습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

이 절차의 전반적인 목표는 큰 코일 코일 단백질 내에서 가능한 도메인 경계를 신속하게 식별하고 테스트하여 결정화될 고유 단편을 찾을 가능성을 높이는 것입니다. 이 방법은 연구자들이 결정화가 매우 어려울 수 있는 대형 코일 단백질의 결정화 과정을 간소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 실험 방법과 계산 방법을 모두 통합하여 결정화에 대한 가능성 있는 후보를 신속하게 식별하고 선별하여 성공 가능성을 높인다는 것입니다.

제 연구실의 대학원생인 Jenna Zalewski와 제 연구실의 학부생 연구원인 Keith O'Conor가 이 기술을 시연할 것입니다. 먼저 설정된 웹 기반 도구의 출력을 결합하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 가능한 코일 코일 도메인 경계에 대한 예측을 생성합니다. 발현 플라스미드를 생성하고 텍스트에 자세히 설명된 대로 발현 수준을 테스트한 후, Ruby 태그가 지정된 단백질을 성공적으로 발현한 각 균주의 정제를 시작합니다.

세포를 용해시키려면 먼저 프로테아제 억제제가 보충된 1.5ml의 용해 완충액에 해동된 각 세포 펠릿을 재현탁합니다. 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 30마이크로리터의 라이소자임을 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양한 다음 사용 중인 기기의 지침에 따라 초음파 처리합니다. 탁상용 원심분리기에서 14, 000배 G로 30분 동안 샘플을 원심분리하여 불용성 물질 또는 용해되지 않은 세포를 펠릿으로 만듭니다.

SDS-PAGE를 통한 후속 분석을 위해 상등액과 펠릿을 모두 보관하십시오. 니켈 친화성 정제를 수행하려면 먼저 100마이크로리터의 니켈 NTA 비드를 5-10분 동안 용해성 용해물과 함께 용해 완충액에서 사전 세척하여 배양합니다. 서스펜션을 여러 번 뒤집어 비드를 혼합합니다.

탁상용 원심분리기에서 30초 동안 800배 G로 샘플을 원심분리하여 비드를 펠릿화합니다. 그런 다음 용해 완충액으로 펠릿을 3-5회 세척하여 비특이적 오염 물질을 제거합니다. 마지막으로, 용해 완충액으로 비드에서 Ruby 융합 단백질을 용리하고 1개의 몰 이미다졸을 보충합니다.

280나노미터로 설정된 분광광도계를 사용하여 Ruby 융합 단백질의 농도를 측정한 다음 1-5마이크로그램의 융합 단백질을 네이티브 PAGE 겔에 로드하여 샘플의 균질성을 평가합니다. 10%native PAGE 젤을 섭씨 4도에서 175볼트에서 140분 동안 실행합니다. 형광을 시각화할 수 있는 장비를 갖춘 이미저를 사용하여 기본 PAGE를 이미지화하고 이 분석에서 Ruby 태그가 지정된 융합이 이동하는 위치를 관찰합니다.

먼저 95 마이크로 리터의 Ruby-Shroom SD2 융합을 5 마이크로 리터의 0.025 Subtilisin A.Sample과 함께 배양하여 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 및 120 분의 시점에서 반응을 배양하고 각 시점의 반응에서 10 마이크로 리터를 제거하고 15 % 아크릴 아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 통해 반응의 진행 상황을 시각화하여 안정적으로 접힌 도메인을 식별하기 위해 제한된 단백질 분해를 수행합니다. 젤을 Coomassie blue로 염색하여 프로테아제 내성 종을 식별할 수 있는지 평가합니다. 부분적으로 정제된 mRuby2-Shroom 융합 단백질에 대한 정제 효율, 비변 PAGE의 거동 및 제한된 단백질 가수 분해의 데이터를 통합하여 용액 내 이러한 단백질의 전반적인 거동에 대한 포괄적인 평가를 수행합니다.

2리터의 mRuby2-Shroom SD2 배양물로 대규모 발현을 수행하여 5-20mg의 완전 정제된 시료를 얻을 수 있습니다. 세포 성장 다음, 8, 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 세포를 10 분 동안 펠릿. 생성된 세포 펠릿은 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.

다음으로, 동결 세포 펠릿 그램당 약 8ml의 용해 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 균질기를 사용하여 다시 부유한 세포를 용해합니다. 세포 용해 다음, 30, 000 시간 G에 원심분리를 통해 세포질 파편을 30 분 동안 펠릿

다음으로, 10ml의 사전 세척된 니켈 NTA 수지를 사용하여 용해성 분획을 일괄 결합합니다. 비드 현탁액을 적절한 중력 컬럼에 붓고 결합되지 않은 단백질이 배출되도록 한 다음 40ml의 용해 완충액으로 수지를 3-5회 세척한 다음 1몰 염화나트륨이 보충된 용해 완충액으로 세척합니다. 80밀리몰 이미다졸이 보충된 40ml의 용해 완충액으로 수지를 최종 세척합니다.

Ruby-Shroom 융합 단백질을 1몰 이미다졸을 함유한 40ml의 용해 완충액으로 용리합니다. 용출된 단백질을 4-10밀리리터 분획으로 수동으로 분획합니다. 10%SDS-PAGE 겔을 사용하여 Ruby-Shroom 융합 단백질이 포함된 분획을 확인합니다.

융합 단백질 25-50mg당 TEV 프로테아제 1mg을 첨가하여 Ruby 태그를 제거합니다. 다음으로, 6-8 킬로달톤 분자량 차단 투석 튜브를 사용하여 적절한 분획을 TEV 절단 버퍼에 투석합니다. 천천히 저으면서 실온에서 밤새 단백질을 투석합니다.

투석 후 니켈 친화성 정제 단계를 반복합니다. Shroom-SD2 도메인은 결합되지 않은 분획으로 흘러야 하는 반면 Ruby 태그는 수지에 결합된 상태로 유지되어야 합니다. 스핀 농축기를 사용하여 피크 분획을 밀리리터당 약 10mg으로 농축한 다음 12%SDS-PAGE 겔을 통해 피크 분획을 분석하는 크기 배제 크로마토그래피를 수행합니다.

피크 분획을 풀링한 후 용액을 결정화 완충액에 투석한 다음 결정화 전에 투석된 단백질을 밀리리터당 10mg으로 농축합니다. 12개 조건의 작은 배열을 스크리닝하여 24개의 웰 sitting 드롭 결정화 트레이를 사용하여 결정화 시험을 위한 최적의 단백질 농도를 식별합니다. 증기 확산 방법을 사용하여 결정화 시험을 수행합니다.

먼저, 12가지 조건 각각을 500마이크로리터씩 별도의 웰에 피펫팅합니다. 각 받침대에서 1마이크로리터의 웰 용액과 1마이크로리터의 단백질 샘플이 포함된 방울을 만듭니다. 투명 테이프로 트레이를 빠르게 밀봉한 다음 트레이를 진동이 없는 적절한 온도 제어 환경으로 이동합니다.

향후 3일 동안 최대 100X 배율의 현미경을 사용하여 트레이의 방울을 검사합니다. 3일 기간이 끝나면 각 방울에 강수량이 없거나, 약한 강수량, 많은 강수량 또는 결정이 포함된 것으로 점수를 매깁니다. 적절한 단백질 농도는 6개 이하의 무거운 침전을 포함해야 합니다.

측정된 단백질 농도를 사용하여 상업적으로 이용 가능한 광범위한 결정화 스크리닝을 스크리닝합니다. 액체 처리 또는 결정화 로봇을 사용하면 이 프로세스의 속도가 크게 빨라지는 동시에 방울의 오류를 최소화할 수 있습니다. 훨씬 적은 단백질을 필요로 하므로 사용자가 단일 샘플로 더 많은 조건을 스크리닝할 수 있습니다.

이전과 같이 24개의 웰 스크리닝 트레이를 사용하여 결정화 방울 내의 각 변수를 체계적으로 변화시켜 광범위한 스크린에서 식별된 초기 조건을 개선합니다. 제한된 단백질 가수 분해는 유연하거나 단백질 분해 효소에 더 쉽게 접근할 수 있는 단백질 영역을 식별하는 데 사용됩니다. 여기에 표시된 것은 단백질 분해에 민감한 SD2 영역과 매우 안정적인 SD2 영역에 대한 분해 패턴입니다.

제한된 단백질 분해는 Ruby 융합 단백질의 맥락에서 수행되었습니다. 이 경우, Ruby와 SD2 도메인 사이의 링커 염기서열은 예상대로 빠르게 절단되었지만, 그 결과로 생성된 Ruby와 SD2 단편은 대체로 안정적으로 유지되었습니다. native PAGE에 의한 분석을 통해 결정화에 대한 좋은 후보를 빠르게 밝힐 수 있습니다.

서로 다른 단백질 배터리를 가진 4개의 Shroom-Rock 복합체를 네이티브 PAGE 겔에서 실행했습니다. 암석 834에서 913을 포함하는 복합체는 가장 좋은 거동을 보였고 쉽게 결정화되었지만, 다른 것들은 분해 시에만 결정화되거나 완전히 결정화되지 않았다. 이 동영상을 시청한 후에는 대형 코일 단백질 에 대한 일련의 잠재적 도메인 경계를 개발하는 방법과 Ruby 시스템을 사용하여 결정화에 가장 적합한 후보를 빠르고 빠르게 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

결정학은 여전히 시간이 많이 걸리는 작업이지만, 이 기술을 사용하면 간단한 분석을 사용하여 결정화되는 단백질을 찾는 데 집중하여 불량한 후보 물질을 제거하므로 성공 가능성이 더 높은 후보 물질에 더 많은 시간을 할애할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가능한 도메인 경계를 선택할 때 가능한 한 많은 정보를 포함해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이 절차를 사용할 때 선택하는 정보는 단백질마다 다릅니다.

가능한 경우, 세포 기반 또는 생화학적 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 문제의 단백질 단편이 여전히 생물학적 관심 기능을 포함하는지 확인해야 합니다. 이 방법은 코일 코일 단백질에 초점을 맞추고 있지만 전체 프레임워크는 거의 모든 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 특정 기기 및 생물학적 시약으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 장갑을 사용하거나 보호 안경을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.