신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

이 프로토콜의 목표는 신경화학적 동일성을 결정하기 위해 특정 항체로 재염색하기 전에 형태 회복을 위해 biocytin 및 immunostaining을 사용하여 전기생리학적 기록 중에 패치된 뉴런을 식별하는 효율적인 방법을 제시하는 것입니다. 따라서 이 방법은 신경 세포의 구조와 기능의 다양성을 연구하는 데 필요한 중요한 단계를 설명합니다. 이것은 뇌 네트워크에서 그들의 역할을 이해하는 데 필수적입니다.

순차 처리 기술을 사용하는 주요 이점은 형태를 복구할 수 없기 때문에 데이터 손실을 제거한다는 것입니다. 따라서 이것은 또한 이러한 세포에서 테스트하기 위해 신경화학적 마커를 안내하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 두꺼운 절편에서 세포의 형태학적 회수를 위해 설명되지만, 얇은 절편과 이전에 염색 및 장착된 샘플에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 중성물질은 셀에서 분리되는 동안 소마를 다시 밀봉하는 데 어려움을 겪을 수 있으며 성공적인 충전을 위한 충분한 시간을 허용하지 못할 수 있습니다. 완전한 형태를 회복하기 위해 세포의 효과적인 바이오사이틴 충전을 위해 특정 기술이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 전압 클램프 구성에서 셀에 접근하는 동안 수조 모드에서 멤브레인 테스트 기능을 사용하여 작고 간단한 전압 단계를 적용합니다.

흡입을 가하여 세포에 패치합니다. 그런 다음 셀을 음의 70 밀리 볼트로 유지합니다. 기가옴 씰(gigaohm seal)의 발달에 주목하십시오.

용량성 과도 현상을 보상한 다음 주사기 또는 입으로 제어된 흡입을 적용하여 전체 세포 구성을 달성합니다. 전체 셀 커패시턴스와 직렬 저항을 추정하고 멤브레인 테스트 펄스를 중지합니다. 10메가옴 미만의 직렬 저항이 최적입니다.

이를 통해 바이오사이틴 충전을 가능하게 하는 전체 세포 기록 조건을 확립할 수 있습니다. 생리학적 기록이 완료되면 전압 클램프 모드에서 위와 바깥쪽으로 번갈아 가며 기록 피펫을 작은 단계로 천천히 움직여 패치 클램프 구성을 다시 설정합니다. 세포의 형태학적 회복을 달성하는 데 있어 가장 중요한 단계는 세포에서 기록 피펫을 분리하면서 뉴런 소마를 다시 밀봉하는 것입니다.

멤브레인 테스트 기능을 사용하여 용량성 과도 현상의 손실과 직선에 대한 전류 응답의 붕괴를 시각화하며, 이는 셀의 재밀봉 및 피펫 팁에 외부 아웃 패치의 설정을 나타냅니다. 그 동안, 셀을 탈분극 전위로 유지하면 재밀봉 프로세스가 용이해집니다. 세포에서 피펫을 분리한 후, 염료가 원위 수지상 및 축삭돌기로 운반되도록 하기 위해 절편을 기록 챔버에 3-5분 동안 유지합니다.

그런 다음 고정을 위해 슬라이스를 4% PFA가 포함된 24웰 플레이트로 옮깁니다.PFA 고정 후 24-48시간이 지나면 면역염색 전에 보관하기 위해 모든 고정 슬라이스를 영점 1몰 PBS로 옮깁니다. 이 절차에서는 영점 1 어금니 PBS에서 각각 10 분 동안 조직을 세 번 씻습니다.

다음으로, 10% 차단 혈청이 함유된 조직을 실온에서 1시간 동안 차단합니다. 그 후, 1차 항체 CB1R의 절편을 하룻밤 동안 실온에서 배양하여 카나비노이드 수용체 유형 1 발현을 확인합니다. 그런 다음 0.1 어금니 PBS로 각각 10분씩 뇌 부분을 세 번 씻습니다.

스트렙타비딘(Streptavidin)과 1차 1차 항체에 대한 2차 항체를 모두 웰 플레이트에 첨가하고 섭씨 4도에서 밤새 유지합니다. 그 후, streptavidin red dye conjugate에서 섭씨 4도의 절편을 어둠 속에서 하룻밤 동안 배양하여 biocytin을 드러냅니다. 그 후, 0.1 어금니 PBS로 각각 10분씩 뇌 부분을 3회 세척합니다.

형광을 보호하고 향후 재염색을 용이하게 하려면 동일한 간격의 장착 매체에 섹션을 장착하십시오. 커버 슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉하십시오. 이 단계에서는 아세톤이 든 면봉으로 유리 슬라이드에서 매니큐어를 벗겨냅니다.

덮개를 제거하고 가는 팁 집게를 사용하여 조심스럽게 미끄러지고 섹션에 0.1 어금니 PBS의 몇 방울을 떨어뜨립니다. 수성 장착 매체에서 조직을 분리하는 동안 공정 조직을 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 미세한 붓을 사용하여 슬라이드에서 섹션을 조심스럽게 제거하고 셰이커에서 24-48시간 동안 0.1몰 PBS로 세척하고 섭씨 4도에서 빛을 멀리하십시오.

장착 매체를 완전히 제거하려면 다음 날 0.1 몰 PBS로 매번 10분 동안 섹션을 1-2회 세척합니다. 그런 다음 하루 동안 두 번째 1차 항체인 콜레시스토키닌으로 절편을 배양합니다. 0.1 어금니 PBS로 각각 10분씩 뇌 절편을 3회 세척합니다.

그 후, 형광단 접합 2차 항체 염소 항 마우스로 섹션을 염색합니다. 2차 항체의 여기 방출 스펙트럼이 스트렙타비딘 및 이전 면역형광 염색과 겹치지 않는지 확인합니다. 그런 다음 수성 장착 매체에 섹션을 장착합니다.

커버 슬립의 가장자리를 투명한 매니큐어로 밀봉하십시오. 성공적인 바이오사이틴 충전과 첫 번째 면역염색 과정에 따라 60배 배율로 얻은 컨포칼 이미지와 같이 신경 구조를 시각화하고 이미지화할 수 있습니다. 이 절편은 또한 바이오사이틴과 함께 CB1R에 대해 면역염색되었으며, 신경세포종을 발현하는 바이오사이틴에서 CB1R 면역염색은 화살촉으로 표시됩니다.

1주일 후 CCK 면역 반응성에 대해 동일한 섹션을 처리했으며, 이미지는 별표로 표시된 여러 뉴런에서 CCK 면역 표지의 성공적인 회복을 보여줍니다. 화살촉으로 표시된 biocytin 표지 세포는 CCK를 발현하지 않았습니다. 패널 A, B, C의 병합된 이미지는 세 가지 라벨이 모두 견고하게 시각화되어 있으며 바이오사이틴과 CB1R 간의 오버레이가 분명하다는 것을 보여줍니다.

이미지는 두 번째 면역염색 공정이 이전 염색 공정의 신호를 손상시키지 않는다는 것을 보여줍니다. biocytin으로 채워진 세포의 형태는 이 CCK 면역염색 전에 컨포칼 이미지로부터 얻어졌습니다. 결정적으로, 소마(soma)와 덴드라이트(dendrite) 외에도 축삭돌기를 시각화할 수 있으며, CB1R과 바이오사이틴(biocytin)으로 표지된 축삭돌기의 공동 표지가 관찰됩니다.

이 절차를 시도하는 동안, 절단된 돌기가 있는 뉴런을 피하기 위해 슬라이스 표면 아래에 위치한 건강한 세포를 표적으로 삼는 것이 중요합니다. 그리고 그것은 형태학의 회복을 손상시킬 수 있습니다. 마스터링이 완료되면 패치 클램프 기록 중에 biocytin filled cell의 형태학적 회복을 안정적으로 얻을 수 있습니다.

연속 면역염색 기법을 성공적으로 구현하면 데이터 복구의 효율성이 향상되고 표준 패치 클램프 기록 중 신경 세포 특성화가 용이해집니다. 이 동영상을 시청한 후에는 바이오사이틴으로 채워진 세포를 효과적으로 사용하여 신경 형태를 회복하고 신경화학적 마커를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.