마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 ^(12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

이 신경 분화 프로토콜의 전반적인 목표는 미세 전극 어레이에서 성장하는 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 빠르고 통제된 방식으로 신경 네트워크를 생성하는 것입니다. 이 방법은 신경 과학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 신경 장애의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있지만 보다 근본적인 신경생물학적 질문을 해결하는 데에도 사용할 수 있습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 유도 만능 줄기 세포를 통제된 방식으로 뉴런으로 빠르게 분화할 수 있다는 것입니다. 첫날에는 DMEM/F12, CDS 및 E8 배지를 1%페니실린 스트렙토마이신이 함유된 상태로 실온으로 가열합니다. 다음으로, E8 배지에 독시사이클린을 첨가하여 밀리리터당 4마이크로그램의 최종 농도를 만든 다음 혼합물에 암석 억제제를 첨가합니다.

RTTANGN2 양성 hiPSC의 사용된 배지를 흡인하고 세포에 1ml의 CDS를 추가합니다. 그 후, 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 3-5분 동안 세포를 배양합니다. 현미경으로 세포가 서로 분리되고 있는지 확인하십시오.

그런 다음 웰에 2밀리리터 DMEM/F12를 추가합니다. 1, 000 마이크로 리터 피펫으로 세포를 부드럽게 매달아 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 7ml의 DMEM/F12를 세포 현탁액에 첨가하고 5분 동안 200 x g에서 세포를 회전시킵니다.

5분 후 상층액을 흡입하고 준비된 E8 배지 2ml를 추가합니다. 1,000 마이크로리터 피펫의 끝을 15 밀리리터 튜브의 측면에 대고 세포를 부드럽게 재현탁하여 hiPSC를 해리합니다. 현미경으로 세포가 해리되었는지 확인하십시오.

그런 다음 혈구계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 결정합니다. 6개의 웰 MEA의 경우, 셀을 희석하여 7.5 곱하기 10의 세포 현탁액을 1밀리리터당 5번째 세포에 얻습니다. 커버 슬립의 경우, 세포를 희석하여 밀리리터당 4번째 세포에서 4배 10의 세포 현탁액을 얻습니다.

커버 슬립에서 희석된 라미닌과 6개의 웰 MEA를 흡인합니다. 6개의 웰 MEA의 경우, 각 웰의 활성 전극 영역에 100마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하여 셀을 플레이트화합니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하여 셀을 플레이트합니다.

다음으로, 6웰 MEA 또는 24웰 플레이트를 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 2시간 후 준비된 E8 배지 500마이크로리터를 6웰 MEA의 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 6개의 웰 MEA를 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에 밤새 놓습니다.

3일째에는 0.05%트립신-EDTA를 실온으로 데웁니다. 1% 페니실린 스트렙토마이신으로 DPBS 및 DMEM/F12를 섭씨 37도까지 가열합니다. 그런 다음 쥐 성상세포 배양의 사용된 배지를 흡인합니다.

5ml의 DPBS를 첨가하여 배양물을 씻고 부드럽게 헹굽니다. 그 후, DPBS를 흡인하고 0.05%트립신-EDTA 5ml를 첨가합니다. 트립신-EDTA를 부드럽게 휘젓습니다.

그런 다음 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 현미경 아래를 확인하여 세포가 분리되었는지 검사합니다. 플라스크를 몇 번 눌러 마지막 셀을 분리합니다.

그런 다음 플라스크에 DMEM/F12 5ml를 추가합니다. 10ml 피펫으로 플라스크 내부의 세포를 부드럽게 평가해 보십시오. 그런 다음 15ml 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.

200 x g에서 튜브를 8분 동안 돌립니다. 그 후, supernatent를 흡인하고 DMEM/F12 1밀리리터에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 결정합니다.

다음으로, 6개의 웰 MEA의 각 웰에 있는 네 번째 성상세포에 7.5 곱하기 10을 추가합니다. 그리고 24 웰 플레이트의 각 웰에 네 번째 성상세포에 10을 두 번 추가합니다. 세포를 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.

1, 200배 증폭에서 데이터를 수집하고 MCS 데이터 수집 카드를 사용하여 10킬로헤르츠에서 신호를 샘플링합니다. MEA에서 배양된 hiPSC 유래 뉴런의 전기생리학적 활성을 20분 동안 기록합니다. 기록하는 동안 온도를 섭씨 37도로 유지하고, 가습 가스의 흐름을 지속적으로 MEA에 천천히 전달하여 매체 증발 및 pH 변화를 방지합니다.

그런 다음 사용자 지정 소프트웨어 패킷을 사용하여 데이터를 분석합니다. 이 그림은 분화 과정 동안 시냅신에서 신경 세포 마커 MAP2의 발현 변화를 보여주며, 이는 신경 세포 성숙을 나타냅니다. 이 그래프는 분화 과정에서 증가된 개별 세포에 대해 시냅신 발현이 측정되었음을 보여줍니다.

PSD-95와 함께 국소화된 3주간의 분화 후 세포에서 발현되는 시냅신은 기능적 시냅스의 존재를 나타냅니다. 여기서, 세포의 전기생리학적 활성을 측정하기 위해 분화 과정 중 다른 시점에서 전체 세포 패치 클램프를 수행했습니다. 세포는 서로 다른 시점에서 활동 전위를 생성할 수 있었습니다.

그리고 시간이 지남에 따라 증가한 스파이크 세포의 비율은 대부분의 세포가 분화 초기 단계에서도 활동 전위를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 패치 클램프는 또한 세포가 받는 흥분성 시냅스후 전류를 측정하는 데 사용되었습니다. 세포가 분화 과정에서 받는 입력의 수가 증가했습니다.

흥분성 시냅스후 전류의 주파수와 진폭은 모두 분화 과정에서 증가했습니다. 미세전극 어레이에서 분화된 세포의 전기생리학적 활성은 분화 과정에서 측정되었습니다. 여기서, 분화 과정에서 뉴런 네트워크 활성이 증가했고, 23일 후에 동시 이벤트를 보여주었습니다.

일단 숙달되면, 이 기술은 3-4주 이내에 유도 만능 줄기 세포를 기능적 신경 네트워크로 분화시키는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 무균 상태로 작업하고 세포를 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 약리학적 검사와 같은 다른 방법을 사용하여 환자의 세포주에서 관찰된 표현형을 구출할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 신경 장애의 네트워크 활동 결함을 공식적으로 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 만능 줄기 세포를 빠르고 통제된 방식으로 분화하고 뉴런으로 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.