세포 분열 및 확장의 운동 학적 분석 : 성장과 샘플링 발달 영역의 세포 기초의 정량화 ZEA 메이스 잎

이 분석의 전반적인 목표는 옥수수 잎 성장의 세포 기반을 결정하고 이러한 데이터를 사용하여 발달 단계별 샘플링 전략을 수행하여 분자 성장 조절 메커니즘을 조사하는 것입니다. 이 방법은 식물 발생 생물학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 분열과 세포 확장은 전체 장기 성장의 차이에 어떻게 기여합니까?

이 접근 방식을 사용하면 전체 식물 기관의 성장의 기초가 되는 생화학적 분자 및 생리학적 과정에 대한 조사와 공간 매핑을 수행할 수 있습니다. 이 시스템은 옥수수 잎 성장에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 이 기술은 다른 시스템에도 사용할 수 있습니다. 다른 잔디 종 및 기관을 포함합니다.

이러한 방법을 시각적으로 보여주는 것이 중요합니다. 채취 시 시료 bi-blation 및 측정 단계는 이러한 시연 없이는 수행하기 어렵습니다. 절차를 시연하는 사람은 Katrien Sprangers와 Viktoriya Avramova입니다.

제 연구실에서 온 두 명의 박사 과정 학생. 외떡잎식물의 잎 성장에 대한 완전한 체네마틱 분석을 수행하려면 성장실에서 통제된 조건에서 각 처리 및 유전자형에 대해 최소 15개의 식물을 성장시킵니다. 관심 있는 잎이 나타나면 자를 사용하여 잎이 완전히 팽창할 때까지 매일 잎의 길이, 즉 흙에서 잎 끝까지의 길이를 측정합니다.

관심있는 발달 단계에서 분열 영역을 그대로 유지하기 위해 가능한 한 뿌리에 가까운 최소 5 개의 대표 식물에서 식물의 지상 부분을 잘라냅니다. 그런 다음 바깥쪽 잎에서 시작하여 관심 있는 잎까지 모든 잎을 하나씩 부드럽게 펼칩니다. 필요에 따라 잎을 분리하기 위해 바닥에서 몇 밀리미터를 더 제거합니다.

다음으로, 관심있는 잎으로 둘러싸인 정점과 작은 잎을 제거하고 중간 정맥의 한쪽 면에있는 바닥에서 시작하여 잎에서 3cm 세그먼트를 자릅니다. 잎이 줄기에 연결된 바로 그 부분을 자르는 것이 중요합니다. 높은 곳으로 자르면 분열의 크기가 과소 평가됩니다.

세그먼트를 1.5 밀리리터 시험관에 보관하고, 3 2 1 부피 x 부피 절대 에탄올 아세트산 용액으로 채워진 섭씨 4도에서 24 시간 동안 최대 몇 개월 동안 보관하십시오. 정맥의 다른 쪽에서 바닥에서 11cm 분절을 자르고이 분절을이 절대 에탄올로 채워진 15 밀리리터 튜브에 섭씨 4 도에서 최소 6 시간 동안 보관하여 색소를 제거합니다. 섭씨 4도의 절대 에탄올에서 두 번째 24시간 라운드 후 에탄올을 순수한 젖산으로 교체하고 세그먼트를 섭씨 4도에서 다시 24시간 동안 또는 추가 분석이 있을 때까지 보관합니다.

분열체를 측정하려면 먼저 3cm 잎 부분을 갓 준비한 헹굼 버퍼에 20분 동안 옮깁니다. 배양이 끝나면 세그먼트를 Dapi 염색 용액 용기에 넣고 어둠 속에서 얼음 위에서 2-5 분 동안 옮깁니다. 그런 다음 조직을 유리 현미경 슬라이드에 빠르게 장착하고 커버 유리로 세그먼트를 덮습니다.

UV 형광을 사용하여 현미경으로 표피 세포의 형광을 확인합니다. 그런 다음 새 유리 덮개가 있는 새 현미경 슬라이드의 헹굼 버퍼 한 방울에 샘플을 장착합니다. 20배 배율을 사용하여 세그먼트를 현미경으로 되돌리고 샘플을 스크롤하여 증식성 유사분열 수치를 찾습니다.

발달 중인 줄기세포의 형성 세포 분열을 피하고, 가장 원위부의 유사분열 도형이 어디에 위치하는지 정의하십시오. 그리고 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여, 심상 구조의 전체 길이를 측정하십시오. 이 예에서는 645마이크로미터입니다.

그런 다음 가장 원위부의 유사분열 도형에서 잎 기저부까지의 전체 분열 길이를 포함하는 프레임의 수를 세고 이 숫자에 한 프레임의 길이를 곱하여 전체 분열 길이를 얻습니다. 세포 길이 프로파일을 얻으려면 젖산에서 11cm 세그먼트를 벤치로 옮기고 메스를 사용하여 조직을 10개의 1cm 세그먼트로 자릅니다. 이렇게 생성된 잎 분절을 단일 현미경 슬라이드와 작은 젖산 방울에 장착합니다.

같은 면이 위로 향하게 모든 조각을 놓습니다. 그런 다음 미분 간섭 대비 광학 장치가 장착된 현미경 아래로 슬라이드를 옮깁니다. 잎 기저부에 가장 가까운 분절부터 시작하여 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램을 사용하여 최소 20개의 복제 표피 세포 및 줄기 세포 파일에 바로 인접한 파일의 길이를 측정하여 각 분절을 따라 동일한 간격의 위치에서 동일한 세포 유형을 일관되게 선택할 수

잎 전체의 각 측정에 대한 해당 위치를 바로 잡아야 합니다. 그런 다음 보충 파일 1로 사용할 수 있는 R 스크립트로 구현된 로컬 다항식 평활화 절차를 사용하여 잎 축을 따라 각 밀리미터의 평균 셀 길이를 결정합니다. 과도하게 매끄럽게 하지 않도록 주의하세요.

평활화는 셀 데이터의 노이즈를 제거해야 하지만 곡선의 전체 모양에는 영향을 주지 않아야 합니다. 여기에서는 물을 잘 주는 식물과 가뭄 스트레스 조건에 노출된 식물의 잎 성장 측면을 비교한 것입니다. 대조 식물의 최종 잎 길이는 잎 신장률이 낮기 때문에 가뭄 스트레스를 받은 식물보다 40% 낮았습니다.

가뭄에 스트레스를 받은 식물의 잎 신장률은 세포 생산이 감소하기 때문에 물을 잘 주는 대조군보다 73% 낮습니다. 제비갈매기에서는 주로 세포 분열 속도가 감소하여 발생합니다. 운동학적 분석은 잎 성장 영역의 위치 파악에 대한 지도를 제공하여 분자 및 생화학 분석을 위한 하위 구역 해상도로 샘플링할 수 있습니다.

예를 들어, 물을 잘 공급받고 가뭄 상태에 시달리는 식물에서 옥수수 잎의 성장 영역을 따라 MDA 정량화는 물을 보류하는 조건에 대한 반응으로 성장 영역 전체에서 이 지질 분해 생성물이 크게 증가했음을 보여줍니다. 가뭄에 대한 반응으로 잎이 짧아졌기 때문에 이 실험에서 발달 영역은 대조군과 스트레스를 받은 식물에 일치하지 않았습니다. 그러나 세포 길이 프로파일을 사용하여 발달 영역의 길이를 결정할 수 있으므로 개별 영역의 MDA 수준을 비교할 수 있습니다.

일단 마스터링되면 기술이 적절하게 수행되면 단일 샘플을 4시간 내에 처리할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 수확하는 동안 분열체를 그대로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분자 및 생화학적 매개변수의 결정과 같은 다른 기술을 적용하여 성장 조절에 대한 관여를 연구할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 성장하는 옥수수 잎에서 세포 분열 및 세포 확장을 정량화하고, 다양한 성장 영역의 크기를 결정하고, 그에 따라 분자 및 생화학 데이터를 해석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 젖산과 아세트산, EDTA를 사용하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 따라서 장갑을 착용하고 각 단계마다 현미경을 청소하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.tage 사용 후 이 절차를 수행할 때는 항상 조치를 취해야 합니다.