Name: 유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: 학습하세요 붉은털원숭이에서 MHC-I 테트라머 염색을 이용한 SIV 특이 CD8+ T 세포 정량화 방법을. 이 기술은 백신 개발 및 HIV 면역학 연구에 필수적인 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

우리는 본 방법의 최적화를 활성화 실험을 지원하기 위해 데이비드 왓킨스에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30AI073961에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 AIDS 연구를위한 마이애미 센터에서 제공하는 파일럿 부여에 의해 부분적으로 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

이 논문에 사용되는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플 위스콘신 국립 영장류 연구 센터 수납 인도 붉은 털 원숭이로부터 수득 하였다. 이 동물은 위스콘신 대학원 동물 관리 및 사용위원회 (33)의 대학에 의해 승인 된 프로토콜에서 Weatherall 보고서에 따라 마음에 든다고했다. 모든 동물 절차는 마취하에 수행 된 모든 활동은 전위의 고통을 최소화 하였다. 1. PKI 치료 참고 : 01 사량 :이 선택하지만, Mamu-B의 * 017을 권장합니다. 결과 및 토론 섹션을 참조하십시오. <ol><li> 1.6 X 107 세포 / ml의 농도에서 R10 배지에서 재현 탁 PBMC. </li><li> 튜브 세포 계측법에 대응하는 흐름이 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. 각 튜브에 PKI의 100 nm의 용액 50 μl를 추가합니다. </li><li> 각 튜브를 소용돌이. 30 분 동안 37 ℃에서 인큐베이션. 이 말까지단계는, 각각의 튜브는 8.0 × 105 PBMC와 50 nM의 PKI를 함유하는 세포 현탁액 100 μl를가한다. </li><li> pMHC-I 사량 염색 단계로 진행합니다. </li></ol> 형광 색소 표지 pMHC-I 테트라 2. 염색 <ol><li> 준비하기 전에 pMHC-I 마스터 믹스, 원심 분리기 4 ° C에서 적어도 15 분 동안 20,000 XG에서 pMHC-I의 사량 관을 사량. 이 단계의 목적은 백그라운드 염색을 높일 수 pMHC-I 테트라 용액에서 단백질 응집체 펠렛이다. 원심 분리 공정이 완료되면, 단백질 응집이 축적된다 튜브의 바닥으로부터 피펫을 피한다. </li><li> 모든 실험 튜브를 염색하기에 충분한 pMHC-I 사량 마스터 믹스를 준비합니다. 오류 검체 계정이 마스터 믹스의 전체 부피의 15 % 초과를 준비한다. </li><li> pMHC-I는 사량 마스터 믹스 25 μL가 adde이라는 것을 얼룩 버퍼 (예를 들어, 화려한 얼룩 버퍼)에 pMHC-I의 사량을하도록 희석각 테스트에 라. <ol><li> 시험 당이 pMHC-I의 테트라 레이블 PBMC; 알로 피코에 접합 한 (APC)와 화려한 바이올렛 (BV) (421)에 다른. </li></ol></li><li> 100 μL의 최종 부피에 튜브 세포 계측법 해당 흐름에 8.0 × 10 5 PBMC를 추가합니다. 세포를 전술 한 PKI 처리가 실시 된 경우, 이들은 이미 단계 100 μL에 재현 탁한다. </li><li> 25 μl를 추가 pMHC-I는 튜브 세포 계측법 해당 흐름에 마스터 믹스를 사량. 이 단계의 마지막으로 각 튜브의 최종 부피는 125 ㎕를해야한다. </li><li> 세포 현탁액을 균질화하기 위해 각 튜브 소용돌이. </li><li> 45 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어. 이 45 분 배양하는 동안 표면 염색 단클론 항체 칵테일을 준비합니다. </li></ol> 3. 표면 얼룩 <ol><li> 모든 실험 튜브를 염색하기에 충분한 단클론 항체 마스터 믹스를 준비합니다. 계정이 마스터 믹스의 전체 부피의 15 % 초과를 준비오류를 피펫 팅합니다. </li><li> 50 μl의 시험에 따라 추가 그래서 얼룩 버퍼 마스터 믹스의 볼륨을 조절합니다. </li><li> 적절한 비 CD8 + T 세포의 배제 및 메모리 서브 세트의 묘사를 들어, 사용하는 표면 염색 마스터 믹스의 다음 분자 대항 모노클로 날 항체의 양을 적정한다. 참고 : CD14 BV (510), CD16 BV (510), CD20 BV (510), CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 및 CCR7 FITC 각 모노클로 날 항체에 결합 된 형광 색소는 참고 자료로 제공됩니다. CD14, CD16 및 CD20에 대한 단클론 항체는 그들이 &quot;덤프&quot;게이트에 포함되기 때문에 같은 형광 색소 (즉, BV 510)에 결합되어 있습니다. </li><li> 표면 얼룩 마스터 믹스에 죽은 세포를 구별하기위한 고칠 수 염료를 포함 [즉, 아민 반응성 염료 (ARD)]. ARD 시약은 &quot;덤프&quot;게이트에 사용 된 것과 유사한 발광 스펙트럼을 가진 형광 색소에 접합되어 있는지 확인합니다. 이 경우, ARD 아쿠아를 사용합니다. </li><li> 50 μl를 추가염색 마스터 믹스 튜브 세포 계측법 해당 흐름에 3.1-3.4에 설명. 이 단계의 마지막으로 각 튜브의 최종 부피는 175 ㎕를해야한다. </li><li> 각 튜브를 소용돌이. 25 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어. </li><li> 세척 완충액으로 세포 (소 혈청 알부민, 0.1 % 및 0.45 g / L NaN3가 함유 PBS 용액)을 씻는다. 주의 : 아 지드 화 나트륨은 독성 물질이다. 미세한 양에 노출되면 증상이 발생할 수 있습니다. 이 실험이 수행되고있는 기관에서 환경 보건 안전 (EHS) 사무실로 지정된 지침에 따라이 물질을 처리합니다. </li><li> 5 분 510 XG에 원심 분리기 튜브. 조심스럽게 별도의 폐기물 용기에 뜨는을 가만히 따르다. 펠렛을 방해하지 않도록해야합니다. 주의 :이 세척 완충액에 아 지드 화 나트륨의 존재에 반응하여 유해 가스 (34)의 형성을 초래할 수있는 표백제를 함유 공기통로 세척 완충액 상등액 캔트되지 않는다. 기음이 실험은 아 지드 화 나트륨을 처리하는 방법에 대한 지침은 수행되고있는 기관에서 EHS 사무소 콘택트에. </li><li> 경사 분리 후에, 각 튜브에 유지 된 액체에 남아있는 세포를 소용돌이. </li></ol> 4. 셀 고정 <ol><li> 세포를 해결하기 위해 모든 튜브에 2 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액 250 μl를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성 물질이다. 미세한 양에 노출되면 증상이 발생할 수 있습니다. 이 실험이 수행되고있는 기관에서 EHS 사무소에 의해 지정된 지침에 따라이 물질을 처리합니다. <ol><li> 2 % PFA 용액을 세포에 등장되어야하기 때문에,이 용액을 제조 PBS를 사용한다. 2 % PFA 용액 백 밀리리터 여러 실험에 충분하다. 철저히 즉시 세포 응집체의 형성을 방지하기 위해서 2 % PFA의 첨가 후 모든 튜브 소용돌이. </li></ol></li><li> 20 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에 품어. </li><li> W3.7-3.9 단계를 반복하여 재 셀. 이 단계가 완료되면, 세포를 24-48 시간 동안 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다. Permeabilization 단계로 진행하기 전에 철저하게 튜브를 소용돌이. </li></ol> 세포의 5 Permeabilization <ol><li> permeabilization 버퍼의 500 μl를 추가합니다. 소용돌이 모든 튜브. </li><li> 10 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어. </li><li> 단계 3.7-3.9를 반복하여 세포를 씻으십시오. </li></ol> 6. 세포 내 염색 <ol><li> 모든 실험 튜브를 염색하기에 충분한 단클론 항체 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> PBS를 가진 볼륨 또는 세포 내 단클론 항체 마스터 믹스 50 μL가 테스트에 따라 추가되도록 얼룩 버퍼를 조정합니다. </li><li> 6.1 및 6.2에서 설명하는 단클론 항체 마스터 믹스를 준비하면 CD3 및 GZM B. 모노클로 날 항체에 대해 지시 된 양의 적정 사용 참고 : pMHC-I의 사량에 의해 TCR 참여는 테트라 + CD3 + CD8의 검출을 방해 할 수 CD3의 국제화, + 발생할 수 있습니다T 세포가 항 CD3 단클론 표면 염색 마스터 믹스에 추가되는 경우. 세포가 투과성이 후이 문제를 방지하려면이며,이 단계에서 항 CD3 단클론 항체를 추가합니다. CD3를 PerCP Cy5.5 및 GZM B PE : 각 단클론 항체에 결합 된 형광 색소를 기준으로 나열되어 있습니다. </li><li> 해당 튜브에 단클론 항체 칵테일의 50 μl를 추가합니다. 30 분 동안 실온에서 어둠 속에서 품어. </li><li> 단계 3.7-3.9를 반복하여 세포를 씻으십시오. 튜브는 유세포에서 획득 할 준비가되어있다. </li></ol>

<ol><li>Parham, P. Antigen Recognition by T Lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aParham%2C+P+%22The+Immune+System%2C+3rd+ed%22">The Immune System, 3rd ed</a>. Foltin, J., Masson, S., Ghezzi, K., Engels, A., Lawrence, E., Jeffcock, E. , Garland Science, Taylor & Francis Group, LLC. New York, NY. 125-154 (2009).</li>
<li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tetramer+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The tetramer transformation.</a> J Immunol. 187 (1), 5-6 (2011).</li>
<li>Masopust, D., Vezys, V., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A brief history of CD8 T cells.</a> Eur J Immunol. 37, Suppl 1 103-110 (2007).</li>
<li>Murali-Krishna, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+antigen-specific+CD8+T+cells%3A+a+reevaluation+of+bystander+activation+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection.</a> Immunity. 8 (2), 177-187 (1998).</li>
<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li>
<li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+repertoire%3A+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nat Rev Immunol. 11 (8), 551-558 (2011).</li>
<li>Walker, B., McMichael, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell+response+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">The T-cell response to HIV.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).</li>
<li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD8%2B+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68 (9), 6103-6110 (1994).</li>
<li>Koup, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68 (7), 4650-4655 (1994).</li>
<li>Gray, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+class+I+HLA-restricted+anti-HIV+CD8%2B+T+cells+in+individuals+receiving+highly+active+antiretroviral+therapy+%28HAART%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frequency of class I HLA-restricted anti-HIV CD8+ T cells in individuals receiving highly active antiretroviral therapy (HAART).</a> J Immunol. 162 (3), 1780-1788 (1999).</li>
<li>Papagno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+HIV-+and+CMV-specific+T+cell+responses+in+long-term+HIV+infected+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Comparison between HIV- and CMV-specific T cell responses in long-term HIV infected donors.</a> Clin Exp Immunol. 130 (3), 509-517 (2002).</li>
<li>Spiegel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1-+and+cytomegalovirus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+can+persist+at+high+frequency+for+prolonged+periods+in+the+absence+of+circulating+peripheral+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1- and cytomegalovirus-specific cytotoxic T lymphocytes can persist at high frequency for prolonged periods in the absence of circulating peripheral CD4(+) T cells.</a> J Virol. 74 (2), 1018-1022 (2000).</li>
<li>Loffredo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8%2B+immunodominance+may+influence+the+ability+of+Mamu-B%2A08-positive+macaques+to+naturally+control+simian+immunodeficiency+virus+SIVmac239+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8+ immunodominance may influence the ability of Mamu-B*08-positive macaques to naturally control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication.</a> J Virol. 82 (4), 1723-1738 (2008).</li>
<li>Migueles, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+B%2A5701+is+highly+associated+with+restriction+of+virus+replication+in+a+subgroup+of+HIV-infected+long+term+nonprogressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HLA B*5701 is highly associated with restriction of virus replication in a subgroup of HIV-infected long term nonprogressors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (6), 2709-2714 (2000).</li>
<li>Valentine, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+with+%22escaped%22+virus+variants+impairs+control+of+simian+immunodeficiency+virus+SIVmac239+replication+in+Mamu-B%2A08-positive+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Infection with "escaped" virus variants impairs control of simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication in Mamu-B*08-positive macaques.</a> J Virol. 83 (22), 11514-11527 (2009).</li>
<li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443 (7109), 350-354 (2006).</li>
<li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8%2B+T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat Med. 12 (10), 1198-1202 (2006).</li>
<li>Mudd, P. A., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+animal+models+of+elite+control%3A+windows+on+effective+immune+responses+against+immunodeficiency+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+HIV+AIDS%22%5BJournal%5D)">Understanding animal models of elite control: windows on effective immune responses against immunodeficiency viruses.</a> Curr Opin HIV AIDS. 6 (3), 197-201 (2011).</li>
<li>Valentine, L. E., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+of+studying+T+cell+responses+in+SIV-infected+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relevance of studying T cell responses in SIV-infected rhesus macaques.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 605-611 (2008).</li>
<li>Allen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+peptide+binding+motif+of+a+rhesus+MHC+class+I+molecule+%28Mamu-A%2A01%29+that+binds+an+immunodominant+CTL+epitope+from+simian+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the peptide binding motif of a rhesus MHC class I molecule (Mamu-A*01) that binds an immunodominant CTL epitope from simian immunodeficiency virus.</a> J Immunol. 160 (12), 6062-6071 (1998).</li>
<li>Allen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+lymphocytes+from+simian+immunodeficiency+virus-infected+rhesus+macaques+recognize+14+different+epitopes+bound+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+molecule+mamu-A%2A01%3A+implications+for+vaccine+design+and+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8(+) lymphocytes from simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques recognize 14 different epitopes bound by the major histocompatibility complex class I molecule mamu-A*01: implications for vaccine design and testing.</a> J Virol. 75 (2), 738-749 (2001).</li>
<li>Kaizu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+typing+of+major+histocompatibility+complex+class+I+alleles+in+the+Indian+rhesus+macaque+which+restrict+SIV+CD8%2B+T+cell+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Molecular typing of major histocompatibility complex class I alleles in the Indian rhesus macaque which restrict SIV CD8+ T cell epitopes.</a> Immunogenetics. 59 (9), 693-703 (2007).</li>
<li>Loffredo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+seventeen+new+simian+immunodeficiency+virus-derived+CD8%2B+T+cell+epitopes+restricted+by+the+high+frequency+molecule%2C+Mamu-A%2A02%2C+and+potential+escape+from+CTL+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of seventeen new simian immunodeficiency virus-derived CD8+ T cell epitopes restricted by the high frequency molecule, Mamu-A*02, and potential escape from CTL recognition.</a> J Immunol. 173 (8), 5064-5076 (2004).</li>
<li>Loffredo, J. T., Valentine, L. E., Watkins, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Mamu-A%2A01%2B+Indian+Rhesus+Macaques%3A+Continued+Discovery+of+New+MHC+Class+I+Molecules+that+Bind+Epitopes+from+the+Simian+AIDS+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+mol+immunol%22%5BJournal%5D)">Beyond Mamu-A*01+ Indian Rhesus Macaques: Continued Discovery of New MHC Class I Molecules that Bind Epitopes from the Simian AIDS Viruses.</a> HIV mol immunol. 2007, 29-51 (2006).</li>
<li>Loffredo, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+MHC+class+I+molecules+associated+with+elite+control+of+immunodeficiency+virus+replication%2C+Mamu-B%2A08+and+HLA-B%2A2705%2C+bind+peptides+with+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two MHC class I molecules associated with elite control of immunodeficiency virus replication, Mamu-B*08 and HLA-B*2705, bind peptides with sequence similarity.</a> J Immunol. 182 (12), 7763-7775 (2009).</li>
<li>Mothe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+peptide-binding+specificity+of+Mamu-B%2A17+and+identification+of+Mamu-B%2A17-restricted+epitopes+derived+from+simian+immunodeficiency+virus+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the peptide-binding specificity of Mamu-B*17 and identification of Mamu-B*17-restricted epitopes derived from simian immunodeficiency virus proteins.</a> J Immunol. 169 (1), 210-219 (2002).</li>
<li>Miller, M. D., Yamamoto, H., Hughes, A. L., Watkins, D. I., Letvin, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+an+epitope+and+MHC+class+I+molecule+recognized+by+gag-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+in+SIVmac-infected+rhesus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Definition of an epitope and MHC class I molecule recognized by gag-specific cytotoxic T lymphocytes in SIVmac-infected rhesus monkeys.</a> J Immunol. 147 (1), 320-329 (1991).</li>
<li>Kuroda, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Gag-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+rhesus+monkeys+by+cell+staining+with+a+tetrameric+major+histocompatibility+complex+class+I-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of Gag-specific cytotoxic T lymphocytes in simian immunodeficiency virus-infected rhesus monkeys by cell staining with a tetrameric major histocompatibility complex class I-peptide complex.</a> J Exp Med. 187 (9), 1373-1381 (1998).</li>
<li>Otting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unparalleled+complexity+of+the+MHC+class+I+region+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unparalleled complexity of the MHC class I region in rhesus macaques.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1626-1631 (2005).</li>
<li>Martins, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine-Induced+Simian+Immunodeficiency+Virus-Specific+CD8%2B+T-Cell+Responses+Focused+on+a+Single+Nef+Epitope+Select+for+Escape+Variants+Shortly+after+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaccine-Induced Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T-Cell Responses Focused on a Single Nef Epitope Select for Escape Variants Shortly after Infection.</a> J Virol. 89 (21), 10802-10820 (2015).</li>
<li>Mudd, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine-induced+CD8%2B+T+cells+control+AIDS+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vaccine-induced CD8+ T cells control AIDS virus replication.</a> Nature. 491 (7422), 129-133 (2012).</li>
<li>Lissina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+inhibitors+substantially+improve+the+physical+detection+of+T-cells+with+peptide-MHC+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein kinase inhibitors substantially improve the physical detection of T-cells with peptide-MHC tetramers.</a> J Immunol Methods. 340 (1), 11-24 (2009).</li>
<li>Weatherall, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeatherall%2C+D+%22The+use+of+non-human+primates+in+research.+A+working+group+report%22">The use of non-human primates in research. A working group report</a>. , 152(2006).</li>
<li>Betterton, E. A., Lowry, J., Ingamells, R., Venner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+mechanism+of+the+reaction+of+sodium+azide+with+hypochlorite+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hazard+Mater%22%5BJournal%5D)">Kinetics and mechanism of the reaction of sodium azide with hypochlorite in aqueous solution.</a> J Hazard Mater. 182 (1-3), 716-722 (2010).</li>
<li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li>
<li>Dolton, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+tricks+with+tetramers%3A+a+practical+guide+to+staining+T+cells+with+peptide-MHC+multimers%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">More tricks with tetramers: a practical guide to staining T cells with peptide-MHC multimers.</a> Immunology. 146 (1), 11-22 (2015).</li>
<li>Wooldridge, L., Lissina, A., Cole, D. K., vanden Berg, H. A., Price, D. A., Sewell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricks+with+tetramers%3A+how+to+get+the+most+from+multimeric+peptide-MHC%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC.</a> Immunology. 126 (2), 147-164 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. FACS Analysis of Leukocyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoederer%2C+M+%22Weir%27s+Handbook+of+Experimental+Immunology%2C+5th+ed%22">Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th ed</a>. Herzenberg, L. A., Weir, D. M., Blackwell, C. , Blackwell Science. Boston. 1-49 (1996).</li>
<li>Colantonio, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+polymorphisms+modulate+peptide-dependent+binding+to+an+MHC+class+I+ligand+with+a+Bw6+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">KIR polymorphisms modulate peptide-dependent binding to an MHC class I ligand with a Bw6 motif.</a> PLoS Pathog. 7 (3), e1001316(2011).</li>
<li>Schafer, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+a+Natural+Killer+Cell+Response+by+Simian+Immunodeficiency+Virus+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Suppression of a Natural Killer Cell Response by Simian Immunodeficiency Virus Peptides.</a> PLoS Pathog. 11 (9), 1005145(2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 절차 매력 토론에서 몇 단계는 최적의 결과를 산출하기위한 중요하다있다. 생물학적 시료의 품질이 어떤 유세포 분석 (38)의 성공 강한 예측이기 때문에 먼저 모든 치료는 세포의 염색 과정 중에 생존 및 정지되도록주의해야한다. 그들은 응집하는 경향이며, 일반적으로 죽은 세포의 높은 숫자를 포함하기 때문에 냉동 보관 샘플로 작업 할 때 특히 관련이있다. 이러한 경우, 이전 pMHC-I 테트라 라벨링 과정에 70 μm의 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 통과하여 실질적으로 결과를 개선 할 수있다. 둘째, 상기 분석에 사용되는 형광 색소의 적절한 보상 여러 매개 변수가 동일한 실험으로 평가되고, 특히, 정확한 데이터 분석을 위해 중요하다. 이러한 점에서, 새로운 단일 색 보정 제어마다 pMHC-I의 테트라 머 (S)를 준비 할 것을 권장분석을 이닝. 우리는 그들의 광범위한 항 IG 반응성들은 양 및 음의 인구 분명 쌍봉 분포를 얻을 수 있다는 사실을 보상 비드의 사용을 선호. 이들 비즈는 MHC-I 분자에 결합...

그들은 종양 면역 감시에 참여하고 세포 내 병원균 1의 퇴치에 기여으로 CD8 + T 세포는 적응 면역 체계의 중요한 구성 요소를 포함한다. 간단히 말해서, CD8 + T 세포는 숙주 세포의 세포막에 존재하는 T 세포의 특이 적 펩티드 - 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I)를 인식 수용체 (TCR도) 분자를 표현한다. 이러한 펩티드는 내생 적으로 합성 된 단백질의 단백질 분해로부터 유도되기 때문에, 세포 표면 pMHC-I 복합체는 세포 내 환경에 창을 제공한다. 바이러스에 감염되면, 예를 들어, 감염된 세포는 CD8 + T 세포를 순찰로 표현 TCR도에 대한 리간드 역할을 할 수 있습니다 바이러스 유래 펩타이드를 포함하는 MHC-I 분자를 표시합니다. 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포가 pMHC-I 리간드를 제시 감염된 세포를 발견 한 경우, TCR 결합은 CD8 + T 세포 활성화 및 발생한다 ULTI후면부로 세포 용해를 대상으로지도한다. CD8 + T 세포 응답의 크기, 특이도, 표현형을 결정,이 TCR / pMHC-I 상호 작용의 중요한 특성을 감안할 때 종종 인간의 질병에 대한 중요한 단서를 공개 할 수 있습니다. 1990 년대 초까지),은 (Ag 관련 CD8 + T 세포의 정량은 기술적으로 까다로운 제한 희석 분석 (LDA) 2,3에 의존했다. LDA 수일 필요 않았다 완료해야 할뿐 아니라 증식 가능성 부족 셀을 검출하지 못했다. 그 결과, LDA는 크게 면역 반응에 참여하는 항원은 (Ag) 특이 적 CD8 + T 세포의 실제 주파수를 낮게. ELISPOT 세포 내 사이토 카인 염색 분석법의 개발이 크게 세포 면역을 측정 할 수있는 능력이 향상되지만, 이러한 방법은 여전히 AG-특정 T 세포 (4)를 정량화 시험 관내 자극 필요. 그것은 1996 알트만 데이비스, 그리고 콜까지되지 않았습니다eagues는 pMHC-I의 테트라 기술 (5)의 개발을보고 자신의 랜드 마크 기사를 발표했다. 이 기술의 성공에 중요하여 유세포 분석법 세척 단계에서 탈락 pMHC-I의 테트라 머의 확률을 감소 TCR / pMHC-I의 상호 작용의 반감기를 연장 pMHC-I 분자의 멀티 머화 하였다. 상기 분석을 통해 pMHC-I의 테트라 머의 주요 장점은 정확하게 관내 재 자극 없이도 직접 생체 AG-특정 CD8 + T 세포를 검출 할 수있는 능력이다. 또한, 멀티 - 컬러 pMHC-I 테트라 머 염색의 조합 계측법 분화 단계, 기억 표현형 및 AG-특정 CD8 + T 세포 2-4의 활성화 상태의 상세한 분석을 허용 한 흐름. 에 의해 CD8 + T 세포 레퍼토리의 특성에 대한 최근의 기술 발전에 비추어 pMHC-I는 응용 프로그램의 폭 FO 6 염색 다량 체R이 방법은 지속적으로 확대 할 전망이다. 생물 의학 연구에서 몇몇 지역은 HIV의 면역학 (7)의 필드보다 pMHC-I 테트라 머 염색에서 더 많은 혜택을. CD8 + T 세포가 일시적으로 알트만 데이비스, 동료 8,9에 의해 게시의 시간에 의해 HIV 바이러스 혈증의 초기 제어와 관련이 있었지만, 계속되는 년 pMHC-I의 사량의 사용은 크게 우리의 이해를 확장 CD8 + T 세포 반응 에이즈 관련. 예를 들어, I-pMHC 테트라 머 염색은 대부분의 HIV 감염자 10-12에서 바이러스 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 강력한 크기를 확인 도왔다. 이 방법은 &quot;엘리트 제어&quot;로 알려진 항 레트로 바이러스 요법 - 현상의 부재하에 바이러스 복제의 자발적인 제어와 관련된 MHC-I 분자에 의해 제한 HIV- 및 SIV 특이 적 CD8 + T 세포 반응의 특성을 용이 <suP&gt; 13-15. 또한, pMHC-I의 사량이 조절되지 않는 만성 감염 HIV 관련 CD8 + T 세포의 기능 장애 표현형에 대한 가역 경로로 프로그램 된 죽음 1 (PD-1) / PD 리간드 1 (PD-L1) 축 설정에 쓸모 있었다 16, 17. 종합적으로, 이러한 연구는 AIDS 바이러스를 CD8 + T 세포 반응을 모니터링 pMHC-I의 테트라 머의 유용성을 강조한다. 붉은 털 원숭이 원숭이 (Macaca의 mulatta)의 실험 SIV 감염은 HIV / AIDS (18, 19)에 대해 면역 개입을 평가하는 가장 좋은 동물 모델 남아있다. 지난 25 년 동안 상당한 진보는 MHC-I 대립 유전자의 발견과 펩티드 결합 모티프 13,20-27를 정의를 포함하여,이 원숭이 종의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 식별 및 특성 이루어진 것으로 . 그 결과, pMHC-I의 사량은 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 분석을 위해 개발되어왔다이 동물 모델 (28)에 응답. Mamu-A1 * 002, Mamu-A1 * 001 : 01, Mamu-B의 * 008 :이 시약의 대부분은 네 개의 붉은 털 원숭이 MHC-I 대립 유전자의 유전자 산물 만들어진 01, 및 Mamu-B * 017 : 01. 참고로, 붉은 털 원숭이는 MHC-C의 궤적 (29)을 표현하지 않습니다. 본 실험에 사용 된 pMHC-I의 사량의 대부분은에 모리 대학에서 NIH 테트라 머 핵심 시설에서 생산되었다. 그럼에도 불구하고, 면역 개그 CM9 에피토프에 결합 Mamu-A1 * 001 사량을 포함하여 이러한 시약 중 일부는, 오직 인해 라이선스 계약에 상용 소스에서 얻을 수 있습니다. 네 개의 붉은 털 원숭이의 대립 유전자의 사용 pMHC-I의 테트라 우리는 성공적으로 예방 접종 또는 기본 SIV 감염 30, 31 (마틴 등등에 의해 유도 된 21 SIV 항원 결정기 (표 1)의 총에 CD8 + T 세포를 열거 한 위 알., 게시되지 않은 관찰). 본 원고는 제공붉은 털 원숭이의 SIV 특이 적 CD8 + T 세포의 빈도 및 메모리 표현형을 결정하기위한 최적화 pMHC-I 테트라 머 염색 프로토콜. TCR 내재화를 감소시켜 pMHC I-32 염색 테트라을 향상시키기 위해 상기 분석은 단백질 키나아제 억제제 (여기서, 프라이 셀이 사용되는 PKI)와 선택적인 30 분 동안 배양으로 시작한다. 사량 01 : 후술하는 바와 같이 Mamu-B의 *를 017을 사용할 때,이 처리에 특히 유용하다. Fluorochrome과 접합 pMHC-I의 사량과 단일 클론 항체 (단클론 항체)와 세포를 레이블하는 방법에 대한 지침도 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 세포 용해 - 관련 분자 그랜 자임 B (GZM B)의 세포 검출 용 셀 permeabilization 단계를 포함한다. CD3에 대한 단클론 항체는이 TCR 신호 전달 분자의 검출을 향상시킬뿐만 아니라,이 단계에서 첨가된다. 참고로,이 염색 패널에 사용 된 모든 형광 색소가 나열됩니다.

<table><tbody><tr><td>다사티닙</td><td>축삭돌기 메드켐</td><td>축삭돌기&nbsp; 1392</td><td>DMSO에 재현탁하고 즉시 -20°C에 보관해야 합니다. C</td></tr><tr><td>RPMI w/ Glutamax</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>반드시 4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>4°C에서 보관해야 합니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신프-암포테리신 B</td><td>론자</td><td>17-745E</td><td>반드시 4°C에서 보관해야 합니다. 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO, 무수</td><td>생명 기술</td><td>D12345</td><td>실온에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>5ml 둥근 바닥 폴리프로필렌 튜브</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>형광 색소 공액 pMHC-I 사량체</td><td>NIH 사합체 코어 또는 MBL, Inc.</td><td></td><td>사용하기 전에 &nbsp; 4 &deg;C. 원심분리기에서 20,000 x g에서 15분 동안 보관 및 유지 관리해야 합니다. 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>형광색소 접합 mAbs</td><td>다양한 회사는</td><td></td><td>&nbsp; 4°C에서 보관 및 유지 관리되어야 합니다. 얼리지 마십시오.</td></tr><tr><td>라이브/데드&nbsp; 고정식 아쿠아&nbsp; 죽은&nbsp; Cell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>-20 &deg;C에서 보관해야 합니다. 각 부분 표본을 50 &mu; l 사용하기 전에 DMSO의.</td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>반드시 보관해야 합니다&nbsp; 4도; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>알부민 소</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>반드시 보관 위치: 4 &deg; 씨&nbsp;</td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>실온에서 보관하십시오. 독성 물질. 표백제와 혼합하지 마십시오.</td></tr><tr><td>표백제</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>부식성 화학 물질은 아지드 화나트륨과 혼합 할 수 없습니다. </td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15714-S</td><td>가연성, 부식성 및 독성 시약을 주의해서 다루십시오. 주의해서 다루세요</td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>투과화 용액 2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>독성 및 부식성 시약. 조심히 다루세요</td></tr><tr><td>Sarsdet Tubes 1.5 ml 나사형 상단</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml DNA/RNA Low bind Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td>Sterile microtubes의 사용이 선호됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>과학자</td><td></td><td></td>의 재량에 따라</tr><tr><td>Biosafety Cabinet&nbsp;</td>과학자<td></td><td></td><td>의 재량에 따라</td></tr><tr><td>Milli Q Intergral 정수 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td><td>모든 공급자의 분자 생물학 등급 물을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>과학자</td><td></td><td></td>의 재량에</tr><tr><td>따라 원심분리기</td><td>과학자</td><td></td><td></td>의 재량에 4</tr><tr><td>&deg; 씨&nbsp; 냉장고</td><td>과학자</td><td></td><td></td>의 재량에 따라</tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석기에는 사용된 염색 패널과 호환되는 레이저와 필터가 포함되어야 합니다.</td></tr><tr><td>탈 이온수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td>는 <td>37 &deg를 유지할 수 있어야 합니다. 씨&nbsp; 내부 온도</td></tr><tr><td>FACS Diva 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo 소프트웨어 버전 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>FACS Diva 소프트웨어에서 생성된 FCS 파일을 분석하는 데 사용</td></tr><tr><td>Micropippette 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 cd8 분석 + 펩티드 - mhc-i 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 t 세포

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

펩타이드 - 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I (pMHC-I) 테트라는 CD8 + T 세포 반응을 연구하는 귀중한 도구가되고있다. 이러한 시약 직접 CD8 + T 림프구의 표면 상에 T 세포 수용체에 결합하므로, 형광 표지 pMHC-I의 테트라 항원의 정확한 검출은 (Ag) 시험관을 다시 할 필요없이 특이 적 CD8 + T 세포를 활성화 -자극. 유동 세포 계측법 멀티 컬러와 결합 될 때 또한, pMHC-I 테트라 머 염색은 분화 단계, 메모리 표현형 및 활성화 상태를 포함 AG-특정 CD8 + T 세포의 주요 측면을 공개 할 수 있습니다. CD8 + T 세포는 AIDS까지의 진행에 영향을 미칠 수있는 이런 종류의 분석은 HIV 면역학 분야에서 특히 유용왔다. 유인원 면역 결핍 바이러스와 붉은 털의 원숭이 (SIV)의 실험 감염은 에이즈 바이러스에 대한 세포 성 면역을 연구하는 귀중한 도구를 제공합니다. 그 결과, 상당한 PROGRESS는이 동물 모델에서 T 세포 반응을 정의 및 특징을했다. 여기에서 우리는 pMHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 SIV 특정 CD8 + T 세포를 열거하기위한 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 우리의 분석은 예방 접종 또는 SIV 감염에 의해 발생 SIV 특정 CD8 + T 세포 반응을 추적하는 데 유용 할 수 있습니다 테스트 당이 pMHC-I 사량 + CD8 + T 세포 인구의 동시 정량 및 메모리 표현형을 허용합니다. 생물 의학 연구 비인간 영장류의 관련성을 고려하여, 본 방법은 다수의 질병 설정에서 CD8 + T 세포 반응을 연구에 적용 할 수있다.

여기에 설명 된 프로토콜은 Mamu-A1 * 001 + 붉은 털 원숭이에서 백신 유도 개그 CM9 특정 CD8 + T 세포 반응의 크기와 메모리 표현형을 결정하는 데 사용되었다. 이 분석 들어, APC 공역 Mamu-A1 * 001 / 개그 CM9 량체는 8 색 유세포 염색 패널에 사용 하였다. 도 1a는 - F는 각 시험에서 본 양 사량 적용되어야하는 데이터를 분석하는 데 사용 게이팅 전략을 보여준다. pMHC-I 테트라 + CD8 + T 세포 인구가 아니라 최소한의 배경 (그림 1 층과 G)로 구분되어 있습니다. (; CD28 + CCR7 + T CM), 전이 메모리 (T EM1; CD28 + CCR7-) 및 효과기 중앙 메모리 : 붉은 털 원숭이 메모...

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

이 분석의 전반적인 목표는 백신 접종 또는 1차 감염에 의해 생성된 Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8 양성 T 세포 집단을 열거하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 백신 접종 또는 감염에 의해 유도된 항원 특이적 CD8 T 세포의 빈도와 같은 T 세포 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 재자극 없이 생체 외에서 직접 얻은 생물학적 샘플에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 정량화할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 붉은털 원숭이의 절개 특이적 CD8 T 세포를 평가하고 여러 질병 환경에서 CDB T 세포 반응을 연구하는 데까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 붉은털 원숭이 MHC 유전학에 대한 지식이 불완전하고 유세포 분석 염색에 정확한 항체 적용이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. R10 배지에서 rhesus PBMC를 다시 현탁하여 시작합니다.1.6 곱하기 10을 밀리리터당 7번째 세포 농도에 추가합니다. 50마이크로리터의 세포를 적절한 수의 유세포분석 튜브에 분취하고 각 튜브에 50마이크로리터의 단백질 키나아제 억제제를 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이치고 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.적정 펩타이드 MHC 사합체의 정확한 양은 모든 실험용 튜브를 염색할 수 있을 만큼 충분한 마스터 믹스에 희석되어야 합니다. 따라서 피펫팅 오류를 설명하기 위해 15% 이상의 마스터 믹스를 준비하는 것이 중요합니다. 세포가 배양하는 동안 원심분리를 통해 tetramer 용액의 단백질 응집체를 펠렛화하여 배경 염색을 최소화합니다.다음으로, 25마이크로리터의 사합체 마스터 믹스를 각 유세포 분석 튜브에 추가할 수 있도록 충분한 염색 완충액에 사량체를 희석합니다. 그런 다음 샘플 튜브를 와류로 가열하고 PBMC 사합체 용액을 어두운 곳에서 실온에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 50마이크로리터의 염색 마스터 믹스를 적절한 샘플 튜브에 추가합니다.그리고 와류를 위해 튜브를 혼합하십시오. 실온에서 어둠 속에서 25분 후 세척 버퍼로 세포를 세척하고 원심분리로 세포를 펠릿화한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 각 튜브에 남은 완충액의 세포를 와류로 가열하고 튜브당 250마이크로리터의 2%파라포름알데히드로 샘플을 고정합니다.즉시 소용돌이치고 섭씨 4도의 어

analysis-simian-immunodeficiency-virus-specific-cd8-t-cells-rhesus

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

우리는 총뿐만 아니라 붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 CD4 +와 CD8 + T 세포, HIV / AIDS 백신 연구를위한 이상적인 모델의 메모리 하위 집합에 대한 자세한 phenotypic와 기능 특성에 대한 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 유틸리티를 보여줍니다.

붉은 털원숭이 짧은 꼬리 원숭이의 세포 면역 반응의 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법의 분석

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를...

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

이 비디오는 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(pMHC-I) 사량체를 사용하여 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)에 특이적인 CD8+ 메모리 T 세포를 특성화하는 방법을 보여줍니다. pMHC-I 사량체는 SIV 특이적 펩타이드에 결합하고 형광단에 접합된 4개의 MHC-I 분자의 복합체입니다. 이러한 사량체는 SIV 특이적 CD8+ T 세포의 T 세포 수용체(TCR)에 선택적으로 결합하여 이러한 세포의 특성화를 용이하게 합니다.

SIV 특이적 CD8+ 기억 T 세포를 분석하기 위한 펩타이드-MHC-I 테트라머 염색 기법

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

설명한 quantitate 96 유전자의 표현 하는 방법론 이며 단일 셀 전 비보, 차동의 식별을 위해 허용 하 여 18 표면 단백질 유전자와 감염 되지 않은 세포에 상대적으로 바이러스에 감염 된 세포에 있는 단백질을 표현. 우리는 접근 연구 SIV에 감염 된 CD4+ T 적용 붉은 털 원숭이에서 분리 하는 세포.

단일 셀 정량 mRNA와 유인원 면역 결핍 바이러스에 감염 된 CD4에 표면 단백질 표정+ T 세포 격리에서 붉은 털 원숭이

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

학습하세요 붉은털원숭이에서 MHC-I 테트라머 염색을 이용한 SIV 특이 CD8+ T 세포 정량화 방법을. 이 기술은 백신 개발 및 HIV 면역학 연구에 필수적인 도구입니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석⁺ 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

더 많은 동영상 탐색