Name: 습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 배우세요 대형 코일 코일 단백질 결정화를 위한 생화학적 및 계산적 분석 통합 프레임워크입니다. 이 방법은 도메인 경계를 신속하게 식별하고 결정화 성공 가능성을 높여 구조생물학 연구자들에게 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작업은 NIH R01 GM097204(APV 및 JDH) 보조금의 지원을 받았습니다. JHM에 대한 자금은 HHMI 학부 연구 여름 펠로우십에서 제공했습니다.

참고 : 개념적 프레임 워크 또는 워크 플로의도는 참조 용으로 그림 1에 설명되어 있습니다. 연산 또는 시퀀스 기반 예측, 단백질 발현과 정제, 생화학 적 특성 및 결정화 : 프로토콜은 네 개의 단계로 나눌 수있다. 도시 된 예는 Shroom SD2 도메인 및 / 또는 Shroom 록 착물을 분석하지만 어떤 단백질과 이용 될 수있다. 1. 코일 코일 도메인 경계의 전산 예측을 생성하는 웹 기반 도구를 설립 <ol><li> 순서 동족체의 진화 다양한 세트를 수집합니다. <ol><li> www.uniprot.org로 이동하여 상단 검색 창에 Shroom를 입력합니다. </li><li> 선택 순서는 옆 가입 번호에 체크 박스를 선택하여 다운로드합니다. 스타와 함께 시퀀스는 Uniprot 검토 시퀀스를 나타내며, 일반적으로 더 신뢰할 수 있습니다. 모든 순서가 완전하고 정확하도록주의하십시오. </li><li> 선택의 절감다운로드 버튼을 클릭하여 equences. </li><li> 그 Clustal-오메가 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 Shroom 시퀀스의 컬렉션을 맞 춥니 다. 제출 밀어 다음 Shroom의 시퀀스 파일을 선택하려면 &quot;찾아보기&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 정렬이 완료되면 &quot;정렬 파일 다운로드&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> (파일에서 | | 입력 정렬 파일) Jalview를 사용하여 1.1.5에서 발생하는 여러 서열 정렬을 엽니 다. (| 퍼센트 아이덴티티 컬러) 신분으로 새로운 정렬 창, 색상 내에서. </li></ol></li><li> 이차 구조 예측, 유연한 또는 무질서 시퀀스의 예측을 계산하고, 관심있는 단백질 (들) 내에서 코일 코일 영역을 예측했다. <ol><li> 코일 - 코일 예측을 계산하기 위해, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi로 이동합니다. 복사 시퀀스 상자에 순서를 붙여 넣기하고 제출을 클릭합니다. 참고 :이 분석은 COMP하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다LETE. Shroom 서열이 상당히 크기 때문에 상기 서열은 웹 서버의 크기 제한에 맞도록 1,000 미만 아미노산의 블록으로 분할 될 필요가있다. Shrm2를 분석 할 때,이 부분은 코일 - 코일 영역을 포함하는 공지 된 SHRM SD2 도메인을 포함 같이 1000 C 말단 아미노산을 사용하는 것이 권장된다. 다른 단백질이 분석을 반복 할 때, 가능한 경우 전장 단백질 서열을 사용하도록 권장한다. 그 옵션을 선택하지 않으면, 공지 된 생화학 적 또는 기능적 데이터에 기초하여 시퀀스를 가능한 가장 큰 단편을 사용하거나 해부. </li><li> 코일 - 코일 예측을 계산하기 위해, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi로 이동합니다. 복사 시퀀스 상자에 순서를 붙여 넣기하고 제출을 클릭합니다. </li></ol></li><li> Shroom 시퀀스의 하나의 포괄적 인 주석으로 1.2.2에 단계 1.1의 결과를 결합합니다. 참고 : 매우 또한 어떤 및 모든 관련 전을 포함하도록 권장된다nformation이는 문헌 또는이 단계에서 단백질의 기능 또는 정제에 대한 다른 소스에서 얻을 수있다. </li><li> 이 포괄적 인 주석 시퀀스를 이용하여, 보존을 극대화하려는 단백질의 도메인 경계 (또는 가능한 경계가 일련의) 예측 무질서 또는가요 서열의 양을 최소화하면서 구조적 특징을 예측 하였다. 공지 된 경우, 생성 된 단백질은 관심의 기능 특성을 보유한다. </li></ol> 제 1 절에서 확인 된 도메인 경계 2. Express 및 Purify는 단백질 주 :이 구역의 목적은 제 1 항에서 생성 된 가상 도메인 경계를 선별 신속하고 용이하게 정량 분석의 시리즈를 사용하는 것이다. <ol><li> 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 상기 열 그의 -mRuby2-XH2 플라스미드 내의 프레임에 원하는 코딩 서열을 갖는 발현 플라스미드를 생성 (벡터 맵 A의도 3 참조차 추가 세부 사항). </li><li> 18-24 시간 동안 실온에서 autoinduction 매체 1 BL21 (DE3) 대장균 또는 다른 적합한 발현 균주를 사용하여 각각의 발현 플라스미드의 테스트 발현 수준. <ol><li> 예컨대 여기 온 (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial 같은 세포와 함께 또는 강력한 변환 프로토콜을 사용하여 지시 다음 발현 플라스미드뿐만 아니라, BL21 (DE3)에 빈 플라스미드 제어 변환 -변환/). </li><li> 새롭게 변형 플레이트에서 하나의 식민지를 선택하고 34 μg의가 / ㎖ 카나마이신과 하룻밤 원성 국물에서 37 ° C (LB) 미디어에서 5 ml의 스타터 문화를 성장. </li><li> 다음 날, 문화 펠렛 신선한 (LB)와 펠렛을 씻어 </li><li> 34 μg의 / ㎖ 카나마이신과 autoinduction 미디어 50ml로 한 스타터 문화를 추가합니다. 문화가 실내 온도 37 ° C의 하나에 포화로 성장 할 수 있습니다. 일반적으로 18 ~ 24 시간 ~에 대한 성장한다. </li><li> 펠렛의 세포s와 정제에 무기한 전에 -80 ° C에서 생성 된 세포 펠렛을 동결. </li><li> 가장 효율적으로 원하는 융합 단백질을 생산하는 균주를 결정하기 위해 각 식의 변형 및 SDS-PAGE에 의해 빈 벡터 제어에서 전체 세포 추출물을 비교합니다. 그의 열 -mRuby2-Shroom SD2 융합 단백질의 경우, 50 분 ~ 나 염료 프론트 겔 (22)의 하단에 도달 할 때까지 180 V에서 10 % SDS-PAGE 젤을 실행. </li><li> 쿠마 블루와 얼룩 젤은 각 균주 (23) 내 총 세포 단백질을 시각화합니다. </li></ol></li><li> 성공적으로 mRuby2 융합 단백질을 발현 각 변형에 대한 초기 친 화성 크로마토 그래피 단계를 수행합니다. 일반적으로 단백질은 4 ℃에서 정제로 변경된 조건에서 혜택을하지 않는 정제, 실온에서 2.3.2-2.3.7 단계를 수행합니다. <ol><li> 단계 2.2.5에서 해동 세포 펠렛. </li><li> 용해 완충액 (10 % 글리세롤, 500 mM의 염화나트륨, 40 ml의 1.5 각 세포 펠렛을 재현 탁mM의 이미 다졸, 20 mM 트리스 pH8.0, 1 mM의 베타 - 머 캅토 에탄올). 적절한 프로테아제 억제제로 세포 용해 완충액을 보완. </li><li> 10 ㎎ / ㎖의 리소자임 30 μl를 첨가하고 20 분 동안 실온에서 배양한다. 악기에 대한 지침을 다음 초음파 처리가 사용된다. </li><li> 불용성 물질 또는 unlysed 세포를 펠렛 14,000 XG에 30 분 동안 테이블 위에 원심 분리기에서 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 전송합니다. SDS-PAGE를 통해 후속 분석을위한 뜨는 및 펠렛을 모두 저장합니다. </li><li> 니켈 NTA 구슬 100 ㎕와 가용성 분획을 배양, 니켈 친 화성 정제를 수행합니다. 비드 믹스 수회 반전 5-10 분 동안 수용성 분해물과 비드 인큐베이션. </li><li> 구슬을 펠렛 탁상 원심 분리기에서 30 초 동안 800 XG에 원심 분리기. 비 특정 오염 물질을 청소 용해 버퍼와 펠렛을 3-5 회 세척하여이 작업을 수행합니다. </li><li> 용해 완충액으로 비드로부터 용출 루비 융합 단백질 일 보충M 이미 다졸. </li><li> 위의 &quot;신속하고 더러운&quot;정제 그의-mRuby2 - Shroom 단백질의 동작을 비교 SDS-PAGE를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 특성화 단백질 샘플 유리한 속성을 가진 사람들을 식별하는 <ol><li> 루비 융합 단백질의 농도를 측정 한 후, 천연 PAGE 겔 (24) 상에 융합 단백질의 1-5 μg의 로딩하여 샘플의 균질성을 평가하기 위해 280 nm에서 분광 광도계 세트를 사용. 175 V.에서 140 분 동안 4 ° C에서 10 % 기본 PAGE 젤을 실행 <ol><li> 이미지 mRuby - 태그 융합이 분석에서 마이그레이션하는 경우 관찰, 형광 시각화 장착 이미 저를 사용하여 원시 PAGE. 참고 :이 단백질이 가능성이 집계 아니라에 붙어 융합 단백질을 관찰하기 위해주의해야합니다. 형광 화상 카메라를 사용할 수없는 경우, 하나는 종종 시각화 할 수 있습니다 루비의 이미지 농축 샘플은 검은 빛 아래 또는 자외선 상자 단백질 태그. </li></ol></li><li> 안정적으로 접힌 도메인을 식별하기 위해 제한된 단백질 분해를 수행합니다. 0.025 %의 서브 틸리 A의 5 μL와 / ~ 1 밀리그램에서 ml에 루비 SHRM SD2 융합의 95 μl를 품다 <ol><li> 의 시점에서, 반응 샘플을 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 및 120 분, 각 시점에 대한 반응을 10 μl를 제거하고, 15 % 아크릴 아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 반응의 진행을 시각화 . </li><li> 단계 2.2.7에서와 같이 쿠마 블루로 염색하고, 단백질 분해 효소 저항성 종을 식별 할 수 있는지 여부를 평가합니다. </li></ol></li><li> 용액에서 이들 단백질의 전체적인 동작의 종합 평가로 부분 정제 mRuby2-Shroom 융합 단백질의 정제 효율 동작 천연 PAGE에서 제한된 단백질 분해 데이터를 통합. <ol><li> 적절한 기능 분석을 사용할 수있는 경우 (선택 사항),이 시점에서 활동을 확인합니다. </li></ol></li></ol> 4. 코일 코일 SD2의 높은 품질 크리스탈을 생산Shroom에서 도메인 주 : 단백질이 일반적으로 상이한 온도에서 정제로부터 4 ° C 유익하지 않는 한 4.1 내의 모든 단계가 실온에서 수행된다. <ol><li> 발현 및 정제 잠재력의 대략적인 추정치로 50 ml의 성장을 사용하여 완전히 정제 된 시료의 5 ~ 20 mg의 달성을 목표로 mRuby2 - Shroom SD2의 대규모 식을 수행합니다. 일반적으로 배양이 L은 적절한 출발 물질을 제공한다. 10 분 동안 8,000 XG에 원심 분리하여 성장 펠렛 세포 후. <ol><li> 용해에 대한 리소자임을 사용하는 경우, 고정 된 세포 펠렛 그램 당 분해의 1 ~ 2 mL의 사용 이전 용해 완충액에 2 L의 성장 펠렛을 재현 탁. 또한, ~ 8 ㎖ / g 펠릿에 재현 탁은 균질 또는 프렌치 프레스를 사용하는 경우. 30 분 동안 30,000 XG에서 원심 분리를 통해 세포 파편 펠렛. </li><li> 일괄 니켈 NTA 수지를 사용하여 10 ㎖ 4.1.1에서 가용성 획분을 결합한다. 적절한 중력 컬럼에 부어언 바운드 단백질이 떨어져 배출 할 수 있습니다. </li><li> 워시 1 M의 NaCl로 보충 된 용해 완충 용액으로 세척 한 다음 용해 완충액 40 ㎖, 3-5 회 수지 등을들 수있다. </li><li> 80 mM의 이미 다졸 보충 용해 완충액 40ml를 씻을 수지. </li><li> 1 M 이미 다졸을 첨가 용해 완충액 40 mL로 루비 Shroom 융합 단백질을 용출시켰다. 수동 4-10 ml의 분획으로 용출 된 단백질을 분별. </li><li> 10 % SDS-PAGE를 사용하여 루비 Shroom 융합 단백질을 포함하는 분획을 확인합니다. </li><li> 8 % 글리세롤, 250 mM의 염화나트륨, 15 mM의 이미 다졸, 20 mM 트리스 pH8.0로 (일반적으로 2-4 분수) 적절한 분획을 투석, 1 MM의 β-ME, 6-8 kDa의 MWCO 투석 튜브를 사용하여. 융합 단백질의 모든 25 ~ 50 mg을위한 TEV 단백질 분해 효소의 1 밀리그램을 추가합니다. 천천히 교반하면서 실온에서 밤새 투석. </li><li> 반복 니켈 친 화성 정화는 4.1.2 단계를 반복합니다. 4.1.6합니다. 그분의 10 -mRuby2가 결합 상태로 유지됩니다 동안 Shroom SD2 도메인은 이제 언 바운드 분수에 남아 있어야수지와는 용출 분획에서 발견 될 것이다. 쿠마 파란색이 사용하는 12 % SDS-PAGE의 얼룩을 확인합니다. </li><li> 8 % 글리세롤, 100 mM의 염화나트륨, 5 mM의 베타 - 머 캅토 에탄올 버퍼 밤새 20 mM 트리스 pH를 8.0로 Shroom SD2 도메인을 함유하는 분획을 투석. </li><li> FPLC를 사용하여 음이온 교환 크로마토 그래피 (25)를 수행하고, 0.1 ~ 1.0 M의 NaCl에서의 NaCl 구배로 용출. 12 % SDS-PAGE를 사용하여 분수를 분석합니다. </li><li> 스핀 농축하여 (10 kDa의의 MWCO 또는 더 큰 단백질이 연구되고있다)에 따라, 12 % SDS-PAGE를 통해 피크 분획을 분석 ~ 0 ㎎ / ㎖ 후 크기 배제 크로마토 그래피 (26)을 수행하는 피크 분획을 농축시켰다. </li><li> 풀 피크 분획 및 20 mM 트리스 pH를 8.0의 50 mM의 NaCl, 2 % 글리세롤로 투석 한 MM의 β-ME 및 / ㎖ 종래 결정화는 10 mg의 농축시킨다. 선택 :이 단계의 농도로 5 μl의 샘플을 제거 1, 2, 5 및 10 ㎎ / ㎖ 시료 농축 과정 중에.이 단계에서 샘플의 행동을보고 각 샘플의 기본 페이지 로딩 2-5 μl를 실행합니다. </li></ol></li><li> 결정화 실험을위한 최적의 단백질 농도를 식별하기 위해 12의 조건의 작은 배열을 화면. 이러한 조건의 조성은도 7에 기재되어있다. <ol><li> 기상 확산법, 피펫을 이용하여 결정화 실험을 수행, 24- 웰 앉아 드롭 결정화 트레이를 사용하여 초기에 잘 용액 1 μL와 커버 슬립에 단백질 샘플 1 μl를 포함 방울 이어 별도 웰에 12 조건 각각 500 μL . 이 기술에 대한 추가 정보는 27을 참조하십시오. </li><li> 신속 명확한 테이프로 트레이를 밀봉 및 진동 무료 적당한 온도 제어 된 환경에 트레이를 이동합니다. 다를 수 있습니다 사용 온도,하지만 4 °의 C, 16 ° C, 20 ° C는 매우 일반적이다. </li><li> 다음 3 일 동안 트레이에 방울을 검사100X 배율까지에서 현미경을 사용하여 AYS. 3 일 기간의 말기에, 석출 (투명한) 광 침전, 호우 (브라운), 또는 결정을 포함하지 않는 각 드롭 점수. 적절한 단백질 농도 이하 6 무거운 강수량이 포함되어야합니다. </li><li> 4.2에 명시된 단백질 농도를 사용하여, 시판의 결정화 스크린 다양한 화면. 또한 상품의 에러를 최소화하는 동안, 액체 핸들링 로봇 또는 결정화의 사용은 크게이 프로세스의 속도. 이것은 사용자가 하나의 샘플을 더 조건을 선별 할 수 있도록, 그리고 훨씬 적은 단백질을 필요로한다. </li><li> 체계적으로 이전 24 잘 선별 트레이를 사용하여 결정화 드롭 내에서 각 변수를 변화시킴으로써 넓은 화면에서 확인 된 초기 조건을 개선합니다. </li></ol></li></ol>

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여기에 설명 된 프로토콜은 사용자가 자신의 결정을 용이하게하기 위해 큰 꼬인 코일 단백질 내에 도메인 경계를 식별 할 수 있도록 설계된다. 프로토콜은 잠재적 도메인 경계의 시리즈를 생성하는 예측 계산 및 다른 소스로부터의 데이터의 다양한 전체적인 결합에 의존한다. 이러한 신속하고 저렴하고, 또한 이러한 초기 가설을 수정하는 데 사용되는 생화학 실험 세트 다음에 있습니다. 이 방법을 사용하여, 사용자는 신속하게 바람직하지 않다 전위 단백질 단편을 제거 할 수 있고 이에 의해 결정을 얻는 전망을 개선 나은 후보에 대한주의를 집중한다. 많은 중요한 단계는 가상 도메인 경계의 초기 세트의 개발과 같은 결정의 제조와 같은 중요한 것도 있지만,이 기술 내에 존재하지 않는다. 이 단계는 정보 OB뿐만 아니라 계산 방법의 다양성을 포함를 사용할 때 문학이나 기능 데이터로부터 tained. 케어는 예측의에 정량적 신뢰 가치를 부여하는 장소에있는 방법은 없기 때문에 &quot;최상&quot;의...

X 선 결정학을 통해 구조 결정은 현대 생물학의 모든 분야에 근본적인 기여를했다; 생활을 지원들이 다양한 상황에서 서로 상호 작용하는 방식 거대 분자의 원자보기를 제공하는 단계; 질병 및 제공하는 기회가 합리적으로 질병을 치료하는 약물을 설계하는 원인이 메커니즘을 이해하기 위해 우리를 허용한다. 결정학 긴 고분자 구조를 결정하는 지배적 인 실험 기술되고, 현재 구조 데이터베이스 (www.rcsb.org)의 89.3 %를 차지 하였다. 이 기술은 매우 높은 해상도의 가능성 등 많은 장점을 가지고하는 크기의 넓은 범위, 상대적으로 쉬운 데이터 수집 및 고분자 용매뿐만 아니라 리간드와 상호 작용하는 방법을 시각화 할 수있는 기회 거대 분자를 시각화 할 수있는 능력. 재조합 단백질 발현 1, 2, 끝까지 마음에있는 수많은 기술 향상에도 불구하고형 치수 (3),이 시스템 (4), 결정 공정에있어서 가장 큰 장애물을 생성하는 데 사용되는 분자 생물학 회절 품질의 결정을 성장할 수있는 능력 남아있다. 이것은 큰 꼬인 코일 도메인을 포함하는 단백질에 대해 특히 사실이었다. 모든 아미노산의 많은 5 % 정도가이 매우 일반적인 구조 기능 칠하고, 코일 - 코일 5,6 내에서 발견되는 것으로 추정, 아직이 단백질은 종종 정화 및 구형 단백질 8-10을보다 구체화하기가 더 어렵되었습니다 . 이는 상기 꼬인 코일 도메인은 종종 따라서 올바르게 종종 결정화 해로운 비정형 또는가요 서열의 포함을 피하기 위하여 중요한 이러한 도메인의 경계를 예측하는 더 큰 단백질의 컨텍스트 내에서 발견 된 사실에 의해 악화된다. 여기에 우리가 결합 개념적 틀을 제시 웹 기반의 계산은 experimenta와 분석구조 연구, 어떻게 준비하고 결정화 시도하기 전에 단백질 시료의 특성을하기위한 단백질 단편 (들)을 선택하는 방법 : 벤치에서 리터 데이터는 결정 과정의 초기 단계를 포함 통해 안내 사용자에게 도움이됩니다. 우리는 큰 코일 코일 도메인을 포함하는 두 단백질에 대한 우리의 분석에 초점을 Shroom (SHRM)과의 Rho 키나제 (바위). 둘은 꼬인 코일 도메인을 포함하고, 생물학적으로 중요한 11-16 착체를 형성하는 것으로 알려진 이러한 단백질을 선택 하였다. Shroom과의 Rho 키나아제 (록)을 각각 권취 코일의 200 ~ 680 잔기를 포함하는 것으로 예상되는 많은 부분이있는 구조적 특징 17-20되었다. 여기에 기재된 방법은 빠르게 결정화 의무가 될 것이다 감긴 코일 함유 단백질의 단편을 확인하는 유선형 흐름을 제공하지만, 기재된 기술은 쉽게 가장 단백질 또는 단백질 복합체하도록 또는 높은 처리량 approa를 통합하도록 변형 될 수있다CHES로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 방법은 일반적으로 저렴하고, 거의 모든 환경 레벨에서 사용자에 의해 수행 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3), Rosetta</td><td>Emd, Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr>, <tr><td>BL21(DE3), Star</td><td>, ThermoFisher, Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr>, <tr><td>BL21(DE3), Codon Plus</td>, <td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Spectrum Chemical, Mfg Corp</td>, <td>L3008-5GM</td><td></td></tr>, <tr><td>Ni-NTA 수지</td><td>, Life Technologies</td><td>, 25216</td><td></td></tr>, <tr><td>SubtilisinA</td><td>스펙트럼 화학 Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 Cryschem Plate</td><td>Hampton 연구</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp; 96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>오버나이트 익스프레스 자동 유도 시스템 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>용해 국물 분말</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

구조 측정을 위해 결정을 얻는 것은 모든 단백질에 대해 어렵고 시간이 많이 걸리는 제안일 수 있습니다. 코일 코일 단백질과 도메인은 자연 전역에서 발견되지만 물리적 특성과 응집 경향으로 인해 전통적으로 결정화가 특히 어려운 것으로 간주되었습니다. 여기에서는 주어진 코일 코일 단백질에 대한 일련의 가능한 도메인 경계를 식별한 다음 용액에서 이러한 단백질의 거동을 신속하게 특성화하도록 설계된 다양하고 빠르고 간단한 기술을 활용합니다. 강한 형광 태그(mRuby2)를 추가하면 단백질 특성 분석이 간단하고 간단합니다. 표적 단백질은 일반 조명에서 쉽게 시각화할 수 있으며 적절한 이미저를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 목표는 성공할 가능성이 낮기 때문에 결정화 파이프라인에서 제거할 수 있는 후보 물질을 신속하게 식별하여 최상의 후보 물질에 더 많은 시간을 할애하고 결정을 생성하지 않는 단백질에 지출되는 자금을 줄이는 것입니다. 이 프로세스는 초기 스크리닝 노력에서 얻은 정보를 통합하기 위해 반복될 수 있고, 고처리량 발현 및 정제 절차에 맞게 조정될 수 있으며, 결정화를 위한 로봇 스크리닝으로 강화될 수 있습니다.

이 시스템에서 이용되는 흐름을 도시 한 도면도 1에 도시 된 세 개의 주요 단계를 포함한다. 시퀀스의 전산 분석은 관심있는 꼬인 코일 단백질의 도메인 경계에 대한 가설을 개발하는데 이용된다. Shrm2 SD2 도메인 주석 분석의 예는도 2에 도시되어있다. 이 도면에서, 목표 Shroom가 SD2라는 골격 레귤레이터의 C 말단에 보존 된 도메인 가능한 도메인 경계를 식별 할 수 있었다. 이 분석에서 가상 도메인 경계의 세 가지 세트의 결정화를위한 최고의 후보로서 끝내 C- 말단 근처 전체 보존 SD2 또는 최소한의 단편에 걸쳐있는 꼬인 코일 조각을 함유하는 생성 된이었다. 시퀀스 분석에서 확인 된 후보자는 신속하게 (그림 3) FO mRuby2와 단백질의 융합을 사용하여 작은 규모에서 테스트효율적인 분석을 r에. 대표적인 소규모 (문화 50 ㎖) 두에서 정제를 그의 10<...

우리는 큰 코일 영역의 특성화 및 결정화를 안내하기 위해 간단한 생화학 및 컴퓨터 분석을 통합한 프레임워크를 설명합니다. 이 프레임워크는 구형 단백질에 맞게 조정하거나 다양한 고처리량 기술을 통합하도록 확장할 수 있습니다.

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

이 절차의 전반적인 목표는 큰 코일 코일 단백질 내에서 가능한 도메인 경계를 신속하게 식별하고 테스트하여 결정화될 고유 단편을 찾을 가능성을 높이는 것입니다. 이 방법은 연구자들이 결정화가 매우 어려울 수 있는 대형 코일 단백질의 결정화 과정을 간소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 실험 방법과 계산 방법을 모두 통합하여 결정화에 대한 가능성 있는 후보를 신속하게 식별하고 선별하여 성공 가능성을 높인다는 것입니다.제 연구실의 대학원생인 Jenna Zalewski와 제 연구실의 학부생 연구원인 Keith O'Conor가 이 기술을 시연할 것입니다. 먼저 설정된 웹 기반 도구의 출력을 결합하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가능한 코일 코일 도메인 경계에 대한 예측을 생성합니다. 발현 플라스미드를 생성하고 텍스트에 자세히 설명된 대로 발현 수준을 테스트한 후, Ruby 태그가 지정된 단백질을 성공적으로 발현한 각 균주의 정제를 시작합니다.세포를 용해시키려면 먼저 프로테아제 억제제가 보충된 1.5ml의 용해 완충액에 해동된 각 세포 펠릿을 재현탁합니다. 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 30마이크로리터의 라이소자임을 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양한 다음 사용 중인 기기의 지침에 따라 초음파 처리합니다. 탁상용 원심분리기에서 14, 000배 G로 30분 동안 샘플을 원심분리하여 불용성 물질 또는 용해되지 않은 세포를 펠릿으로 만듭니다.SDS-PAGE를 통한 후속 분석을 위해 상등액과 펠릿을 모두 보관하십시오. 니켈 친화성 정제를 수행하려면 먼저 100마이크로리터의 니켈 NTA 비드를 5-10분 동안 용해성 용해물과 함께 용해 완충액에서 사전 세척하여 배양합니다. 서스펜션을 여러 번 뒤집어 비드를 혼합합니다.탁상용 원심분리기에서 30초 동안 800배 G로 샘플을 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 그런 다음 용해 완충액으로 펠릿을 3-5회 세척하여 비특이적 오염 물질을 제거합니다. 마지막으로, 용해 완충액으로 비드에서 Ruby 융합 단백질을 용리하고 1개의 몰 이미다졸을 보충합니다.280나노미터로 설정된 분광광도계를 사용하여 Ruby 융합 단백질의 농도를 측정한 다음 1-5마이크로그램의 융합 단백질을 네이티브 PAGE 겔에 로드하여 샘플의 균질성을 평가합니다. 10%native PAGE 젤을 섭씨 4도에서 175볼트에서 140분 동안 실행합니다. 형광을 시각화할 수 있는 장비를 갖춘 이미저를 사용하여 기본 PAGE를 이미지화하고 이 분석에서 Ruby 태그가 지정된 융합이 이동하는 위치를 관찰합니다.먼저 95 마이크로 리터의 Ruby-Shroom SD2 융합을 5 마이크로 리터의 0.025 Subtilisin A.Sample과 함께 배양하여 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 및 120 분의 시점에서 반응을 배양하고 각 시점의 반응에서 10 마이크로 리터를 제거하고 15 % 아크릴 아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 반응의 진행 상황을 시각화하여 안정적으로 접힌 도메인을 식별하기 위해 제한된 단백질 분해를 수행합니다. 젤을 Coomassie blue로 염색하여 프로테아제 내성 종을 식별할 수 있는지 평가합니다. 부분적으로 정제된 mRuby2-Shroom 융합 단백질에 대한 정제 효율, 비변 PAGE의 거동 및 제한된 단백질 가수 분해의 데이터를 통합하여 용액 내 이러한 단백질의 전반적인 거동에 대한 포괄적인 평가를 수행합니다.2리터의 mRuby2-Shroom SD2 배양물로 대규모 발현을 수행하여 5-20mg의 완전 정제된 시료를 얻을 수 있습니다. 세포 성장 다음, 8, 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 세포를 10 분 동안 펠릿. 생성된 세포 펠릿은 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.다음으로, 동결 세포 펠릿 그램당 약 8ml의 용해 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 균질기를 사용하여 다시 부유한 세포를 용해합니다. 세포 용해 다음, 30, 000 시간 G에 원심분리를 통해 세포질 파편을 30 분 동안 펠릿화하십시오.다음으로, 10ml의 사전 세척된 니켈 NTA 수지를 사용하여 용해성 분획을 일괄 결합합니다. 비드 현탁액을 적절한 중력 컬럼에 붓고 결합되지 않은 단백질이 배출되도록 한 다음 40ml의 용해 완충액으로 수지를 3-5회 세척한 다음 1몰 염화나트륨이 보충된 용해 완충액으로 세척합니다. 80밀리몰 이미다졸이 보충된 40ml의 용해 완충액으로 수지를 최종 세척합니다.Ruby-Shroom 융합 단백질을 1몰 이미다졸을 함유한 40ml의 용해 완충액으로 용리합니다. 용출된 단백질을 4-10밀리리터 분획으로 수동으로 분획합니다. 10%SDS-PAGE 겔을 사용하여 Ruby-Shroom 융합 단백질이 포함된 분획을 확인합니다.융합 단백질 25-50mg당 TEV 프로테아제 1mg을 첨가하여 Ruby 태그를 제거합니다. 다음으로, 6-8 킬로달톤 분자량 차단 투석 튜브를 사용하여 적절한 분획을 TEV 절단 버퍼에 투석합니다. 천천히 저으면서 실온에서 밤새 단백질을 투석합니다.투석 후 니켈 친화성 정제 단계를 반복합니다. Shroom-SD2 도메인은 결합되지 않은 분획으로 흘러야 하는 반면 Ruby 태그는 수지에 결합된 상태로 유지되어야 합니다. 스핀 농축기를 사용하여 피크 분획을 밀리리터당 약 10mg으로 농축한 다음 12%SDS-PAGE 겔을 통해 피크 분획을 분석하는 크기 배제 크로마토그래피를 수행합니다.피크 분획을 풀링한 후 용액을 결정화 완충액에 투석한 다음 결정화 전에 투석된 단백질을 밀리리터당 10mg으로 농축합니다. 12개 조건의 작은 배열을 스크리닝하여 24개의 웰 sitting 드롭 결정화 트레이를 사용하여 결정화 시험을 위한 최적의 단백질 농도를 식별합니다. 증기 확산 방법을 사용하여 결정화 시험을 수행합니다.먼저, 12가지 조건 각각을 500마이크로리터씩 별도의 웰에 피펫팅합니다. 각 받침대에서 1마이크로리터의 웰 용액과 1마이크로리터의 단백질 샘플이 포함된 방울을 만듭니다. 투명 테이프로 트레이를 빠르게 밀봉한 다음 트레이를 진동이 없는 적절한 온도 제어 환경으로 이동합니다.향후 3일 동안 최대 100X 배율의 현미경을 사용하여 트레이의 방울을 검사합니다. 3일 기간이 끝나면 각 방울에 강수량이 없거나, 약한 강수량, 많은 강수량 또는 결정이 포함된 것으로 점수를 매깁니다. 적절한 단백질 농도는 6개 이하의 무거운 침전을 포함해야 합니다.측정된 단백질 농도를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 광범위한 결정화 스크리닝을 스크리닝합니다. 액체 처리 또는 결정화 로봇을 사용하면 이 프로세스의 속도가 크게 빨라지는 동시에 방울의 오류를 최소화할 수 있습니다. 훨씬 적은 단백질을 필요로 하므로 사용자가 단일 샘플로 더 많은 조건을 스크리닝할 수 있습니다.이전과 같이 24개의 웰 스크리닝 트레이를 사용하여 결정화 방울 내의 각 변수를 체계적으로 변화시켜 광범위한 스크린에서 식별된 초기 조건을 개선합니다. 제한된 단백질 가수 분해는 유연하거나 단백질 분해 효소에 더 쉽게 접근할 수 있는 단백질 영역을 식별하는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 것은 단백질 분해에 민감한 SD2 영역과 매우 안정적인 SD2 영역에 대한 분해 패턴입니다.제한된 단백질 분해는 Ruby 융합 단백질의 맥락에서 수행되었습니다. 이 경우, Ruby와 SD2 도메인 사이의 링커 염기서열은 예상대로 빠르게 절단되었지만, 그 결과로 생성된 Ruby와 SD2 단편은 대체로 안정적으로 유지되었습니다. native PAGE에 의한 분석을 통해 결정화에 대한 좋은 후보를 빠르게 밝힐 수 있습니다.서로 다른 단백질 배터리를 가진 4개의 Shroom-Rock 복합체를 네이티브 PAGE 겔에서 실행했습니다. 암석 834에서 913을 포함하는 복합체는 가장 좋은 거동을 보였고 쉽게 결정화되었지만, 다른 것들은 분해 시에만 결정화되거나 완전히 결정화되지 않았다. 이 동영상을 시청한 후에는 대형 코일 단백질 에 대한 일련의 잠재적 도메인 경계를 개발하는 방법과 Ruby 시스템을 사용하여 결정화에 가장 적합한 후보를 빠르고 빠르게 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.결정학은 여전히 시간이 많이 걸리는 작업이지만, 이 기술을 사용하면 간단한 분석을 사용하여 결정화되는 단백질을 찾는 데 집중하여 불량한 후보 물질을 제거하므로 성공 가능성이 더 높은 후보 물질에 더 많은 시간을 할애할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가능한 도메인 경계를 선택할 때 가능한 한 많은 정보를 포함해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이 절차를 사용할 때 선택하는 정보는 단백질마다 다릅니다.가능한 경우, 세포 기반 또는 생화학적 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 문제의 단백질 단편이 여전히 생물학적 관심 기능을 포함하는지 확인해야 합니다. 이 방법은 코일 코일 단백질에 초점을 맞추고 있지만 전체 프레임워크는 거의 모든 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 특정 기기 및 생물학적 시약으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 장갑을 사용하거나 보호 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

분자의 3 차원 구조는 어떻게 분자 기능의 독특한 이해를 제공합니다. 가까운 원자 해상도 구조 결정을위한 주요 방법은 X - 레이 crystallography입니다. 여기서는 X - 레이 crystallography에 의해 구조 결정에 적합 특정 macromolecule의 세 차원 결정을 얻기위한 현재의 방법을 보여줍니다.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Bicelles은 지질 이중층 내에서 막 단백질 (MPS)를 유지하지만, 결정화 로봇에 의해 높은 처리량 검사를 용이하게 독특한 위상 동작을 가지고 지질 / amphiphile 혼합물입니다. 이 기술이 성공적으로 prokaryotic과 진핵 소스 모두에서 고해상도 구조의 수를 생산하고 있습니다. 이 비디오는 매체에서 crystallizations 재판 (수동뿐만 robotically) 및 수확 결정을 설정, bicelle 혼합물로 의원을 포함, lipidic bicelle 혼합물을 생성하기위한 프로토콜을 설명합니다.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

구조 기반 약물 설계 약물 개발에 중요한 역할을한다. 병렬로 여러 대상을 추구하는 것은 크게 선 발견의 성공의 기회를 증가합니다. 다음 문서는 감염성 질환 시애틀 구조 유전체학 센터 PB2 인플루엔자 단위체의 유전자에 대한 구조 결정을위한 멀티 타겟 접근 방식을 활용하는 방법 강조한다.

인플루엔자 중합 효소의 유전자에 대한 구조 결정 PB2 소단위를위한 멀티 타겟 병렬 처리 방식

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

여기 선물이 단백질 microcrystals의 제어 생산을 위한 프로토콜. 프로세스의 여러 결정 화 매개 변수 제어 조작 수 있도록 자동화 된 장치를 사용 합니다. 단백질 결정 화는 수행-아웃 모니터링 및 결정 화 방울 입자의 반경 분포를 조사 하는 동안 결정 화 솔루션의 제어 및 자동화 된 추가 의해.

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

배우세요 대형 코일 코일 단백질 결정화를 위한 생화학적 및 계산적 분석 통합 프레임워크입니다. 이 방법은 도메인 경계를 신속하게 식별하고 결정화 성공 가능성을 높여 구조생물학 연구자들에게 효율적인 도구를 제공합니다.

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

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