Name: 세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화 ZEA 메이스 잎 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 옥수수 잎의 세포 분열과 확장을 정량화하는 방법을 통해 식물 발달 생물학에서 분자 성장 조절 메커니즘을 연구하는 기술을. 이 프로토콜은 전체 식물 성장 동역학 이해에 필수적입니다.

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이 작품은 VA에 앤트워프 대학에서 박사 친교에 의해 지원되었다; KS에 플랑드르 과학 재단 (FWO, 11ZI916N)에서 박사 교제; FWO (G0D0514N)에서 프로젝트 보조금; 공동의 연구 활동 (GOA) 연구 보조금, 앤트워프 대학의 연구위원회에서 &quot;잎 형태 형성의 시스템 생물학 접근&quot;; 그리고 Interuniversity 매력 폴란드 (IUAP VII / 29, MARS), 모든 비디오에 기여 GTSB 한 Asard, Bulelani L. Sizani과 하마다 AbdElgawad에 벨기에 연방 과학 정책 사무실 (BELSPO)에서 &quot;옥수수와 애기 장대 뿌리와 성장을 쏴&quot; .

참고 : 운동 학적 분석을 위해 다음 프로토콜은 정상 상태 성장하는 동안 잎에만 유효합니다. 이것은 몇 일 (6)의 기간 동안 안정한 잎의 신장 속도와 셀 길이와 리프 팽창 공간 패턴을 의미한다. 1. 식물 성장과 잎 신장 속도의 측정 (LER) <ol><li> 정상 상태의 성장에 잎과 관심의 발달 단계를 선택합니다. 참고 : 동일한 축의 연속 잎 유사한 공간 패턴을 의미 정상 성장 및 반복적 성장의 차이가있다. 묘목 성장의 초기 단계 동안, 연속 된 잎은 일반적으로 성장 영역 (7)의 크기를 증가시키는 것이 점점 더 빠른 증가로 인해. 약간 높은 위치 리프 유사한 성장 패턴 (8)이있을 수 있지만,이 연구중인 치료제에 의해 영향을받을 수있는 과도 단계이다. 라인과 TR을 비교하는 것이 중요<html> 그것은 다른 시간에 개발 될지라도, 엄격하게 동일한 위치에서 리프 eatments. 비록 일정한 신장 속도로 성장 속도 프로파일은 반드시 상이한 발달 단계에서 동일하지 않다. 따라서, 일반적으로 출현 후 일수에 의해 정의 된 동일한 발달 단계 8에서 잎을 분석하는 것이 중요하다. </li><li> 성장 룸에서 통제 된 조건 하에서 각각의 치료 및 유전자형 적어도 15 식물을 성장, 외떡잎에 잎 성장의 전체 운동 학적 분석을 수행합니다. </li><li> 잎이 완전히 (그림 1I) 확장 될 때까지 관심의 잎 (주변 잎의 가마에서 출현)가 나타납니다 당시 통치자 매일 잎의 길이를 측정하기 시작합니다. 리프 길이 판의 선단에 오물 레벨까지의 길이를 의미한다. 이 성장을 변경할 수 있으므로, 휴식 또는 잎이 손상되지 않도록주의하십시오. </li></ol>1 다시 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54887 / 54887fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 :. 옥수수 잎의 운동 학적 분석의 도식 개요는 관심의 잎은 잎 신장 비율 (LER)를 계산하는 세 가지 일 연속 통치자로 측정된다. 그 후, 리프 수확되고 세 cm 세그먼트는 분열 크기의 결정에 사용된다. 이것은 DAPI 염색 후 가장 말단 유사 분열의 그림을베이스까지의 길이를 측정하여 수행됩니다. 증식 유사 분열 수치와 (B) 조형 유사 분열 수치의 (A) 예. 중간 정맥의 다른 쪽 판베이스에서 제 십일cm은 셀 길이를 측정 한 10 상자 cm 세그먼트를 절단하는 데 사용된다. 이러한 측정은 성숙한 세포의 길이 (L 메트) 및 분열 (패 DIV)를 떠나는 셀의 길이를 결정하는 역할을 셀 길이 프로파일을 생성하기위한 기초를 제공한다. 그만큼 <e패 DIV 및 L 메르가 분열 조직 (N 메르) 세포의 수를 계산하는데 사용되지만 m&gt; LER 및 L 매트는 전지 생산 속도 (P)을 계산하기 위해 사용된다. 차례로, P 및 N 메르 세포주기의 기간 (T의 c)의 역수이다 평균 셀 분할 률 (D)을 계산하는 데 사용된다. 동일 컬러의 화살표는이 화살표 다음의 파라미터를 계산하는데 사용되는 매개 변수를 나타낸다. 스케일 바는 40 μm의 =. 로마 숫자는 프로토콜에 설명 된 특정 실험 절차를 참조하는 데 사용됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 수확 <ol><li> 관심의 발달 단계에서 (예를 들어, 출현 후 셋째 날), 적어도 다섯 대표 쪽을 선택배치에서 lants이되는 운동 학적 분석을 수행합니다. 마지막 잎의 길이를 결정하는 단계 130에서 설명한 바와 같이 식물의 나머지를 계속 측정. </li><li> 식물의 위 지상 부분을 잘라. 뿌리에 최대한 가깝게 잘라 그대로 (그림 1II을)를 분열 부분을 유지합니다. </li><li> 외부 잎에서 시작, 부드럽게 하나씩 줄이기 모든 관심의 잎까지 잎 제거합니다. 필요한 경우, 잎을 분리 기지에서 몇 가지 추가 밀리미터를 제거합니다. 또한 관심 (그림 1iii)의 잎으로 둘러싸인 정점 작은 잎을 제거 할 수 있습니다. </li><li> 중간 정맥의 일측에 상기베이스부터 3 CM 구간을 잘라, 3 가득 1.5 mL를 시험관에 보관 : 1 (V : V) 무수 에탄올 : 아세트산 용액 (주의 : 장갑을 착용)에서 몇 달에 24 시간까지 4 ° C를 (그림 1iv). 이 세그먼트는 나중에 분열의 길이를 결정하는 데 사용된다. </li><li> 로부터정맥의 다른 측면은,베이스에서 11cm 세그먼트를 잘라 (그림 1 V) 및 안료 (그림 1 VI)를 제거하기 위해 적어도 6 시간 동안 4 ° C에서 무수 에탄올로 가득 15 ML 튜브에 넣습니다. 주 : 나중에, (설명을 참조) 셀 길이 프로파일을 결정하는 첫 번째 10cm를 사용한다. </li><li> 적어도 24 시간 (그림 1vi) 4 ° C에서 청소의 또 다른 라운드의 무수 에탄올을 갱신. </li><li> 마지막으로, 순수 젖산과 무수 에탄올을 대체 (주의 : 장갑을 착용) 청소 및 저장을 위해 4 ° C에서 24 시간 동안 또는 추가 사용 (그림 1vi)까지. </li></ol> 3. 분열 조직 길이 측정 <ol><li> 50 mM 염화나트륨 (NaCl을), 5 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 포함 된 세척 버퍼 준비 (EDTA 단계;주의 : 장갑을 착용) 및 10 mM 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 - 염산 (트리스 - 염산, pH가 7). </li><li> 2.4 절 등등에서 3cm 세그먼트를 타고20 분 (그림 1vii)에 대한 버퍼를 AK. </li><li> 대기하는 동안, 얼음 및 진한에서 유지 한 μg의 / ㎖ 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI) 염색 액을 조제 린스 버퍼를 사용한다. </li><li> DAPI 염색 용액에 2-5 분 동안 분열 조직 세그먼트를 배치하여 핵을 염색. 얼음과 어둠 (그림 1vii)에서 작업 할 수 있습니다. </li><li> 빠르게 현미경 유리에 세그먼트를 장착하고 커버 유리를 덮어 형광 신호를 확인합니다. 표피 세포가있는 동안 기본 세포 층이 안, 형광을 표시해야합니다. </li><li> 염색이 충분하지 않은 경우 일부 여분 분간 DAPI 염색 용액에 다시 넣어 세그먼트. </li><li> , 염색을 중지 커버 유리와 현미경 슬라이드와 커버에 버퍼를 세척 한 방울의 세그먼트를 장착합니다. </li><li> 1,000 epiderm의 시각화를 허용하는 20X의 배율로 UV 형광 장착 된 현미경을 사용하여알 세포를 한 번에. 세그먼트에 걸쳐 스크롤 증식 유사 분열 수치 (중기, anaphase (핵분열 말기), telophase 및 세포질 분열)을 찾아,하지만 개발 기공 (그림 1viii)의 조형 세포 분열을 피하기 9. 가장 말단 유사 분열 그림이있는 위치를 정의합니다. </li><li> 잎의베이스와 가장 후방 표피 유사 분열 지수 사이의 거리를 측정함으로써 분열의 길이를 결정한다. 이미지 프레임의 전체 길이를 측정하는 이미지 분석 소프트웨어 (예 ImageJ에)를 사용한다. <ol><li> (가장 먼 유사 분열의 그림을 판베이스)에서 전체 분열 길이를 커버 프레임 수를 세어 전체 분열 길이 (도 1ix)을 획득 한 프레임의 길이만큼이 값을 곱한다. </li></ol></li></ol> 4. 셀 길이 프로필 <ol><li> 젖산 (단계 2.5)에 저장되어있는 세그먼트를 가지고 벤치에 조심스럽게 놓습니다. 세그먼트 재치를 잘라1cm 각 (그림 1 배)의 10 세그먼트 하는 메스. </li><li> 젖산의 작은 방울의 현미경 슬라이드에 연속 잎 세그먼트를 탑재합니다. 지속적으로 향축 또는 배축면이 위로를 직면해야합니다. 원칙적으로, 특정 측면에 대한 선호가 없습니다. </li><li> 리프베이스부터 세그먼트를 분석하는 미분 간섭 대비 (DIC) 광학계를 구비 한 현미경을 사용한다. 일관 동일한 세포 유형을 선택하기 위해 이미지 분석 소프트웨어와 기공 파일로 직접 인접하는 파일의 적어도 20 복제 표피 세포의 길이를 측정한다. <ol><li> 세그먼트 (세그먼트 충분할 당 4 위치)의 각각을 따라 등 간격 위치에서이 작업을 수행하고, 잎 (그림 1xi)에 걸쳐 각 측정에 해당하는 위치를 기록해야합니다. </li></ol></li><li> 로컬 평활 다항식 ​​P를 사용하여 리프 축을 따라 각 mm의 평균 셀 길이를 결정rocedure,에 R-스크립트 (; 보충 파일 1 그림 1xii)에서 구현. 주 : R-스크립트 매끄럽게 증가하는 일련의 데이터를 제공한다. 필요한 스무딩 양은 단지 로컬 잡음을 제거하지만, 전체적인 곡선에 영향을 미치지 않아야 이상적 다소 임의적이며. 한 실험에서 모든 샘플에 대한 평활화의 동일한 금액을 사용하십시오. </li><li> 식물 사이의 각각의 위치에서의 셀 길이를 평균 판 축을 따라 셀 길이 프로파일을 생성하기 위해 표준 오차를 계산한다. </li></ol> 운동 학적 매개 변수 5. 계산 (보조 파일 2 참조) <ol><li> (단계 130에서와 같이 예를 들면 24 시간) 두 개의 연속 시점 사이 리프 길이의 변화를 고려하여 시간 간격을 분할함으로써 LER을 계산한다. </li><li> 세포가 성숙한 CE의 95 %에 도달 여기서베이스로부터 먼 위치에 대응하는 성장 영역 (L의 GZ)의 길이를 계산평활 셀 길이 프로필에 게요 길이. <ol><li> 그 위치 (도 2) 다음의 모든 셀의 길이의 평균의 평활 셀 길이 프로필 95 %의 각 위치에 가라. </li><li> 각 위치에서 계산 된 95 % 셀 길이의 셀 평활화 길이 (단계 4.4)을 비교한다. (, 보완 데이터 2도 2 참조) 잎의 기부에서 시작하여, 성장 영역은 실제 셀 길이는 다음의 셀의 길이의 95 %를 동일 위치에서 종료한다. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54887/54887fig2.jpg" /> 그림 2. 성장 영역의 종료를 결정하는 분열 조직은 : 적색 별표 표시된 위치에서는, 실제의 셀 크기보다 작은 95 %가이 위치에 따라 모든 셀의 평균 셀 크기 (빨간색 점선) (적색 고체 인 선). 성장 영역 (L의 GZ의 끝, AB로 표시95 %이 위치 (청색 선 다음 모든 셀의 평균 셀 크기의 (점선 파란색 라인)) 실제 셀 크기를 동일 곳 루 스타)에 위치해 있습니다. 분할 영역 (D), 신장 영역 (E), 성숙 영역 (M). 점선 화살표는 로컬 크기와 잎의 끝 부분에 기초 위치에서 이동하는 잎의 선단부의 평균 크기의 95 % 사이의 융합을 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <ol start="3"><li> 성장 영역 (L의 GZ) 및 분열 크기의 길이 차이 등의 연신 존 (L EL)의 길이를 계산한다 (L 메르을, 3 단계에서). </li><li> 성숙한 영역의 평균 셀 길이와 성숙 세포의 길이 (L 매트)를 계산한다. </li><li> 를 얻을 리터 매트에 의해 LER 나눈다셀 생산 률 (P). </li><li> N 및 N의 GZ 메르 차이로 연신 존 (N EL) 세포의 수를 계산한다. 분열 조직 (N 메르) 세포의 수는 분열에 대응 한 간격으로 위치한 셀의 누적 개수와 동일. 성장 영역 (N의 GZ) 세포의 수는 증가 영역에 대응 한 간격으로 위치한 셀의 누적 개수와 동일. </li><li> P의 / N의 메르로서 평균 셀 분할 률 (D)을 계산한다. 세포주기 기간 (T의 C)는 LN (2) / D 같다. </li><li> P가 N EL 나누어 연신 존 (T EL)의 시간을 계산한다. 분할 영역에서 시간은 로그 2 (N 메르) * T의 C 같습니다. 분열 조직을 떠나 세포의 길이 (L의 사업부)분열 조직 끝의 평활 셀 길이 프로필에서 셀 길이 같다. </li><li> LN (L 매트) -ln (리터 사업부)] / T 엘 : 평균 다음 공식을 사용하여 세포의 확장 속도 (R 엘)을 계산합니다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

옥수수 잎 전체 학적 분석 판 성장의 셀룰러 기반의 판정이 가능하고 효율적인 샘플링 전략의 디자인을 허용한다. 프로토콜은 비교적 간단하지만, 몇 가지주의 사항은 다음 중요한 단계 추천 : (1)은 분열 조직의 길이 결정 (3 단계) 때문에, 분열 조직에 손상을주지 않고 젊은, 동봉 된 잎 (2.3 단계) 분리하는 것이 중요합니다 전체가 필요합니다 분열 조직은 존재합니다. 연습은 사전에 필요할 수 있습니다. (2) 분열 길이 판정은 유사 분열의 해석에 기초한다. 따라서, 우리는 하나의 실험에서, 동일 인물 의한 실행 프로그램에 차이를 줄이기 위해 이러한 측정을 행하는 것을 조언한다. (3) 단지 10 센티미터 실제 셀 길이의 측정에 사용되는 경우에도, 상기 세그먼트의 에지가 전혀 않으므로 셀 길이를 측정 (250 단계)에 세그먼트를 수확 십일cm 포함하지 중요t는 항상 완전히 에탄올 및 / 또는 유산균의 잠수함. 따라서,이 여분 센티미터 성장 영역의 처음 10 센티미터 청산을 보장한다. (4) 마지막으로,이 올바른지 확인하기 위...

성장 분석은 일반적으로 환경 적 요인에 대한 유전자형 결정 성장의 차이 및 / 또는 표현형의 반응을 설명하기 위해 식물 과학자들에 의해 사용되는 도구 세트에 따라 달라집니다. 그들은 성장의 기본 메커니즘을 탐구하는 크기와 무게 전체 식물의 측정 또는 장기 성장 속도의 계산을 포함한다. 장기 성장은 세포 수준에서 세포 분열과 팽창에 의해 결정된다. 따라서, 분석 성장이 두 프로세스의 정량화를 포함하는 전체 장기 성장 1의 차이를 이해하는 열쇠이다. 따라서, 비 전문 실험실에서 사용하는 것이 상대적으로 쉽다 세포 성장 파라미터를 결정하는 적절한 방법을 위해 중요하다. 운동 학적 분석은 이미 장기 성장 모델이 개발을위한 강력한 프레임 워크를 제공하는 방식으로 설정되어있다. 이 기술은 선형 시스템에 최적화 된,이러한 애기 장대의 뿌리와 잎 외떡잎로서뿐만 아니라, 쌍떡잎 식물 잎 3 비 - 선형 시스템에 대한. 오늘날,이 방법은 점점 방법 유전 호르몬 발달을 연구하는 데 사용되는, 환경 적 인자, 세포 분열 및 다양한 기관에서 팽창 (표 1)에 영향을 준다. 제한이 식물 재료의보다 많은 양을 필요로 기술 (예, 대사 산물에 대한 장기의 크기와 공간적인 조직에 의해 부과 될 수 있지만, 또한, 또한, 그들의 기본적인 생화학 적 분자, 및 생리적 규정 (표 2)에 세포 과정을 연결하는 프레임 워크를 제공한다 측정 프로테오믹스 등). 예컨대 옥수수 (ZEA 메이스) 잎과 같은 외떡잎 잎 순차적 성숙에 도달하는 분열 조직 및 연신 존을 통과하는 세포가 선단을 향해 판의베이스를 이동하는 선형 시스템을 나타내는존. 이는 성장 (4)의 공간 패턴의 정량적 연구 이상적인 모델 시스템 만든다. 또한, 옥수수 잎 (몇 cm (5)에 걸친 분열과 신장 영역) 큰 성장 영역이 다른 조직 수준의 연구에 대한 가능성을 제공합니다. 이 분자 기술, 생리 학적 측정 및 세포 생물학 접근 (표 2)의 범위를 통해 운동 학적 분석에 의해 정량화 세포 분열 및 확장을 제어 (추정) 규제 메커니즘의 조사를 할 수 있습니다. 여기서는 단자엽 나뭇잎의 운동 학적 분석을 수행하기위한 프로토콜을 제공한다. 첫째, 우리는 리프 축의 위치와 얼마나 학적 매개 변수를 계산하는 함수로서 세포 분열과 세포 신장 둘의 적절한 분석을 수행하는 방법을 설명한다. 둘째, 우리는 또한이가 샘플링 디자인의 기초로 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 여기서 우리는 두 가지 사례를 토론 고해상도 샘플링을D는 각각 향상된 데이터 해석 및 시간 / 비용의 절감을 가능하게 샘플링을 집중했다. 운동의 표 1. 개요 세포 분열 및 다양한 기관에서 확장 정량화하는 방법을 분석한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 오르간 </td><td> 참고 </td></tr><tr><td> 외떡잎 잎 </td><td> 16, 20, 21, 22 </td></tr><tr><td> 루트 팁 </td><td> 2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 </td></tr><tr><td> 쌍떡잎 식물 잎 </td><td> 21, 30, 31 </td></tr><tr><td> 혀끝의 분열 조직을 촬영 </td><td> (32) </td></tr></tbody></table> 운동의 표 1. 개요 세포 분열 및 다양한 기관에서 확장 정량화하는 방법을 분석한다. 분자 수준에서 자신의 규제기구 학적 분석에 의해 정량 세포 과정과 표 2에 연결합니다. 다양한 종 및 기관에서 생화학 및 분자 분석 결과에 세포 프로세스의 정량화를 연결하는 다양한 연구에 대한 참조. 크 실로 글루칸 endotransglucosylase (XET), 말론 디 알데히드 (MDA), 사이클린 의존 키나제 (CDK). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54887/54887table2large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Pots</td><td>Any</td><td>Any</td><td>우리는 다음과 같은 방법으로 냄비를 사용하지만 치료 / 연구에 따라 다를 수 있습니다 : 바닥 직경 : 11cm, 개구부 직경 : 15cm, 높이 : 12cm. 우리는 냄비 당 하나의 옥수수 식물을 재배합니다.</td></tr><tr><td>심기 기질</td><td>Any</td><td>Any</td><td>우리는 화분 매체 (Jiffy, The Netherlands)를 사용하지만 처리 / 연구에 따라 다른 기질을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Any</td><td></td><td>Any 식물의 최종 잎 길이를 측정하려면 최소 1.5미터를 덮는 확장 눈금자가 필요합니다.</td></tr><tr><td>씨앗</td><td>모든</td><td>NA</td><td>씨앗은 육종가에게 주문할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>메스</td><td>Any</td><td>Any</td><td>메스는 잎 수확 중에 주변의 잎에서 관심 있는 잎을 분리하는 데 사용되며, 수확 직후에는 세포 길이 및 분열 길이 측정을 위한 적절한 샘플을 절단하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td>Any</td><td>Any</td><td>15 mL 팔콘 튜브는 절대 에탄올 및 젖산으로 샘플을 세척하는 동안 세포 길이 측정에 사용되는 샘플을 저장하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Any</td><td>Any</td><td>Eppendorf tubes는 에탄올:아세트산 3:1 (v:v) 용액에서 분열 길이 측정에 사용되는 시료를 보관하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>장갑</td><td></td><td>부식성 시약으로부터 보호하는 모든 라텍스 장갑.</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>모든</td><td></td><td>주의 : 금속 부식성, 카테고리 1 피부 부식, 카테고리 1A, 1B, 1C 심각한 눈 손상, 카테고리 1; 인화성 액체, 카테고리 1,2,3</td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>모든</td><td></td><td>주의: 피부 접촉(자극성), 눈 접촉(자극성), 흡입 시 위험합니다. 피부 접촉(투과기), 섭취 젖산의 경우 약간 위험</td></tr>합니다<tr><td>. >98%</td><td>모든</td><td></td><td>주의: 금속 부식성, 카테고리 1 피부 부식, 카테고리 1A,1B,1C 심각한 눈 손상, 카테고리 1</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>모든</td><td></td><td>주의: 급성 독성(경구, 피부, 흡입), 카테고리 4 피부 자극, 카테고리 2 눈 자극, 카테고리 2 피부 민감성, 카테고리 1 특정 표적 장기 독성 &ndash; 1회 노출, 카테고리 3</td></tr><tr><td>트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 염산염(Tris-HCl)</td><td>모든</td><td></td><td>이 물질은 자극성이 있을 수 있으므로 눈과 피부와의 접촉을 피해야 합니다. 먼지를 흡입하면 호흡기에 자극을 줄 수 있습니다.</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidine-2&prime;-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>DNA</td><td></td><td>에 대한 모든 세포 투과성 형광 마이너 그루브 바인딩 프로브. 피부에 자극을 일으킵니다. 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>얼음</td><td>모든</td><td>NA</td><td>DAPI 솔루션은 얼음 위에 보관해야 합니다.</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>AxioScope A1, Zeiss의 Axiocam ICm1 또는 기타</td><td></td><td>모든 형광 현미경을 사용하여 분열 길이를 결정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td>, <td>어떤</td><td>것이든</td>, 어떤 커버 <td></td></tr><tr><td>유리</td>든지, <td>어떤</td><td></td><td></td></tr> 집게든지, <tr><td></td><td></td><td></td><td>어떤 집게든지, 수확 직후에 말린 옥수수 잎을 펼치기 위해 필요한 모든 집게입니다. 이는 세포 길이와 분열 길이 측정을 위한 적절한 샘플을 자르기 위함입니다.&nbsp;</td></tr><tr>Zeiss <td>NA</td>의 <td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Axiovision(릴리스 4.8)</td><td>소프트웨어는 http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html 에서 다운로드할 수 있습니다. ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/)와 같은 다른 소프트웨어도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DIC</td><td>AxioScope A1, Zeiss의 Axiocam ICm1 또는 기타</td><td></td> 현미경 <td>미분 간섭 대비(DIC)가 장착된 모든 현미경을 사용하여 세포 길이를 측정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>R 통계 분석 소프트웨어</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>NA</td><td>오픈 소스; https://www.r-project.org/ R 스크립트에서 다운로드 할 수 있습니다</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>NA 우리는 Kern Smooth 패키지 (Wand MP, Jones MC.&nbsp; 커널 스무딩: Chapman & Hall/CRC (1995)). 이 스크립트는 Mac 및 Windows에서 교신 저자와 문의하면 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화<em&gt; zea 메이스</em&gt; 잎

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

성장 분석은 식물 과학에서 대조적인 유전자형과 환경 조건의 영향을 조사하는 데 자주 사용됩니다. 이러한 분석의 세포 측면은 성장이 세포 분열과 세포 신장에 의해 주도되기 때문에 매우 중요합니다. 운동학적 분석은 이 두 가지 프로세스를 정량화하는 방법론을 나타냅니다. 또한 이 기술은 비전문 실험실에서 사용하기 쉽습니다. 여기에서는 외떡잎잎식물(Zea mays) 잎에서 운동학적 분석을 수행하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 두 가지 측면이 제시됩니다 : (1) 세포 분열 및 확장 매개 변수의 정량화, 그리고 (2) 발달 영역의 위치 결정. 이는 샘플링 설계의 기초가 될 수 있으며 잎 성장 영역에서 높은 공간 해상도로 생화학 및 분자 측정의 데이터 해석에 유용할 수 있습니다. 옥수수 잎의 성장 영역은 꾸준한 상태에서 수확됩니다. 개별 잎은 DAPI 염색을 사용하여 분열 길이를 측정하고 DIC 현미경을 사용하여 세포 길이를 측정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 성장 영역이 적어도 몇 센티미터에 걸쳐 있는 안정적인 성장 중에 수확된 출현한 외떡잎 잎에 적합합니다. 식물 성장 조절에 대한 이해를 높이려면 성장 및 분자 연구에 대한 데이터를 결합해야 합니다. 따라서 운동학적 분석의 중요한 이점은 분자 수준의 변화를 잘 정의된 세포 발달 단계와 연관시킬 수 있다는 것입니다. 또한 지정된 발달 단계에 대한 보다 집중적인 샘플링을 허용하여 예산이나 시간이 제한된 경우에 유용합니다.

여기, 우리는 그들의 잎 성장의 관점에서 가뭄 스트레스 조건 (가뭄, 34 % SWC)를 실시 잘 급수 설비 (제어, 54 % 토양 수분 함량, (SWC))과 식물 사이의 비교를 나타낸다. 모든 식물은 ° C를 하루 / 밤, 300-400 μEm -2 초 -1 광합성 활성 방사선 (PAR). 가뭄 조건 25 ° C / 18을, 통제 된 조건 (16 시간 일 / 8 시간 밤에서 성장 챔버에서 성장했다 올바른 SWC에 도달 한 후, 추가로 유지 될 때까지 물을 원천에 의해 확립되었다. 예비 연구에있어서, 제 5 판 따라서, 그것은의 리프로 선택되었다. 등장이 스트레스 조건 하에서 처음 개발 한 것으로 정의 된 관심. 마지막 잎 길이 (LL) 가뭄 스트레스 식물의 낮은 LER (표 3)에 기인 잘 물을 식물의 것보다 40 % 낮았다. 레아의 세포 기초를 이해하기F 성장 반응...

세포 분열과 확장을 정량화하는 것은 식물 전체의 성장을 이해하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 옥수수 잎의 성장 속도를 결정하는 세포 매개변수를 계산하는 프로토콜을 제시하고 발달 단계별 샘플링 전략을 지시하여 분자 성장 조절 메커니즘을 조사하기 위해 이러한 데이터를 사용하는 방법을 강조합니다.

세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화<em&gt; ZEA 메이스</em&gt; 잎

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

본 분석의 전반적인 목표는 옥수수 잎 성장의 세포적 기초를 결정하고, 발달 단계별 특정 샘플링 전략을 수행하여 이러한 데이터를 통해 분자적 성장 조절 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 식물 발달 생물학의 핵심 질문인 '세포 분열과 세포 확장이 전체 기관 성장의 차이에 어떻게 기여하는가?'를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 접근 방식을 통해 식물 기관 전체의 성장에 기저가 되는 생화학적 분자 및 생리학적 과정에 대한 조사와 공간적 매핑이 가능합니다. 이 시스템은 옥수수 잎 성장에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 이 기술은 다른 화본과 식물 종 및 기관을 포함한 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.이러한 방법들을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요합니다. 수확, 샘플 분할 및 측정 단계는 이러한 시연 없이는 수행하기 어렵습니다. 절차 시연은 Katrien Sprangers와 Viktoriya Avramova가 진행합니다.저희 실험실의 박사 과정 학생 두 명입니다. 단자엽 식물의 잎 성장에 대한 완전한 운동학적 분석을 수행하려면, 생장실 내의 제어된 조건에서 각 처리구 및 유전형당 최소 15개체 이상의 식물을 재배하십시오. 분석 대상 잎이 나타나면, 잎이 완전히 전개될 때까지 매일 자를 사용하여 토양에서 잎 끝까지의 길이인 잎의 길이를 측정하십시오.관심 있는 발달 단계에서, 분열 조직 부위가 손상되지 않도록 최소 5그루의 대표 식물에서 지상부를 뿌리에 최대한 가깝게 절단합니다. 그런 다음 바깥쪽 잎부터 시작하여 관심 있는 잎이 나올 때까지 모든 잎을 하나씩 조심스럽게 펼칩니다. 필요한 경우 잎을 분리하기 위해 기부에서 몇 밀리미터 정도를 추가로 제거합니다.다음으로, 정단부와 대상 잎에 둘러싸인 작은 잎들을 제거하고, 중륵의 한쪽 면 기부부터 시작하여 잎의 3 cm 세그먼트를 절단합니다. 잎이 줄기와 연결된 바로 그 지점을 절단하는 것이 매우 중요합니다. 너무 높게 절단하면 분열조직의 크기가 실제보다 작게 추정될 수 있기 때문입니다.절단편을 3:2:1 부피비의 절대 에탄올 및 아세트산 용액이 채워진 1.5 milliliter 시험관에 넣고 4 °C에서 24시간부터 최대 수개월 동안 보관하십시오. 정맥의 반대편에서 기저부로부터 11 centimeter 길이의 절단편을 잘라내어, 색소를 제거하기 위해 절대 에탄올이 채워진 15 milliliter 튜브에 넣고 4 °C에서 최소 6시간 동안 보관하십시오. 4 °C의 절대 에탄올에서 24시간 동안 2차 처리한 후, 에탄올을 순수 젖산으로 교체하고 절단편을 4 °C에서 다시 24시간 동안 또는 추가 분석 시까지 보관하십시오.분열 조직을 측정하려면, 먼저 3cm 길이의 잎 절편을 새로 준비한 세척 완충액에 20분 동안 옮겨 둡니다. 배양 시간이 끝나면 절편을 Dapi 염색액이 담긴 용기에 옮겨, 암소의 얼음 위에서 2~5분 동안 둡니다. 그다음 조직을 유리 현미경 슬라이드 위에 빠르게 고정하고, 절편을 커버글라스로 덮습니다.UV 형광을 이용하여 현미경 하에서 표피 세포의 형광을 확인합니다. 그런 다음, 새로운 커버글라스를 덮은 새 현미경 슬라이드 위에 세척 완충액 한 방울을 떨어뜨려 샘플을 마운트합니다. 20배 배율을 사용하여 해당 절편을 다시 현미경으로 관찰하고, 샘플을 훑으며 증식성 유사분열상을 찾습니다.발달 중인 stemmata의 형성적 세포 분열을 피한 후, 가장 말단에 위치한 유사분열상을 정의합니다. 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 이미지 프레임의 전체 길이를 측정합니다. 이 예시에서는 645 micrometer입니다.그런 다음 가장 말단의 mitotic figure부터 잎 기부까지 전체 분열조직 길이를 포함하는 프레임 수를 세고, 이 수에 프레임 하나의 길이를 곱하여 전체 분열조직 길이를 구합니다. 세포 길이 프로파일을 얻으려면 11 cm 세그먼트를 젖산에서 꺼내 벤치로 옮긴 후, 메스로 조직을 1 cm 세그먼트 10개로 자릅니다. 결과물인 잎 세그먼트들을 단일 현미경 슬라이드 위에 올리고 젖산을 한 방울 떨어뜨립니다.모든 조각의 동일한 면이 위로 향하게 배치합니다. 그런 다음, 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 광학 장치가 장착된 현미경 아래로 슬라이드를 옮깁니다. 잎 기부에 가장 가까운 분절부터 시작하여, 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 최소 20개의 반복 표피 세포와 줄기 세포열(stemmatal files)에 직접 인접한 세포열의 길이를 측정함으로써, 각 분절을 따라 동일한 간격의 위치에서 동일한 세포 유형이 일관되게 선택되도록 합니다.잎 전체에 걸쳐 각 측정값에 해당하는 위치를 기록하십시오. 그런 다음, 보충 파일 1로 제공되는 R 스크립트에 구현된 국소 다항식 평활화(local polynomial smoothing) 절차를 사용하여 잎 축을 따라 각 mm에서의 평균 세포 길이를 결정하십시오. 과도하게 평활화되지 않도록 주의하십시오.평활화(smoothing)를 통해 세포 데이터의 노이즈를 제거해야 하며, 곡선의 전체적인 형태에는 영향을 주지 않아야 합니다. 여기에서 충분한 관수를 한 식물과 가뭄 스트레스 조건에 노출된 식물의 잎 성장을 비교하여 보여줍니다. 대조군 식물의 최종 잎 길이는 잎 신장률이 더 낮았기 때문에 가뭄 스트레스를 받은 식물보다 40% 더 짧았습니다.가뭄 스트레스를 받은 식물의 잎 신장률은 세포 생성의 감소로 인해 충분한 수분이 공급된 대조군보다 73% 더 낮습니다. 이는 결과적으로 주로 세포 분열 속도의 감소로 인해 발생합니다. 운동학적 분석은 잎 성장 구역의 위치 지도를 제공하여 분자 및 생화학적 분석을 위한 하위 구역 해상도의 샘플링을 가능하게 합니다.예를 들어, 충분한 관수를 제공한 대조군과 가뭄 조건에 처한 옥수수 잎의 성장 구역을 따라 MDA 정량을 수행한 결과, 수분 제한 조건에 반응하여 성장 구역 전반에서 지질 분해 산물인 MDA가 유의미하게 증가함이 나타났습니다. 가뭄으로 인해 잎의 길이가 짧아졌기 때문에, 본 실험에서 대조군과 스트레스 처리군 식물의 발달 구역은 서로 일치하지 않았습니다. 그러나 세포 길이 프로파일을 이용하면 발달 구역의 길이를 결정할 수 있으며, 이를 통해 각 구역의 MDA 수준을 비교할 수 있습니다.이 기술을 적절하게 수행한다면, 숙련된 후에는 단일 샘플을 4시간 이내에 처리할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 수확 과정 동안 분열조직이 손상되지 않도록 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 성장 조절에 관여하는 분자 및 생화학적 파라미터 측정과 같은 다른 기술들을 적용하여 연구할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 성장 중인 옥수수 잎의 세포 분열과 세포 확장을 정량화하고, 서로 다른 성장 구역의 크기를 결정하며, 그에 따라 분자 및 생화학적 데이터를 해석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 젖산, 아세트산 및 EDTA를 사용하는 것은 위험할 수 있음을 유의하십시오. 따라서 이 절차를 수행할 때는 항상 장갑 착용 및 사용 후 각 단계마다 현미경을 세척하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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