에 트리요오드화물 용액을 로드합니다. 소포제를 첨가하십시오.버블링을 늦추기 위해 가스 유량을 조정하십시오. 그런 다음 산 트랩을 반응 챔버에 연결합니다. 시행 착오를 거쳐 기기의 흡입에 맞게 헬륨 흐름을 올바르게 조정하십시오.이제 비주얼 프로그래밍 기반 액체 소프트웨어를 시작하십시오. 먼저 Data 메뉴에서 기기와 수집 소프트웨어 간의 통신을 활성화한 다음 전면 패널의 메인 메뉴에서 분석을 시작합니다. 광전자 증배관이 섭씨 영하 12도 이하로 냉각되고 광전자 증배관이 안정화될 때까지 기다립니다.약 30분 후에 기준선이 1 또는 2밀리볼트 이내로 안정화됩니다. 값의 안정성은 값 자체가 아니라 중요합니다. 분석기가 안정화된 후 잘 세척된 Hamilton 주사기를 사용하여 용액을 주입합니다.먼저, 1 마이크로몰 아질산염 표준물질을 최소 3가지 부피로 주입합니다. 격막을 통해 환원 용액에 용액을 주입합니다. 모든 표준물질 또는 시료를 두 번 주입합니다.높은 아질산염 수준과 샘플이 예상되는 경우, 표준 곡선의 기울기를 더 잘 측정하기 위해 대량의 표준 아질산염 용액을 4차 대량으로 주입하는 것을 고려하십시오. 항상 출력을 관찰하고 분석기가 기준선으로 다시 안정화될 때까지 기다렸다가 다음 샘플을 주입합니다. 이 작업은 최소 1분 정도 걸립니다.정확한 결과를 위해 최대 700mV 미만의 시료량을 사용하십시오. 실행 사이에 주사기를 탈이온수로 철저히 씻으십시오. 주사기를 철저히 세척하는 것이 매우 중요합니다.모든 측정이 끝나면 소프트웨어에서 중지 옵션을 누릅니다. 데이터가 자동으로 저장됩니다. 중단을 누르면 데이터를 저장하지 않고 측정이 종료됩니다.반응 용기 상단의 스톱 콕을 닫고 산 트랩과 반응 용기를 연결하는 튜브를 분리합니다. 실험이 끝나면 분석기를 대기 상태로 전환합니다. 메인 패널에서 분석을 누르고 대기 모드로 들어가는지 확인합니다.다음으로 공급 산소를 끕니다. O2 탱크에서 산 트랩으로 튜브를 분리합니다. 그런 다음 헬륨을 사용하여 트리요오드화물 용액을 씻어냅니다.그런 다음 유리 반응 용기에서 헬륨 탱크를 닫고 분리합니다. 마지막으로 필요에 따라 에탄올과 물을 사용하여 용기를 청소합니다. 플라즈마 샘플과 함께 테스트 표준물질에 따르면 주입 직후 광전자 증배관 전압이 증가하여 모든 아질산염이 감소하면 기준선으로 돌아가며, 이는 최대 1분이 걸릴 수 있습니다.신호를 정량화하기 위해 전압 점프 피크 아래 영역을 사용하여 표준에서 표준 곡선을 구성했습니다. 표준 곡선을 사용하여 샘플의 정량화는 중복 주입 간에 매우 재현성이 높았습니다. 화학발광은 아질산염 농도를 결정하기 위한 황금 표준으로 간주됩니다.일단 숙달되면 아질산염의 감도 한계는 20밀리몰 정도로 낮아집니다. 화학발광 작업에서 가장 중요한 것은 정밀도입니다. 이 방법의 감도가 높기 때문에 모든 실수가 최종 결과에 영향을 미칩니다.그러니 시간을 갖고 서두르지 마십시오. 2000년대 초반에 이 기술이 개발된 후, 연구자들은 산화질소 대사 경로를 탐색하고 산화질소의 결핍이 많은 질병, 특히 심혈관 질환을 유발한다는 사실을 알게 되었습니다.

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연구

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질소 산화물 (NO)의 내생적인 생산은 생물 학적 기능의 다양한 조절. 그것은 어떠한 기반 시그널링의 장애 또는 dysregulation이 많은 사람이 질병에 연루되어 있는지 점점 더 분명 해지고 있습니다. 메소드는 더 이상 metabolites 인간 질병에 대한 소설 진단 또는 전조 생체 자료를 제공할 수 없습니다 관련된 계량합니다.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

염증성 세포 신호 분자인 산화질소(NO)의 수준은 일반적으로 Griess 시약을 사용하여 분석합니다. 이 프로토콜에서는 간단하고 정량화할 수 있으며 반복 가능한 방법으로 NO의 분비를 검출하기 위해 살아있는 초파리 뇌 조직을 사용하여 변형된 Griess 분석을 만들었습니다.

Drosophila Neuroinflammatory Response에서 산화질소 수치의 새로운 전체 조직 정량 분석

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

이전 연구는 대기 중 질소 산화물의 질소 동위원소 구성이 환경에 대한 다양한 공급원의 영향을 구별할 수 있음을 시사합니다. 우리는 시간별 시간 분해능에서 N 동위원소 분석을 위한 대기 NOx의 높은 수집 효율을 위한 자동화된 모바일 현장 기반 방법에 대해 보고합니다.

고해상도 모바일 콜렉션 시스템은 NO의 질소 동위 원소 분석, 자동화<sub&gt; X</sub

이 문서는 postharvest 해충에 대 한 산화 질소 (NO) 훈 증 프로토콜을 설명합니다. 질소 (N2) 아니오 전에 ultralow 산소 조건 설정 하로 훈 증 챔버 플러시 주입. 끝에, 챔버 N2 없음2에 노출을 방지 하기 위해 주변 공기에 제품을 노출 하기 전에 노 희석 플러시됩니다.

산화 질소 가스와 해충에 대 한 훈 증 실험실의 절차

시 토 크롬 P450s에 의해 발암 성 니트로의 α-hydroxylation는 돌연변이 일으키는 원인이 되는 DNA 손상 중간체 생산 허용된 신진 대사 통로. 그러나, 새 데이터 나타냅니다 nitrosamides 산화 추가 발생할 수 있습니다. 우리는 일반 설명 nitrosamides을 탐지 하기 위한 방법 체 외에서 시 토 크롬 P450 촉매의 물질 대사 니트로에서 생산.

체 외에 대사 시 토 크롬 P450s에 의해 니트로의 Nitrosamide 형성을 탐지 하기 위한 일반적인 방법

14NH4+15NH4+분석을 기반으로 잠재적 DNRA 속도를 결정하는 일련의 방법이 자세히 제공됩니다.+ NH4+ 여러 단계를 통해 N2O로 변환하고 쿼드러폴 가스 크로마토그래피 - 질량 분석법을 사용하여 분석된다.

14NH4+/15NH4+ N2O로순차적변환을 통한 분석 에 따른 암모늄에 대한 질산염 감소의 잠재적 비율 측정

우리는 질산염과 아질산염의 수준을 측정하고 비교하기 위해 쥐 골격근 조직의 4 가지 근육 그룹의 균질화를위한 세 가지 다른 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 또한 조직 샘플 크기가 균질화 결과에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 다양한 샘플 가중치를 비교합니다.

질산염 및 아질산염 측정을 위한 쥐 골격근 균질액의 제조

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

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이 프로토콜은 삼이오다이드 기반 화학발광 분석법을 이용해 위단 분비물(ALI)에서 분화된 기도 상피 배양에서 일산화질소(NO) 생성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

공기 액체 계면에서 분화된 마우스 기관 상피 세포 배양에서 질소 산화물 생성 측정

배우세요 화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 아질산염과 질산염을 측정하는 방법을. 이 기술은 산화 질소 대사 및 신호 전달을 추적하는 데 높은 감도와 단순성을 제공합니다.

화학 발광 법을 사용하여 생체 물질에서 산화 질소 통로에서 아질산염과 질산염, 대사 산물을 측정

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