유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 ⁺ 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

이 분석의 전반적인 목표는 백신 접종 또는 1차 감염에 의해 생성된 Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8 양성 T 세포 집단을 열거하고 특성화하는 것입니다. 이 방법은 백신 접종 또는 감염에 의해 유도된 항원 특이적 CD8 T 세포의 빈도와 같은 T 세포 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 시험관 내 재자극 없이 생체 외에서 직접 얻은 생물학적 샘플에서 항원 특이적 CD8 T 세포를 정량화할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 붉은털 원숭이의 절개 특이적 CD8 T 세포를 평가하고 여러 질병 환경에서 CDB T 세포 반응을 연구하는 데까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 붉은털 원숭이 MHC 유전학에 대한 지식이 불완전하고 유세포 분석 염색에 정확한 항체 적용이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. R10 배지에서 rhesus PBMC를 다시 현탁하여 시작합니다.

1.6 곱하기 10을 밀리리터당 7번째 세포 농도에 추가합니다. 50마이크로리터의 세포를 적절한 수의 유세포분석 튜브에 분취하고 각 튜브에 50마이크로리터의 단백질 키나아제 억제제를 추가합니다. 각 튜브를 소용돌이치고 섭씨 37도에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.

적정 펩타이드 MHC 사합체의 정확한 양은 모든 실험용 튜브를 염색할 수 있을 만큼 충분한 마스터 믹스에 희석되어야 합니다. 따라서 피펫팅 오류를 설명하기 위해 15% 이상의 마스터 믹스를 준비하는 것이 중요합니다. 세포가 배양하는 동안 원심분리를 통해 tetramer 용액의 단백질 응집체를 펠렛화하여 배경 염색을 최소화합니다.

다음으로, 25마이크로리터의 사합체 마스터 믹스를 각 유세포 분석 튜브에 추가할 수 있도록 충분한 염색 완충액에 사량체를 희석합니다. 그런 다음 샘플 튜브를 와류로 가열하고 PBMC 사합체 용액을 어두운 곳에서 실온에서 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 50마이크로리터의 염색 마스터 믹스를 적절한 샘플 튜브에 추가합니다.

그리고 와류를 위해 튜브를 혼합하십시오. 실온에서 어둠 속에서 25분 후 세척 버퍼로 세포를 세척하고 원심분리로 세포를 펠릿화한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 각 튜브에 남은 완충액의 세포를 와류로 가열하고 튜브당 250마이크로리터의 2%파라포름알데히드로 샘플을 고정합니다.

즉시 소용돌이치고 섭씨 4도의 어둠 속에서 튜브를 배양합니다. 20분 후, 신선한 세척 버퍼로 세포를 세척하십시오. 원심분리로 세포를 펠렛화하고 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 기울입니다.

500마이크로리터의 투과화 완충액, 와류에 세포를 다시 현탁시키고 어둠 속에서 10분 동안 실온에서 배양합니다. 그런 다음 세포를 씻고 펠릿화하십시오. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 상등액을 디캔팅합니다.

50마이크로리터의 세포 내 염색 마스터 믹스를 적절한 튜브에 추가합니다. 각 샘플을 소용돌이치고 실온에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 세포를 씻고 펠릿화하십시오.

이제 샘플을 유세포 분석기에서 획득할 준비가 되었습니다. Mamu-B017.01 사량체는 일반적으로 희미한 염색을 생성하며, 이는 단백질 키나아제 억제제로 세포를 전처리하여 크게 개선할 수 있습니다. 배경 염색을 피하기 위해, 관심 항원 특이적 CD8 양성 T 세포 집단을 포함하거나 포함하지 않는 MHC 클래스 1 일치 세포에 관련 사량체 및 다중 희석액을 표시하여 사량체 양성 및 음성 CD8 양성 T 세포 간의 최상의 분리를 초래하는 최적의 양을 결정해야 합니다.

이 그래프에서는 Mamu-A 01 양성 붉은털원숭이에서 백신 유도 Gag CM9 특이적 CD8 양성 T 세포 반응의 크기 및 기억 표현형을 분석하는 데 사용되는 게이팅 전략을 보여줍니다. tetramer positive CD8 positive T cell population은 background staining을 최소화하여 잘 분리되어 있습니다. 그리고 메모리 하위 집합은 tetramer gate 내에서 CD28, CCR7 및 Granzyme B 발현으로 명확하게 설명됩니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 각 항체 또는 사합체 마스터 믹스에 올바른 시약을 추가하고 입증된 대로 매번 실험용 튜브로 작업해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 항원 특이적 CD8 T 세포의 특이성과 표현형을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 인간 HIV-1 AIDS 연구의 붉은털 원숭이 모델 분석에서 MHC 클래스 1 사량체 염색을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 붉은털원숭이의 생물학적 표본으로 작업하려면 검체 처리 중에 적절한 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 특별한 예방 조치가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.