Name: 미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 배우세요 미생물 옵토제네틱스 연구를 위한 연속 배양 시스템 구축 방법을 실시간 자동 측정으로 다양한 광 노출 조건에서 유전자 발현 역학을 분석하여 대사 공학 및 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 도움이 토론과 편집을위한 프로토콜, 키 에런 스위니 테스트에 도움이 몰리 라자 베로니카 델가도를 인정, 그리고 원고의 중요한 읽기 테일러 스콧, 내 한 - adirekkun, 그리고 스테파니 겔러 것이다. 메건 니콜 소매점을, 박사 버로우즈 웰컴 기금에서 과학 인터페이스에서 경력 상을 보유하고있다.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 마음의 유연성이 장치를 설계했습니다. 사용 된 모든 코드는 무료이며 오픈 소스입니다. 세그먼트 셀 기본 이미지 분석 과정은 간단하고 신속하게 실행. 사용자 분석, 피지 그래픽 유저 인터페이스로 대표 화상을 분석하는으로 Beanshell 스크립트 입력을 변환하고 스크립트를 호출하는 플러그인을 설정하는 동안 사용자 입력을 기록함으로써 구현 될 수있다. 이 호출 될 때,이 스크립트는 배경-감산 이미지의 가장 최근의 세트에 파일 경로를 포함하는 &quot;이미지&quot;라는 문자열 배열을 전송됩니다. 이미지 데이터는 실험이 갑자기 끝나는 경우가 손실되지 않도록 수집로 저장됩니다. 블루 LED 어레이 우리 optogenetic 시스템을 유도하는 선택되었다 있지만 다른 색의 LED로 교체 될 수있다. 쉽게 만드는 PCB에 추가적인 MOSFET 스위치 및 릴레이 스위치 용 마이크로 컨트롤러뿐만 아니라 관통 구멍을 사용 가능한 추가 입력 및 출력 핀이있다이 시스템에 대해 좀 더 복잡한 용도에 적합합니다. 예를 들면, LED에 전력을...

Optogenetic 시스템은 유전자 발현, 1, 2, 3, 4, 5 단백질 지역화 육 단백질 활성, 6, 7, 8, 단백질 결합, 8, 9, 10, 단백질 분해 등의 세포 과정의 성장 목록을 제어하는 광을 사용한다. 프로그래밍 광 자극으로 제어 된 환경에서 세포를 배양하고, 생물학적으로 중요한 시간 척도에 걸쳐 반응을 측정하기위한 방법 (11)은 세포 생물학 및 생명 공학 연구를 위해 이러한 도구의 전위를 이용하는 것이 필요하다. 우리의 방법은, AE, 잘 혼합에 일정한 세포의 성장 속도를 유지하기 chemostasis 활용평가 및 프로그램 조명에 노출되는 온도 조절 유리 배양 용기 (12, 13). 역 현미경 배양 유출 화상에서는 개별 셀이 프로그래밍 된 조명에 문화의 반응을 측정한다. 형광 강도 및 유출 세포 배양의 세포 형태는 사용자의 입력없이 여러 날에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 이미지, 이미지 분석은 완전 자동화된다. 이 프로토콜은 성장하는 세포 배양과 현미경 익숙한 대부분 실험실에서 구현 될 수 있으며, 사용되는 장치는, 저렴하고 용이하게 가능한 구성 요소했다. 투명 배양 용기 광의 1 μW / cm 2 mW의 -10 / cm이 발광 가능한 발광 다이오드 (LED)의 행렬 위에 배치된다. 미생물 연속 배양 용기에서 성장된다; 하나의 연동 펌프는에 미디어를 추가하는 데 사용됩니다희석 비율은 다른들은 현미경 낮은 속도로 배양을 인출하는 데 사용되며, 그 차이는 오버 플로우 출구를 통해 빠져. 가열 패드 온도를 유지합니다. 공기는 연속적으로 양압을 유지할뿐만 아니라, 혼합 배양을 통기 배양 용기에 펌핑된다. 공기 펌프를 제외하고,이 장치의 전원은 온도계와 연결된 데스크탑 컴퓨터로부터 입력을 수신하는 마이크로 컴퓨터에 의해 조절된다. 유출 세포 배양은 거꾸로 현미경의 무대에서 미세 유체 장치로 펌핑된다. 비 형광 및 형광 이미지가 자동으로됩니다. 이미지 내의 셀은 ROI (region of interest)를 각 셀의 위치를 ​​각 ROI의 특성을 측정하는 알고리즘을 특징으로한다. 이 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 푸른 빛 responsi으로 설계 사카로 마이 세스 세레 비지 세포의 변화하는 빛의 강도에 대한 응답을 측정형광 단백질의 전사를 제어하는 ​​시스템 optogenetic했습니다. 이 시스템에서 유전자 발현을 제어하기위한 여러 optogenetic 시스템이 이미 14, 15, 16가 존재하기 때문에 통상적으로 빵 효모 S. cerevisiae의 알려진이 선택되었다. 또한,이 모델 생물은 일반적으로 시스템 생물학 (17)과 생명 공학 응용 프로그램을 18, 19, 20 섀시로 연구에 사용됩니다. 우리의 대표적인 결과가이 프로토콜은 입력 광 강도를 변화 형광 리포터의 생산을 측정함으로써 복수 일 배양의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>광범위한 랩 매뉴얼</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>정기적으로 업데이트되는 광범위한 랩 매뉴얼은 " 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). 여기에는 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되는 미세유체 주형에 대한 설명도 포함됩니다.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>.fzz 유형 회로 기판 설계를 보고 편집할 수 있는 무료 오픈 소스 소프트웨어는 "http://fritzing.org/download/"</td></tr><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - 조립)</td><td>Adafruit</td><td>50</td> 마이크로컨트롤러에서 사용할 수 있습니다<td>. 1 필요.</td></tr><tr><td>Arduino 적층형 헤더 키트SparkFun</td><td>Electronics</td><td>10007</td><td>PCB를 마이크로컨트롤러에 연결하기 위한 암 핀 헤더입니다.1개 필요.</td></tr><tr><td>조정 가능한 30W 110V 납땜 인두 - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>PCB에 전기 연결을 위해 사용됩니다. 1 필요.</td></tr><tr><td>납땜 인두 스탠드</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>PCB에 전기 연결을 위한 것입니다. 1이 필요합니다.</td></tr><tr><td>미니 솔더 스풀 - 60/40 리드 로진 코어 솔더 0.031" 직경 - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>PCB에 전기 연결을 하기 위해. 1 필요.</td></tr><tr><td>0.1 &뮤; F 커패시터</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>PCB의 전압을 안정화합니다. 1이 필요합니다.</td></tr><tr><td>10 &뮤; F 커패시터</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>PCB의 전압을 안정화합니다. 1이 필요합니다.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LED 매트릭스/디지트 디스플레이 드라이버 - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LED 드라이버. 1개 필요.</td></tr><tr><td>8핀 IC 소켓</td><td>마우저 전자</td><td>575-144308</td><td>16 필요. 이들은 LED 매트릭스 위의 배양 용기를 지지하기 위해 서로 겹쳐서 쌓일 것입니다.</td></tr><tr><td>24핀 IC 소켓</td><td>마우저 전자</td><td>535-24-3518-10</td><td>옵션. 이를 사용하여 MAXIM 7219CNG 드라이버를 PCB에 역방향으로 연결할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디지털 멀티미터</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>전자 제품 문제 해결용. 1 필요.</td></tr><tr>분리 헤더 - 인쇄 회로 기판에 연결된 LED 매트릭스용 <td>40핀 수(긴 중심, PTH, 0.1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>수 핀 헤더입니다. 끝은 와이어 커터로 트리밍할 수 있습니다. 1 세트가 필요합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>플러시 대각선 와이어 커터</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>긴 핀 헤더를 트리밍하고 전원 케이블을 절단합니다. 1 필요.</td></tr><tr><td>프리미엄 여성/여성 점퍼 와이어 - 40 x 12" (300mm)</td>브레드보드를 LED 매트릭스에 연결하기 위한 <td>Adafruit</td><td>793</td><td>와이어 리본. 더 길기 위해 수 핀 헤더와 종단 간 연결할 수 있습니다. 1개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>절반 크기 브레드보드</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>LED 매트릭스가 여기에 연결되고 배양 용기가 그 위에 놓입니다.</td></tr><tr><td>미니어처 8x8 블루 LED 매트릭스</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>광원. 주요 파장은 470nm(파란색)입니다. 1개가 필요합니다. 동일한 공급업체의 대체 미니어처 LED 매트릭스는 624nm(빨간색), 588nm(노란색), 525nm(녹색), 572nm(황록색) 및 흰색의 주요 파장으로 제공됩니다.</td></tr><tr><td>적층 가능한 헤더-3핀</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8이 필요합니다.</td></tr><tr><td>저항기 키트 - 1/4W (총 500개)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>전자제품용. 1개 필요.</td></tr><tr><td>&nbsp; IRL520N MOSFET</td><td>International Rectifier</td><td>IRL520N</td><td>DC 전류 제어를 위한 전압 조절 스위치. 4 필요.</td></tr><tr><td>훅업 와이어 - 구색(솔리드 코어, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>전자 제품용 와이어. 1개 필요.</td></tr><tr><td>5V 2A(2000mA) 스위칭 전원 공급 장치 - UL 인증</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>가열 패드 및 Arduino용 전원 공급 장치. 2개 필요.</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA 조절 스위칭 전원 어댑터 - UL 인증</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>연동 펌프용. 2개 필요.</td></tr><tr><td>전기 가열 패드 - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>생물반응기 가열용. 1개 필요.</td></tr><tr><td>저유량 가변 흐름 연동 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>펌핑 매체용. 1개 필요</td></tr><tr><td>중간 유량 가변 흐름 연동 펌프</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>펌핑 배양용. 1개 필요.</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA 정격 스위칭 전원 어댑터 - UL 인증</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>마이크로컨트롤러 전원 공급 장치용. 주문 1.</td></tr><tr><td>고온 방수 DS18B20 디지털 온도 센서 + 생물</td> 반응기용 <td>엑스트라 Adafruit</td><td>642</td><td>온도계. 1 필요.</td></tr><tr><td>Micromanager</td><td>Micromanager</td><td>NA</td><td>무료 오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어는 "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA</td><td>무료 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어는 "http://fiji.sc/"</td></tr><tr><td>Arduino Integrated Development Environment</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>에서 사용할 수 있습니다.무료 오픈 소스 IDE는 "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>사용자 지정 코드</td><td>GitHub</td><td>NA</td>에서 사용할 수 있습니다. 사용자 <td>지정 마이크로 컨트롤러 코드 및 "Bioreactor Controller" 플러그인은 " 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB 케이블 A to B - 6</td>피트 <td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>마이크로컨트롤러에 데이터를 다운로드하는 데 사용됩니다. 1개가 필요합니다.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>CSV 파일에서 LED 매트릭스 값을 로드하는 장점은 플러그인에서 프로그램을 호출하여 이미지 분석 결과에 따라 해당 값을 업데이트할 수 있고 해당 값을 마이크로 컨트롤러에 다시 로드하여 피드백 제어를 가능하게 할 수 있다는 것입니다. 에서 사용할 수 있습니다. 광유전학 화학요법 파일" GitHub 리포지토리(https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Tota-frost gels (확산지)</td><td>B& H</td><td>B& H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>LED 매트릭스용. 1이 필요합니다.</td></tr><tr><td>Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>용기 인클로저 배양을 위한 검은색 폼. 4개 필요.</td></tr><tr><td>표준 포토다이오드 파워 센서, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>광도 측정용. 1 필요.</td></tr><tr><td>라벨링 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>느슨한 구성 요소에 라벨을 부착하고 고정합니다. 1 필요.</td></tr><tr><td>소형 전력 및 에너지 미터 콘솔, 디지털 4인치 LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>광도 측정용. 1 필요.</td></tr><tr><td>100 mL GL45 혼성화 유리 병</td><td>벨코 글라스 주식회사</td><td>(7910-40150)</td><td>생물반응기 용기. 1개 필요.</td></tr><tr><td>6포트 어셈블리</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>맞춤형&nbsp;</td><td>생물 반응기 용기의 경우. 튜빙 사양 : .125 "OD x .055"ID. 포트 A : 캡 슬러그 위와 튜브 바닥까지 1.0 인치. 포트 B,C,E,F: 캡 슬러그 위 길이 1.0인치, 아래 길이 33mm. 포트 D: 캡 슬러그 위 1.0" 길이, 65 mm&nbsp; 한참 아래에. 1개가 필요합니다. 45mm 직경의 폴리프로필렌 오픈 탑 스크류 캡과 흰색 실리콘 가스켓이 포함되어 캡과 용기 사이의 밀착 밀봉을 보장합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>스카치 매직 테이프 3105, 3/4 x 300인치,</td><td>아마존</td><td>B0009F3P3U</td><td>클리어 스카치 테이프 3개 팩. 이것은 다른 많은 공급업체에서 사용할 수 있습니다. 배양 용기의 표시를 덮고 PDMS 채널이 있는 커버 유리를 알루미늄 지지 프레임에 고정하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>1/16 "ID x 3/16"OD x 1/16 "벽 Tygon 위생 실리콘 튜브</td><td>미국 플라스틱 주식 회사</td><td>57288</td><td>튜빙. ~25' 필요.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit 흰색 고무 마개, 크기 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>미디어 플라스크 마개 및 유출 플라스크 마개. 2 필요.</td></tr><tr><td>2L 실험실용 플라스크</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>미디어 플라스크 및 폐수 플라스크 2개 필요.</td></tr><tr><td>데이 핀치콕</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>핀치 튜브 닫힘용. 3 필요.</td></tr><tr><td>교체용 튜빙 어셈블리 1/16" ID</td><td>Traceable Products</td><td>3372</td><td>연동 펌프는 튜브 세트와 함께 제공되지만 몇 주 동안 사용하면 마모됩니다.</td></tr><tr><td>교체용 튜빙 어셈블리 1/50" ID</td><td>추적 가능 제품</td><td>3371</td><td>연동 펌프는 튜브 세트와 함께 제공되지만 몇 주 동안 사용하면 마모됩니다.</td></tr><tr><td>잠금 링이 있는 수 루어 x 1/16" 호스 미늘, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>커넥터.~10개의 루어가 필요합니다.</td></tr><tr><td>잠금 링이 있는 수 루어 x 1/8" 호스 미늘, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>커넥터. 5개가 필요하며, 튜브로 채우기 위해 각 고무 마개 구멍에 하나씩 필요합니다.</td></tr><tr><td>암 루어 x 1/16" 호스 미늘 어댑터, 나일론, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>커넥터.~10개의 루어가 필요합니다.</td></tr><tr><td>암 luer x 3/16" 호스 미늘 어댑터</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>커넥터.~10개의 루어가 필요합니다.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer 액세서리, 여성 Luer Cap, 나일론, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer 액세서리, 남성 Luer Lock Plug, 나일론, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>마이크로보어 PTFE 튜빙, 0.022"ID x 0.042"OD, 100ft/roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>튜빙. 1롤이 필요합니다.</td></tr><tr><td>Masterflex 백금 경화 실리콘 튜빙, L/S 13, 25피트</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>튜빙.~25'가 필요합니다.</td></tr><tr><td>3/16 "ID x 1/4"OD x 1/32 "벽 Tygon 위생 실리콘 튜브</td><td>미국 플라스틱 주식 회사</td><td>57293</td><td>튜빙. ~1' 필요.</td></tr><tr><td>진공 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>974107 멸균 여과 매체용 Nalgene 진공 필터.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>듀얼 다이어프램 조절 가능한 플로우 에어 펌프는 공기 조절 및 혼합 매체를 위한 것입니다. 1개 필요.</td></tr><tr><td>0.2 &무; m 기공 주사기 필터</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>이것은 수족관 펌프의 공기가 장치를 오염시키지 않도록 합니다. 1 필요.</td></tr><tr><td>Slygard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>미세유체 장치용. 1 필요.</td></tr><tr><td>American Safety Razor GEM Scientific 단일 가장자리 면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>튜브 및 PDMS 절단용. 1개의 블레이드가 필요합니다.</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 홀 펀처 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>미세유체 장치의 입구/출구 펀칭용. 1개 필요.</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>미세유체 장치용. 1개 필요.</td></tr><tr><td>정사각형 창이 있는 직사각형 알루미늄 프레임,</td><td>맞춤형</td><td>사용자 정의</td><td>, 미세유체 채널을 지원합니다. 외부 치수: 3 인치 x 1.25 인치. 내부 치수(잘라낸 부분): 7/8 인치 x 7/8 인치 두께: ~1/32 인치</td></tr></tbody></table>

미생물 optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic 시스템은 세포 과정을 변경하는 빛의 특정 파장에 대한 응답으로 형태를 변경 유전자 인코딩 된 단백질을 사용한다. optogenetic 조명 시스템의 프로그래밍 및 자극을 탑재 되 배양 시스템 및 측정이 필요하다. 우리 구축 광의 프로그래밍 용량과 균체를 조명하고, 자동으로 획득하고 유출 셀의 이미지를 분석하는 연속 배양 장치를 이용하기위한 프로토콜을 제시한다. chemostat 등이 장치의 동작은 성장 속도와 셀룰러 환경이 엄격하게 제어 될 수있다. 연속 세포 배양의 유출 물을 주기적으로 샘플링하고, 세포를 다 채널 현미경으로 이미지화된다. 형광 강도 배양 유출 물로부터 샘플링 된 세포의 세포 형태의 동적 응답이 여러 날에 걸쳐 측정되도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전히 자동화사용자 입력없이. 우리가 동적으로 전사를 활성화 optogenetic 시스템 설계 사카 세레 비지에 균주에서 단백질 생산을 유도하여 배양 장치의 유용성을 입증한다.

이 장치는 CRY2 / CIB1 단백질 쌍 (30)에 기초하여 유도 optogenetic 전사 시스템을 통해 푸른 빛의 질문에 답변 노란색 형광 단백질 (YFP)를 표현하는 S. cerevisiae의 문화를 자극하기 위해 사용되었다. 세포를 0.2 ± 0.008 평균 희석 속도 포스페이트 한정 배지에서 배양 하였다 chemostatically. 인산 제한은 일반적으로 성장 속도를 제어하는 S. 세레 비지 chemostat 실험에 사용되는 인산 제한의 효과는 잘 특징으로한다. 31 (32)는 연속적으로 희석 된 배양 용기 (33)로부터 유출 물은 거꾸로 현미경에서 미세 유체 소자로 샘플링 하였다. 도 8에</stron...

우리는 거꾸로 현미경으로 유출 물에 미생물의 문화와 정기적으로 이미지 세포를 조명하기 optogenetic 시스템과 함께 사용 연속 배양 장치를 설계했다. 조명 동적 응답은 며칠에 걸쳐 측정 될 수 있도록 배양 샘플링, 촬상 한 화상 분석이 완전 자동화된다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

이 절차의 전반적인 목표는 광유전 미생물의 조명에 대한 반응을 현미경으로 여러 날에 걸쳐 실시간으로 자동으로 측정할 수 있는 연속 배양 용기를 조립하는 것입니다. 이 방법은 동적 유전자 발현이 정적 유전자 발현과 다른 반응을 이끌어내는 방법과 같은 세포 생물학 및 대사 공학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 연속 배양을 통해 며칠 동안 측정값을 수집할 수 있다는 것입니다.시작하려면 접지선, 데이터 라인 및 양극 볼륨을 납땜합니다.tag디지털 온도계의 e 라인을 인쇄 회로 기판에 연결합니다. 암 3핀 헤더에서 핀 하나를 잘라내고 나머지 두 핀을 자릅니다. 이것을 R2라고 표시된 한 쌍의 구멍에 납땜하고 핀 헤더에 4.7킬로 옴 저항을 삽입하여 납땜된 두 개의 핀을 연결합니다.다음으로 나머지 구성 요소를 회로 기판에 연결합니다. 회로 기판을 마이크로 컨트롤러에 오버레이합니다. 차광 인클로저를 설정하고 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 소프트웨어를 설치합니다.먼저 개스킷을 통해 알루미늄 포트의 긴 끝을 배양 용기에 넣고 캡을 조입니다. 중간 직경의 실리콘 튜브로 하나의 짧은 알루미늄 포트 배출구를 덮습니다. 암 루어 잠금 장치를 삽입한 다음 수 루어 잠금 플러그를 연결하여 증류 끝을 막습니다.이 콘센트는 보조용이며 사용하지 않습니다. 중간 직경의 실리콘 튜브로 된 두 개의 짧은 세그먼트를 수형 및 암형 루어 잠금 장치와 연결합니다. 그런 다음 한쪽 끝을 짧은 알루미늄 포트 콘센트에 연결하고 증류 끝을 막습니다.이 튜브를 통해 혈관이 접종됩니다. 다음으로, 두 개의 중간 튜브를 중간 직경의 연동 튜브와 커넥터의 끝에 연결합니다. 한쪽 끝을 짧은 알루미늄 포트에 연결하고 다른 쪽 끝을 꽂습니다.나중에 이것은 미디어 플라스크에 연결됩니다. 중간 직경의 실리콘 튜브를 가장 긴 알루미늄 포트에 연결합니다. 튜브는 미디어 플라스크에 도달할 수 있을 만큼 충분히 길어야 합니다.몇 인치 길이의 다른 짧은 세그먼트를 끝까지 연결한 다음 미디어 플라스크의 고무 마개에 삽입합니다. 튜브를 고정합니다. 나중에 클램핑이 해제되면 이 연결을 통해 배양물을 혼합, 폭기 및 유입되는 기포에 의해 양압으로 유지할 수 있습니다.플라스크 바닥에 닿을 만큼 충분히 긴 중간 직경의 튜브를 매체가 전달될 스토퍼에 삽입합니다. 이 튜브에 다른 중간 직경의 튜브를 연결한 다음 끝에 넓은 직경의 튜브를 연결합니다. 증류 끝을 막습니다.스토퍼의 세 번째 구멍을 중간 직경 튜빙의 짧은 세그먼트로 채우고, 중간 직경 튜빙의 다른 두 세그먼트에 연결하고, 증류 말단에 막습니다. 이것은 진공 펌프에 연결되고 나중에 수족관 펌프에 연결됩니다. 좁은 직경의 실리콘 튜브 세그먼트에 수 루어 잠금 장치를 삽입한 다음 PTFE 튜브를 단단히 삽입합니다.그런 다음 암 루어 잠금 장치를 중간 직경의 튜브에 부착합니다. PTFE 튜브를 따라 암 잠금 장치를 끼워 잠금 장치를 연결하고 다른 잠금 장치를 짧은 알루미늄 포트에 연결합니다. 배양 용기 내부의 PTFE 튜브가 두 번째로 긴 알루미늄 튜브 아래와 바닥 위에 매달려 있는지 확인합니다.필요에 따라 다듬습니다. 여기에서 배지는 이미징 채널로 샘플링되며, 좁은 튜브는 중간 부피를 최소화합니다. 다음으로, 노출된 좁은 실리콘 튜브를 좁은 연동 튜브 및 커넥터에 연결합니다.이에 3개의 좁은 직경 튜브 세그먼트와 2개의 PTFE 튜브 세그먼트를 교대로 연결합니다. 이것을 중간 직경의 튜브를 통해 폐수 플라스크에 연결합니다. 그런 다음 중간 직경의 실리콘 튜브의 한쪽 끝을 폐수 플라스크의 다른 쪽 끝에 있는 알루미늄 포트의 두 번째로 긴 튜브에 연결합니다.이 알루미늄 튜브는 배양량을 설정하고 초과 배양물은 폐수 용기로 넘칩니다. 플라스크의 뚜껑을 알루미늄 호일로 감싼 다음 섭씨 30도 및 121PSI에서 15분 동안 어셈블리를 고압멸균합니다. 진공 필터를 100ml 병에 부착합니다.니플 커버를 제거한 다음 멸균 핀셋으로 진공 필터 니플의 흰색 플러그를 제거합니다. 넓은 실리콘 튜브를 젖꼭지에 연결하고, 배지 플라스크의 다른 자유 튜브를 진공 펌프에 연결하고, 미디어 플라스크를 배양 용기에 연결하는 세 번째 튜브가 클램프로 닫혔는지 확인합니다. 필터에 매체를 채우고 진공 펌프를 켠 다음 나머지 매체를 필터링합니다.Clamp 진공에 연결된 중간 실리콘 튜브를 닫고 진공 펌프를 끕니다. 진공 펌프에 연결된 중간 실리콘 튜브의 중간 세그먼트에서 루어를 제거하고 멸균 주사기 에어 필터의 파란색 끝을 이 튜브에 삽입합니다. 그런 다음 넓은 실리콘 튜브를 고정하고 수컷 루어를 분리합니다.배양 용기의 매체 주입 튜브의 암 루어에서 플러그를 분리합니다. 이러한 루어를 연결하여 배지를 배양 용기로 펌핑할 수 있습니다. 그런 다음 100ml 병에서 필터를 제거하고 병 뚜껑을 부착합니다.이 배지를 사용하여 스타터 배양을 준비합니다. 연속 배양 어셈블리를 현미경 근처에 놓고 배지 플라스크는 배양 용기보다 높고 유출 플라스크는 배양 용기보다 낮게 하여 역류를 방지합니다. 미디어와 폐수 플라스크의 고무 마개를 테이프로 단단히 감습니다.그런 다음 PTFE 튜브를 연결하는 좁은 실리콘 튜브에서 PTFE 튜브의 끝을 뽑고 이 끝을 준비된 미세유체 장치의 입구와 출구에 꽂습니다. 그런 다음 주사기 에어 필터의 흰색 끝을 수족관 펌프에 연결하여 배지를 배양 용기로 밀어 넣습니다. 매체가 폐수 포트 수준에 도달하면 중간 매체 주입구 튜브와 커넥터를 저속 연동 펌프 주위로 감싸고 좁은 샘플 배출구 튜브와 커넥터를 고속 연동 펌프 주위로 감쌉니다.미디어 플라스크와 배양 용기 사이의 공기 튜브를 풀어 미디어를 폭기합니다. 그런 다음 가열 패드와 온도계를 배양 용기에 테이프로 붙여서 온도를 제어할 수 있습니다. 배양 용기 주위에 배지 튜브를 감아 넣는 매체가 용기와 동일한 온도가 되도록 합니다.그런 다음 배양 용기를 LED 매트릭스 위의 검은색 폼 인클로저에 삽입하고 튜브가 끼이지 않았는지 확인합니다. 바이오리액터 컨트롤러 플러그인을 사용하여 30초 간격의 10분의 1 동안 느린 미디어 펌프를 켭니다. 유속은 매우 낮지만 증발 속도보다 큽니다.Clamp 미디어 플라스크와 배양 용기 사이에 들어오는 공기 튜브를 넣습니다. 피펫을 사용하여 종균 배양에서 1ml를 배양 용기에 접종합니다. 그런 다음 이 튜브의 증류 끝을 고정하고 공기 튜브를 언클램프합니다.하룻밤 사이에 문화가 자라나게 하십시오. 빛이 들어오지 않도록 인클로저를 덮습니다. 다음 날, bioreactor 컨트롤러 플러그인을 사용하여 연동 펌프가 원하는 매체 및 샘플링 유량에 따라 더 많은 시간 동안 회전하도록 설정합니다.배양 밀도가 하룻밤 사이에 평형을 이루도록 합니다. 다음 날, 스테이지 위치 목록과 마이크로 매니저를 미세유체 채널로 펌핑된 세포가 초점면에 있을 겹치지 않는 위치 세트로 채웁니다. 그런 다음 바이오 반응기 컨트롤러 플러그인을 엽니다.프롬프트에서 원하는 LED 매트릭스 시간 경과, 이미징 채널 및 기타 실험 설정을 선택한 다음 데이터 수집을 시작합니다. 이 장치는 유도 가능한 광유전학적 전사 시스템을 통해 청색광에 반응하여 노란색 형광 단백질을 발현하는 saccharomyces cerevisiae의 배양을 자극하는 데 사용되었습니다. 미세유체 채널의 염기 대비 및 형광 이미지를 획득했습니다.위상차 이미지에서 세포 윤곽을 식별하고, 형광 이미지에 매핑하고, 형광 이미지를 실시간으로 기록했습니다. 여기의 히트 맵은 광유전학 시스템의 활성화에 따른 노란색 형광 단백질 생산으로 인한 배양물의 형광 분포를 보여줍니다. 대략 170의 000의 세포의 형광은 30 의 000의 심상 이상에서 분석되고, 70 시간 이상 28의 단계 위치에서 취득되었다.이 연구 기간 동안 배양물은 6시간 간격으로 다양한 강도의 청색광에 노출된 후 6시간 동안 완전한 암흑에 노출되었습니다. 세포는 첫 번째 측정 전에 빛에 노출되었기 때문에 첫 번째 암흑 기간 동안 형광 강도가 감소하고 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 3일 동안 8시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 멸균 기술을 사용하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 실시간 피드백 제어와 같은 다른 방법을 사용하여 단백질 농도를 제어할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 광유전학적 구조를 가진 유기체를 플레이트 또는 배치 배양을 사용하여 가능한 것보다 더 오랜 기간에 걸쳐 동적으로 연구할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 연속 배양 장치, 조명 및 현미경을 통합하여 광유전학적 미생물을 자극하고 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

design-implementation-an-automated-illuminating-culturing-sampling

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

이 프로토콜은 PhyB 및 PIF3를 사용하여 적색광 및 원적외선으로 유전자 발현을 제어하기 위한 광유전학적 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 간단하고 유연한 조명 시스템을 구축하기 위한 단계별 지침이 포함되어 있어 컴퓨터로 유전자 발현 또는 기타 광유전학을 제어할 수 있습니다.

광유전학 실험을 위한 간단하고 다양한 조명 시스템 구축

광-반응성 포유동물 세포를 안정적으로 제어하려면 광유전학적 방법의 표준화가 필요하다. 이러한 목표를 향하여, 본 연구는 유전자 회로 구축, 세포 공학, 광유전학 장비 운영 및 검증 분석의 파이프라인을 개괄하여 네거티브 피드백 광유전학 유전자 회로를 이용한 광유도 유전자 발현 연구를 사례 연구로 표준화한다.

포유류 세포에서 안정적인 광유전학적 유전자 회로를 안정적으로 엔지니어링하고 제어합니다.

생체발광-루시퍼라제 효소에 의해 방출되는 광은 소분자 기질인 루시페린-광감각 단백질을 활성화시키기 위해 이용될 수 있고, 이로써 광 자극에 또 다른 차원을 추가하고 시간적 및 공간적 스케일에 걸쳐 세포에서 다수의 광-매개 기능의 조작을 가능하게 한다.

생체 발광 광유전학 2.0 : 생체 발광을 활용하여 체외 및 생체 내에서 광감각 단백질을 활성화 합니다.

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

미생물 화학 및 단백질 생산을 위한 광 조절 발효

우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

이 프로토콜은 cAMP 센서와 광유전 단백질인 bPAC-nLuc를 transfection하여 세포 분포와 광 자극에 대한 반응을 정확하게 추적합니다. 포인트 스캐닝 시스템을 사용하여 cAMP 응답 맵을 만드는 혁신적인 접근 방식은 다양한 분야에서 광유전 단백질에 대한 연구를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

광 자극 그리드를 사용한 광유전 단백질의 세포 분포 매핑

이 프로토콜은 자동화된 플랫폼 Lustro를 활용하여 효모의 광유전학 시스템의 고처리량 특성 분석을 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다.

자동화된 플랫폼 Lustro를 사용한 효모의 고처리량 광유전학 실험

이 프로토콜은 단백질 활성의 가역적 시공간 제어를 위해 엔지니어링된 청색광 활성화 알로스테릭 스위치(LightR) 도메인의 적용을 설명합니다. 이 연구는 Src 티로신 키나아제를 모델로 활용하여 광 조절 Src(LightR-Src)를 개발하고 특성화하기 위한 정교한 프로토콜을 제공합니다. 이는 효소 종류 전반에 걸쳐 이 접근법의 다양성을 보여줍니다.

Optogenetic Allosteric Regulation을 통한 단백질 활성의 시공간 제어

이 연구는 HEK293T 세포에서 빛 유도 유전자 발현을 최적화하기 위해 3D 프린팅 LED 어레이를 사용하는 고처리량 실험 방법을 설명합니다.

포유류 유전자 발현을 제어하기 위한 광유도 시스템의 신속한 최적화

배우세요 미생물 옵토제네틱스 연구를 위한 연속 배양 시스템 구축 방법을 실시간 자동 측정으로 다양한 광 노출 조건에서 유전자 발현 역학을 분석하여 대사 공학 및 세포 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

미생물 Optogenetic 애플리케이션을위한 설계 및 자동화 일루미, 배양 및 샘플링 시스템의 구현

더 많은 동영상 탐색