Name: 복구 시간 증가 및 제한 염증 반응에서 미주 신경 자극 메커니즘을 연구에 LPS 관리를 감소 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 학습하세요 미주 신경 자극 수술 기법을 통해 콜린성 항염증 경로의 신경면역학적 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 염증 반응을 분석하고 신경-면역계 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴 류머티즘 협회, 카롤린스카 연구소 재단, 스톡홀름 카운티 의회, 발렌베리 재단 및 GV 80년 재단의 지원을 받았습니다. 저자는 또한 원고를 교정해 준 Hannah Aucott에게 감사를 표합니다.

모든 동물 실험은 관리 및 카롤린스카 연구소, 스톡홀름에서 현지 윤리위원회의 승인을 동물의 사용 지침에 따라 수행 하였다. 지역 윤리위원회는 동물 보호에 관한 유럽 연합 지침을 따른다. 주 : 수술 (6 시간 내지 1 대) 및 LPS의 레벨 (15 밀리그램 / kg 대 2 밀리그램 / kg)를 주입 한 후 원래의 프로토콜에서의 주요 변화는 복구 시간이다. 그렇지 않으면, 수술 자체에 관련된 다른 설정이 변경되지 않았습니다. 1. 자극에 대한 자료를 준비 <ol><li> 컴퓨터와 자극 전극 (도 1A)에 연결된 데이터 수집 시스템 켜기. </li><li> 인정 인 프로그램을 시작합니다. </li><li> 5 밀리그램 / 1X PBS에 mL를 분취하여 농도의 LPS의 스톡 용액을 준비하고 -20 ℃에서 보관. 실험의 날, 나누어지는을 해동하고 에이드를 준비중량에 따라, 동물에 약 100 μL를 주입하기 위해 LPS (0.5 ㎎ / ㎖)의 quate 샘플. </li></ol> 2. 마취에 대한 동물 준비 <ol><li> C57BL / 6 마우스를 사용합니다. , 12 시간 빛 / 어둠주기와 기후의 조건을 유지 그들에게 표준 설치류 식사를 공급하고, 그들에게 임의 량의 물을 제공합니다. </li><li> 실험의 날에 약 25g 무게 쥐에 수술을 수행합니다. 참고 : 염증 반응이 유발되는 경우,이 정기 검진과 동물 임상 반응의 관찰을 수행하는 것이 특히 중요하다. 동물의 조건이 윤리적 기준을 충족하지 않는 경우 CO 2 흡입 조기 안락사가 필요합니다. </li><li> 마취 기계를 설정합니다. <ol><li> 튜브가 제대로 연결되어 있고 손상되지 않았는지 확인합니다. 통풍 영역이 제대로 작동하는지 확인합니다. 이소 플루 란 병에 키 필터를 연결하고 VAPO을 채우기이소 플루 란 충분한 양 rizer. </li><li> 가스 공급 (공기와 산소)를 열고 병 실험에 대한 충분한 가스를 포함하고 있는지 확인하십시오. 삼원 커넥터는 유도 챔버 또는 마스크에 이소 플루 란 흐름을 전송할 수있다. </li></ol></li><li> 유도 챔버에 삼원 커넥터를 돌립니다. 홈 케이지에서 하나의 마우스를 선택하고 챔버로 동물을 삽입합니다. 1.0 L / 분의 산소 및 1.0 L / 분으로 공기 유동 조절기를 조정. 5 % - 4로 이소 플루 란 농도를 조정합니다. </li><li> 마취의 원하는 레벨에 도달하면, 마취 원하는 레벨에 도달하면, 외과 영역을 면도하고, 마스크 챔버로부터 동물을 이동. 마스크 흐름에 세 방향 커넥터를 돌립니다. 0.25 L / 분의 산소 및 0.25 L / 분으로 공기 유동 조절기를 조정. <ol><li> 2.5 % - 1.5로 이소 플루 란 농도를 조정합니다. 수술 procedur을 시작하기 전에 반사 제어 및 호흡에 의한 마취의 수준을 확인이자형. </li></ol></li><li> 접착 테이프를 사용하여 작업 벤치에 마우스의 다리를 고정합니다. 동물의 코는 여전히 신중하게 마스크에 위치되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 미주 신경 3. 수술 및 자극 <ol><li> 70 % 에탄올로 수술 영역을 소독. </li><li> 메스를 사용하여 조심스럽게 목 (약 1 ~ 1.5 cm의 절개)의 수준에서 피부를 절개. 참고 : 프로토콜에서, 수술 절차가 SHAM-운영하는 동물 여기를 종료합니다. 사실, 단지 금속 도구 신경을 터치하면 이미 어느 정도를 촉진하는 것이 밝혀졌다. LPS의 소량을 사용하는 경우 따라서,보다 정확한 수술 제어 동물을 얻기 위해,이 단계에서 수술을 중지합니다. </li><li> 현미경 (12.5X 목적)의 도움으로, 해부 집게를 사용 경동맥에서 좌측 미주 신경을 분리. 먼저 피부와 지방이 층을 제거하여 흉쇄 근육을 찾은 다음에 그것을 철회신경과 동맥 모두 뒤에 집게를 넣어 주문. 주 : 신경과 혈관이 서로 밀접하게 부착되어, 상기 다음 공정이 매우 까다 롭다. 따라서, 선박을 절감하고 동물을 죽이는 것은 매우 쉽습니다. 그러나, 신경 및 동맥 사이에 매우 신중하게 집게를 배치하여, 그들은 결국 분리, 그리고 신경을 분리하는 것이 가능하다. </li><li> 미주 신경 아래의 전극 (도 1b)를 놓는다. 바늘 전극은 매우 긴, 그래서 신경이 자극 동안 약간 이동하더라도, 그것은 항상 전극과 접촉 할 것이다. </li><li> (사이토 카인 수준에 대한 판독을위한, 즉, 하향 조절 효과를 측정하기 위해) 주사기의 도움 LPS의 복강 내 (IP) 주입 (2 밀리그램 / kg)을 수행한다. </li><li> 자극을 시작하기 전에 5 분을 기다립니다. </li><li> 인정 인 프로그램의 시작 버튼을 눌러 5 V 및 1 Hz에서 5 분 동안 미주 신경을 자극한다. </li><li> 레전극을 이동 외과 용 봉합 실을 가진 동물의 상처 봉합. </li><li> 순서 치유를 개선하고 감염으로부터 보호하기에 상처에 없음 스팅 배리어 필름 (NSBF)를 스프레이. </li></ol> 동물의 4. 복구 <ol><li> 수술 후, 각성 및 복구를 위해 다시 집 케이지에 동물을 이동합니다. 체온을 유지하기 위해 적외선 빛에 따라, 전체 의식이 회복 될 때까지 동물을 모니터링해야합니다. </li><li> 동물이 분석을 위해 희생하기 전에 6 시간 동안 새장에 복구 할 수 있습니다. 주 : 미주 신경 자극의 효과는 매우 고속이고 또한 (48 시간까지) 지속되는 긴 것으로 도시되어 있으므로 복구 시간은 연구의 필요에 따라 실험에 의해 설정 될 수있다. </li></ol> 추가 분석을 위해 희생 5. <ol><li> 공동 2 관리 장치에 연결된 장에 동물을 놓는다. </li><li> 5에서 장치를 설정CO 2 흡입라는 우수한 성능을 나타내었다주기. </li><li> 안락사가 완료되면, 관심의 장기를 수집하고 직접 추가 분석을 위해 드라이 아이스에 그들을 동결 (예를 들어, 마우스 TH1을 사용하여 비장 추출물에서 사이토 카인 수준의 측정 / TH2 9 플렉스 분석) 3. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

2000 년대 초반의 발견 이후, CAP의 메커니즘을 철저하게 연구되고있다. 우리는 지금 경로의 좋은 사진을 가지고 있고, 특히, 대상 기관, 비장, 매우 효율적인 팀으로 NE, 메모리 T 세포, 이크, 대 식세포 작업은 염증 매개 2 다운 조절하는 곳. 우리는 또한 최근에 분명히 CAP 3의 활성화 후 비장에서 아세틸 콜린의 방출을위한 필수 구성 요소, 특히 마우스의 기능 프로스타글란딘 시스템의 중요성, PGE 2, 데이터를 발표했다. 미주 신경 자극으로 알려진 실험 기술은 쉽게 실험실에서 수행 될 수 있지만, 몇 가지 중요한 프로토콜은 동물과 수술 절차에 대한 준수해야합니다. 우리는 전기 요금을 구축 방지하기 위해, &quot;충전 균형&quot;자극이 있어야하는데 정현파 자극 신호를 사용(단상 자극 반대)을 파괴 할 수있는 신경. 신경을 자극하는 반면, 단지 vago...

선천성 면역은 유기체의 넓은 범위에서 감염과 질병에 대한 방어의 즉각적인 첫 번째 라인을 제공합니다. 그것은 위협을 제거하기 위해 차 면역 반응을 시작 할뿐 아니라 활성화하고 병원균 고유의 방식으로 차 면역 반응을 수행하는 후천성 면역 교육에 중추적 인 역할을한다. 염증은 다시 감염 부위에 다른 면역 세포를 유치 할 수있는 능력을 가지고 같은 발적, 부종, 통증, 기능의 손실 및 발열과 같은 염증의 추기경 표지판을 유도하는 사이토 카인과 케모카인의 과다에 의해 조율한다 . 기간과 염증의 강도는 여러 가지 요인에 따라 달라집니다,하지만 염증을 해결하고 항상성을 회복하는 만성 염증성 질환의 발병을 방지하기 위해 중요한 단계입니다. 신경 과학 및 면역학 분야의 최근 발전 infl을 제어하는 ​​엄청난 치료 가능성과 특정 신경 메커니즘을 풀어 한중추 신경계 및 주변의 ammation. 이들 메커니즘 중 하나는 자율 신경계 (4, 5)에 의해 구동되는 염증성 반사적으로 알려진 콜린성 소염 통로 (CAP)이다. 현재 염증 매개체는 중추 신경계 염증의 상태에 관한 신호를 감각 신경을 활성화하고 전송할 것으로 생각된다. 반사 응답은 원심성 미주 신경을 통해 작동된다. 캡의 해부학 적 세부 사항에 대한 광범위한 연구는 두 개의 신경으로 구성 부교감 - 교감 모델, 미주 신경 및 비장 신경 각각 6을 공개했다. 카프에서 활성화 콜린성 원심성 미주 신경은 아직 탐구하는기구에 의해 비장 아드레날린 신경의 활성화의 결과로, 복강 신경절-장간막에서 끝난다. 따라서 활성화 된 비장 신경, 내측으로 알려져흰색 펄프의 면역 세포에 근접, 한계 영역 및 CAP (7), (8)의 비장, 원금과 필수 기관의 빨간 펄프에서 되어진. 비장 신경 말단에서 노르 에피네프린 (NE)의 비장 T 림프구상에서 발현 해당 β 2 아드레날린 수용체에 결합한다. 이것은 차례로함으로써 사이토 카인 생성 및 염증이 제한 식세포 α7 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 (α7nACh)를 활성화 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (하는 ChAT) - 매개 성 아세틸 콜린 (ACH) 방출을 유도한다. 결과적으로, 신경계는 말초 조직에 염증을 조절하는 지역 면역 항상성을 복원 할 수 있는지 지금은 분명하다. 통로의 이름에서 알 수 있듯이, 아세틸 콜린 시스템이 신경 면역 조절 경로의 기능에 중앙 중요하다. 흥미롭게도, 메커니즘의 활성화에 관여캡 주변부 및 중추 신경계에서 다른 것처럼 보인다. 비장의 니코틴 수용체의 중요성 (α7nAChR)가 이전 9 입증되었지만, 무스 카린 수용체 (mAChR)는 경로 (10), (11)의 중앙 활성화를위한 필수입니다. 치명적인 뮤린 패혈증 동안 최근 중앙에 작용하는 M1 무스 카린 성 작용제의 말초 투여가 현저히 억제 혈청 비장 종양 괴사 인자 α (TNFα), (12) 신호 그대로 미주 신경 및 신경 비장 필요한 액션. 우리는 또한 프로스타글란딘 E이 결핍 된 마우스 (PGE 2) 미주 신경 자극에 응답 할 수 없었다 혈청과 비장 3 사이토 카인의 LPS 유도 방출을 다운 조절하지 않았다는 것을 최근에 보여 주었다. 따라서 CAP은 주요 아세틸 콜린의 pathw 이외의 다른 시스템에 의해 규제 될 수있다찬성. 미주 신경 때문에 체내에서의 방황 물론 같은 지명되었다, 간, 폐, 비장, 신장 및 창자 (13)를 포함한 주요 기관을 지배하는. 이 큰 신경 분포 및 미주 신경의 매우 강력한 면역 억제 효과를 고려하여, 캡의 치료 가능성은 염증 상태의 넓은 범위를 커버 할 수있다. 어떤 약물은 신체에 추가되지으로 미주 신경은 전기적 (또는 기계적) 통상적 인 처리의 전압 및 주파수와 반대로 제어하여, 활성화 될 수있다. 시험은 만성 염증 (14) 치료에 VNS의 임상 적 의의를 테스트하기 위해, 예를 들어, 류마티스 환자에서 현재 진행되고 있습니다. 전부, 신경 - 면역 통신 및 염증의 조절은 기존의 치료에 대한 가능한 대안 치료를 제공 할 것이다 조사 중이다. 따라서, 미주 신경의 분석 stimulation 개의 서로 다른 분포하는 장기 효과하지만 만성 염증의 동물 모델에서 잠재적 인 치료 행동의도 특성은, 확실히 통찰력을 제공하고 새로운 잠재적 인 치료 목표에 대한 희망 것이다. 트레이시 동료 (4)에 의해 개발 된 기존 방법 때문에 (LPS의 치사량) 염증 반응의 자극을 넘어선 및 CAP 활성화 및 판독 사이에 너무 짧은 시간 범위에 조사 우리 필드 전치 수 없었다. 본 논문에서는, 원래의 프로토콜에 대한 변경을 제시한다 사이토킨 수준의 두 가지 방법을 비교하여 표적 기관 (비장)에 대향하는 새로운 관찰을 강조.

<table><tbody><tr><td>컴퓨터</td><td>도시바</td> <td>-</td> <td>모든 컴퓨터는 실제로 호환 가능</td></tr><tr><td>MP-150 데이터 수집 시스템</td><td>Biopac 시스템</td><td>MP150WSW</td><td></td></tr><tr><td>인증 소프트웨어</td><td>Biopac 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 C57Bl/6</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마취 기계</td><td>Simtec Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>의료 산소 병</td><td>AGA</td><td>107563</td><td></td></tr><tr><td>의료용 공기 병&nbsp;</td><td>AGA</td><td>108639</td><td></td></tr><tr><td>Vetflurane (1,000 mg/g)</td><td>Virbac</td><td>137317</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Merck Millipore</td><td>1024060080</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td> 사용된 농도 주사기에 <td>대해 10배 희석됨</td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>바늘 23 G</td><td>KD-FINE</td><td></td><td>900284 0.6 x 30 mm (파란색)</td></tr><tr><td>미세 해부 겸자 (곡선)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>외과 봉합사 4-0</td><td>Ethicon</td><td>G667G</td><td></td></tr><tr><td>안락사 유닛</td><td>Euthanex Smartbox</td><td>EA-32000</td><td></td></tr><tr><td>Cavilon No Sting Barrier Film</td><td>3M Health Care</td><td>3346N</td><td></td></tr><tr><td>TH1/TH2 9-Plex 분석, 초고감도 키트</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15013C-1</td><td></td></tr><tr><td>자극 전극 장치</td><td>Biopac Systems</td><td>STIMSOC</td><td></td></tr><tr><td>Aesculap Isis 면도기</td><td>Agnthos</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>R70</td><td></td><td></td><td>스웨덴 스톡홀름 Lantmannen의 설치류 다이어트</td></tr></tbody></table>

복구 시간 증가 및 제한 염증 반응에서 미주 신경 자극 메커니즘을 연구에 lps 관리를 감소

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

염증은 활성화된 대식세포, 단핵구, 그리고 사이토카인과 다른 염증 매개체를 방출하는 다른 면역 세포에 의해 매개되는 감염 및 조직 손상에 대한 국소 반응입니다. 오랫동안 체액성 및 세포 메커니즘은 면역 반응을 조절하는 역할에 대해 연구되어 왔지만, 최근 면역학 및 신경 과학 분야의 발전으로 흥미로운 치료 잠재력을 가진 특정 신경 메커니즘도 밝혀졌습니다. 이른바 콜린성 항염증 경로(CAP)는 선천성 면역 반응과 염증을 매우 강력한 방식으로 조절하는 것으로 알려져 있습니다. 2000년대 초반, 트레이시와 공동 연구자들은 미주신경을 자극하고 경로의 효과를 모방하는 기술을 개발했다. 이 방법론은 심박수 변동성의 조절 완화와 같은 과도한 자극의 부작용을 피하기 위해 낮은 전압 및 주파수에서 미주 신경의 전기 자극을 기반으로 합니다. 이제 자극을 위한 전기 장치를 사용할 수 있으므로 실험실에서 방법론을 쉽게 설정할 수 있습니다. 이 연구의 목표는 CAP에 프로스타글란딘이 관여할 가능성을 조사하는 것이었습니다. 불행히도, 이전의 시도에 따르면, 유도된 염증 반응이 너무 높거나 효소 대사 특성에 적합하지 않았기 때문에 원래 프로토콜을 사용하지 못했습니다. 기존 수술 프로토콜의 다른 설정은 대부분 변하지 않았지만, 염증 유도에 관한 조건과 희생 전 시점은 우리의 목적에 맞게 개선되었습니다(즉, 보다 제한된 염증 반응에 대한 CAP의 관여를 조사하기 위해). 
여기에 제시된 원래 프로토콜의 수정된 버전에는 미주신경 자극과 분석 사이의 더 긴 시간 범위가 포함되어 있으며, 이는 염증 반응의 낮은 유도와 관련이 있습니다. 또한, 주사할 지질다당류(LPS)의 수치를 낮추는 한편, 비장의 기계론적 특성에 관한 새로운 관찰 결과도 발견했습니다.

TNFα 및 인터루킨-1β (IL-1β)의 수준 LPS의 용량을 수술 후 시간 경과 증가 및 감소 후 이전에 나타낸 바와 같이, 원래의 프로토콜을 사용 VNS는 TNFα의 수준 및 IL-1β (360.0 ± 40.21 PG / 밀리그램 (39.7 ± 10.8 PG / VNS에서 ㎎, p &lt;0.001 대 SHAM에서 169.3 ± 24.9 PG / ㎎) 감소 LPS를 복강 내 주사 (15 ㎎ / ㎏) (도 2A) 후의 비장 VNS에서 191.7 ± 27.2 PG / ㎎, p &lt;0.01)에 비해 SHAM. 1 내지 6 시간에 분석 시간을 변경하고 15 내지 2 ㎎ / ㎏으로 LPS 용량을 감소하면, 우리는 TNFα에 VNS의 효과를 관찰 (에서는 8.82 ± 1.20 PG / mg의 대 SHAM에서 ㎎ / 13.67 ± 1.81...

미주신경 자극은 말초 염증을 감소시키는 데 강력한 효능이 있는 것으로 입증되었습니다. 여기에서는 제한된 염증 반응에서 콜린성 항염증 기전을 추가로 검사할 수 있는 수정된 미주신경 자극 프로토콜을 제시합니다.

복구 시간 증가 및 제한 염증 반응에서 미주 신경 자극 메커니즘을 연구에 LPS 관리를 감소

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

이 외과적 개입의 전반적인 목표는 염증성 상태에서 미주신경 자극의 효과를 관찰하는 것입니다. 소위 콜린성 항염증 경로에 관여하는 다양한 메커니즘과 세포를 분석하고 이해합니다. 이 방법은 파인스타인 연구소(Feinstein Institute)의 케빈 트레이시(Kevin Tracey) 연구실에서 개발되었습니다.이 방법은 신경면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 최근의 발전으로 신경계와 면역계가 밀접하게 연결되어 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 실험실에서 쉽게 설정할 수 있다는 것입니다.그러나 동물 관리 및 수술 프로토콜에 관한 중요한 규칙을 따라야 합니다. 미주신경이 몸 전체를 돌아다니며 다양한 동물 모델에서 정보를 하향 조절하는 능력은 미주신경의 자극이 많은 염증성 질환의 치료에 유용할 수 있음을 암시합니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 현미경 관찰 하에 경동맥에서 미주신경을 식별하고 분리하는 데 어려움을 겪을 것입니다.그러나 처음에는 까다롭지만 시간과 연습이 끝나면 더 쉬워집니다. 컴퓨터와 자극 전극에 연결된 데이터 수집 시스템을 켜는 것으로 시작합니다. 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 실행합니다.그런 다음 리포다당류 밀리리터당 5밀리그램 또는 LPS의 분취액을 따르고 식염수와 함께 밀리리터당 5밀리그램을 0점으로 희석합니다. 유도실에서 25g 마우스를 마취합니다. 원하는 마취 수준에 도달하면 동물을 챔버에서 마스크로 옮깁니다.3방향 커넥터를 돌려 마스크에 공급하고 유량 조절기를 조정합니다. 수술 절차를 시작하기 전에 오른쪽 반사 작용의 상실과 분당 약 100번의 규칙적인 호흡 수로 마취 평면을 확인하십시오. 마우스가 제대로 마취되면 접착 테이프로 마우스 다리를 작업대에 고정합니다.동물의 코가 여전히 마스크 안에 조심스럽게 위치하는지 확인하십시오. 승인된 절차에 따라 수술 부위를 적절하게 소독하십시오. 그런 다음 목 높이의 피부를 1-1점 5cm 절개한 후 12점 5x 대물렌즈가 있는 실체 현미경을 배치하여 수술 부위를 확인합니다.집게로 피부와 지방층을 제거하여 흉쇄유돌근을 찾습니다. 흉쇄유돌근을 수축시키고 겸자를 왼쪽 미주신경과 경동맥 뒤로 움직입니다. 신경과 동맥 사이에 집게를 매우 조심스럽게 놓아 동맥에서 신경을 분리하십시오.이것은 신경과 동맥이 서로 가깝기 때문에 혈관을 자르고 동물을 죽이는 것이 매우 쉽기 때문에 절차에서 중요한 단계입니다. 그러나 신경과 동

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

학습하세요 미주 신경 자극 수술 기법을 통해 콜린성 항염증 경로의 신경면역학적 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 염증 반응을 분석하고 신경-면역계 상호작용을 이해하는 데 활용됩니다.

복구 시간 증가 및 제한 염증 반응에서 미주 신경 자극 메커니즘을 연구에 LPS 관리를 감소

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