Name: 마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 hiPSC를 신경 세포로 빠르게 분화시키고 마이크로 전극 배열에서 네트워크 활동을 측정하는 방법을. 이 기술은 신경 생물학 메커니즘 및 신경계 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 전체 세포 패치 클램프 실험을 수행한 Jessica Classen에게 감사를 표합니다. 본 실험에 사용된 hiPSC는 네이메헌 Radboud 대학의 Huiqing Zhou와 Willem van den Akker가 친절하게 제공해 주었습니다. 이 프로토콜에 사용된 전달 벡터는 본 대학교 메디컬 센터(University of Bonn Medical Centre)의 올리버 브뤼슬(Oliver Brüstle), 필립 코흐(Philipp Koch) 및 줄리아 라데비히(Julia Ladewig)에 의해 제공되었습니다.

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여기에서 우리는 장 등 알 발행 효율적인 hiPSC 분화 프로토콜을 구현했습니다. 다자간에 hiPSC 유래 신경 네트워크의 네트워크 활동을 측정 (2013) 12. 우리는 신경 세포의 분화를 유도하기 전에 rtTA / Ngn2 양성 hiPSC 라인을 만들어 원래의 프로토콜을 적용. 이 추가 단계는 우리가 MEA의 신경 세포 밀도를 제어 할 수 있습니다. 신경 밀도 제어는 다자간의 프로토콜을 적응과 일관성을 보장하기위한 중요한 전제 조건이었다. MEA의 신경 네트워크를 사용하여 활성을 측정하기 위하여, 신경 세포를 직접 MEA 전극 (17, 18) 위에 고밀도 네트워크를 형성 할 필요가있다. 이것은 반드시 신경 세포의 도금 밀도를 통해 엄격한 제어를 필요로한다. rtTA / Ngn2 양성 hiPSC 라인이 전술 전에 분화에 hiPSCs의 급성 렌티 바이러스 transductions에 의존하지 않기 때문에 신경 세포 밀도를 제어 할 수 있습니다;rtTA / Ngn2 양성 hiPSC 라인을 따라서 거의 예를 들어, 렌티 바이러스 독성 및 가변 감염 효율, 인해 최종 수율에 어떤 변화가 없습니다. 실험 방법의 또 다른 중요한 단계는 구별 hiPSCs 함께 동시 배양 된 래트 성상 세포의 수이다. 아스트로 적극적 신경 기능에 중요한 공정이다 모두 시냅스 형성, 유지 및 제거를 제어함으로써, 신경 회로를 개발 미세화에 기여한다. 이 논문에서 제시된 프로토콜은 매우 성상 세포에 의존 : 완전히 성숙하고 기능적인 시냅스를 형성, 신경 세포는 성상 교세포의 지원을 필요로한다. 우리는 성상 세포의 수가 뉴런의 성숙 및 자연 활성을 갖는 신경 세포 네트워크의 형성을 지원하도록 hiPSC 유래 신경 세포의 수와 거의 동일 할 것을 경험 하였다. 우리의 성상 세포 프로토콜 수익률 일차 전지의 막 다른 이후제한된 수명을 가진 투 레스는 쥐의 성상 세포의 분리는 정기적으로 수행해야합니다. 장 등의 알 발행 프로토콜의 우리의 적응. (2013) 12 MEA 기술을 사용할 가능성이 상당히 hiPSC 유래 네트워크의 네트워크 활동을 연구 할 수있는 능력을 개선한다. 이전과 MEA의 hiPSC 유래 신경 네트워크를 연구에 사용되는 프로토콜은 시간이 많이 소요되는 분화 과정에 의존 13-16. 장 등의 알에서 프로토콜입니다. (2013)는 신속하게 대체를 제공하고 변형이 더욱 가능 특히 높은 처리량 또는 약리학 적 연구에서, MEA 기술과 조합 hiPSC 유래 신경 세포를 사용할 수있게 변동성의 근원을 제거한다. 또한, 때문에 장 등 알 발행 방법. (2013) 12 상층 피질 뉴런의 균질 인구 우리 구성된 프로토콜 네트워크 (A) 내로 최대한 집중 연구하게 수득이 특정 신경 세포의 부분 집합의 ctivity. 그럼에도 불구하고,이 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 문화가 뉴런의 다른 클래스 (즉, 억제 및 흥분성 뉴런)이 이기종 네트워크를 구성하는 생체 네트워크에 유사한 덜하기 때문에 우선, 문화의 균질성도 단점으로 간주 될 수있다. 상기 MEA 기술로 hiPSC 유래 신경 세포의 사용을 향상시키기 위해, 다른 신경 세포 집단을위한 급속 (트랜스 계) 분화 프로토콜을 개발하는 것이 중요 할 것이다. 프로토콜을 사용할 수있게되면, 체외 네트워크는보다 밀접하게 생체 네트워크를 모방 한 것입니다. 둘째, 본 래트 성상 세포에서의 성장을 지원하기위한 hiPSC 유래의 신경 세포에 첨가되어야하고, 따라서 생성 된 신경 네트워크는 인간의 신경 네트워크 sensu stricto (좁은 의미로)하지 않다. 미래 솔에서 성상 세포 수도로 hiPSCs 차별화를위한 신뢰할 수있는 프로토콜이 문제를 26했습니다. 여기에 설명 셋째, 이차원 신경 네트워크, 복잡한 3 차원 생체 신경 네트워크를 연구하는데 한정 모델이다. 다행히, MEA 기술과 함께 쥐 주 뉴런의 입체 문화를 설명하는 프로토콜은 27,28 이미 사용할 수 있습니다. 전향 삼차원 배양 기술과 MEA 기술 hiPSC 유래 신경 세포와 성상 세포를 얻기위한 신속한 분화 프로토콜의 조합은 생물학적 기전 신경계 장애에 대한 신규 한 통찰력을 제공한다.

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 분화 프로토콜의 개발은 신경 질환 연구를위한 강력한 새로운 도구를 제공하고 체외에서 인간의 신경 세포를 생성합니다. 최근까지이 질환의 연구는 심각하게 인간의 신경 세포를 사용하여 모델 시스템의 부족에 의해 방해되었다. 설치류가 신경 질환을 연구하는데 사용될 수 있지만, 이러한 연구의 결과는 인간 1로 쉽게 변환 될 수 없다. 이러한 한계를 감안할 때, hiPSC 유래 신경 세포는 분자 메커니즘을 기본 신경 질환을 규명하는 데 사용 및 체외 약물 스크리닝 할 수있는 유망한 대안 모델입니다. 지난 10 년, 여러 프로토콜은 신경 세포에 hiPSCs가 2-8 개발되었다 변환합니다. 그러나, 이러한 프로토콜들은 여전히 ​​많은 방식으로 제한된다. 첫째, 프로토콜은 종종 시간이 많이 소요됩니다 적절한 성숙에 생성 뉴런 (즉 synap자체 형성) 및 기능적 활동은 9 어려운 대규모 연구를 렌더링 배양 절차의 달을 필요로한다. 또한 hiPSC 투 뉴런 변환 효율이 낮다. 프로토콜은 종종 신경 세포의 이종 인구를 산출하고, 따라서 신경 세포의 특정 부분 집합의 연구를 허용하지 않습니다. 또한, 프로토콜은 서로 다른 IPSC 라인 10, 11에 대해 서로 다른 결과를 산출 재현 할 수 없습니다. 마지막으로, 성숙 단계 및 생성 된 뉴런의 기능적 특성 (10)은 다양하다. 이러한 문제, 장 등의 알을 해결합니다. (2013) (12)는 신속하고 재현 가능 neurogenin -2- 전사 인자를 과발현하여 hiPSCs 인간에서 뉴런을 생성하는 프로토콜을 개발했다. 신경 세포의 특성은 무관 한 (- (3 주 neurogenin-2의 발현을 유도 한 후 단 2) 프로토콜 재현 저자에 의해보고 된 바와 같이, 상대적으로 빠르게 분화 발생hiPSC 라인) tarting하고 hiPSC - 투 - 신경 세포 변환 (거의 100 %) 매우 효율적입니다. 자신의 프로토콜을 사용하여 생성 된 신경 세포의 인구는 신경 질환에 대한 세포 형 특정 기부금의 조사를 허용, 균질 (상위 계층 대뇌 피질의 뉴런을 닮은)된다. 또한, 자신의 hiPSC 파생 뉴런은 20 D 후 성숙 특성 (예를 들어, 능력이 시냅스와 강력한 기능 활동을 형성하기 위해) 전시. 네트워크 수준에서 hiPSC 유래 신경 세포의 전기 생리 특성을 특성화하는 hiPSC 기술 이전의 중요한 전제 조건은 인간의 질병 연구를 위해 이용 될 수있다. 이 때문에, 많은 연구 그룹은 최근 마이크로 전극 어레이 (MEA) 장치 (멀티 채널 시스템, 이틀 링겐, 독일) 13 ~ 16을 이용하여 네트워크 레벨에서 줄기 세포 유래의 신경 세포를 조사하기 시작했다. MEA의 전극은 신경 세포를 배양 할 수있는 기판에 매립된다.다자간는 신경 네트워크 및 활성 시험 관내 전기 생리 학적 현상의 성질을 조사하는데 사용될 수있다. 현재 다자간는 성숙한 네트워크를 수득 수개월이 걸릴 분화 프로토콜과 함께 사용된다. 따라서, 신속한 분화 프로토콜 MEA를 조합하여 신경 질환의 대규모 연구에서이 기술의 사용을 용이하게한다. 여기서, 우리는 장 동부 등의 변형을 제시한다. (2013) 12 프로토콜과 다자간 환경에서 사용할 수 있도록 적응. 특히, 오히려 급성 렌티 바이러스 전달에 의존하는 것보다, 우리는 대신에 안정적으로 분화를 유도하기 전에 rtTA / Ngn2을 표현 hiPSC 라인을 만들었습니다. 우리는 신경 세포 밀도는 신경 네트워크의 형성에 중요하며, 신경과 MEA (17, 18)의 전극 사이에 양호한 접촉하기 때문에, 신경 세포 밀도 위에 재현성 제어를 주로 이것을했다. Althoug시간 장 등의 알. 프로토콜 hiPSCs 형질 전환에 대하여 매우 효율적이다는 처음 12 (장 등.에서도 2e 참조) 도금 hiPSCs 수가 뉴런의 최종 수율에 대하여 본질적으로 가변적이다. 안정적인 라인으로, 우리는 렌티 바이러스의 독성 및 감염의 효율성 변화를 일으키는 많은 문제를 제거 할 수 있습니다. 우리는 그 다음 네트워크 성숙을 획득, 안정적으로 다자간에 hiPSC 파생 신경 네트워크를 생성 매개 변수를 최적화 (예를 들어, 채널의 대부분을 포함하는 동기 이벤트) 셋째 주에 의해. 이 신속하고 신뢰성있는 프로토콜은 서로 다른 (즉, 환자 맞춤형) hiPSC 라인뿐만 아니라 약리 연구에 강력한 일관성을 제공에서 파생 된 신경 세포 사이의 직접 비교를 사용하도록 설정해야합니다.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz의 L-15 중간</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+-free HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>고포도당 DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (소 태아 혈청)</td><td>시그마-알드리치</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 &마이크로; m cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 렌티바이러스 패키징 벡터</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 렌티바이러스 패키징 벡터</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>기저 멤브레인 매트릭스</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>세포 박리 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 medium</td><td>Gibco A1517001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>또는 티아조비빈(thiazovivin)과 같은 ROCK 억제제를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>시그마-알드리치</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr>,<td>퓨로마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>, 비트로넥틴</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr>, <tr><td>6웰 MEA 다중</td><td>채널 시스템</td>, <td>60-6웰MEA200/30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립,</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴(PLO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, 인간 재조합</td><td>프로모카인</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, 인간 재조합</td><td>프로모카인</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닐-L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>신경기저 배지</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>사이토신 &베타;-D-아라비노푸라노사이드&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>직선 세밀한 팁 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>세밀한 팁 스프링 가위&nbsp;</td><td>정밀 과학 도구</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 신경 세포 (hiPSCs)은 신경 질환 연구를위한 유망한 새로운 도구를 제공합니다. 지난 10 년, 뉴런에 hiPSCs 차별화를위한 많은 프로토콜이 개발되었다. 그러나, 이러한 프로토콜들은 높은 변동성, 낮은 재현성, 낮은 효율 느리다. 또한, 이러한 프로토콜 얻어진 신경 종종 미숙과 뉴런 수개월 동안 배양 않는 한 모두 단일 셀 및 네트워크 수준에서 적절한 기능적 활성이 부족하다. 부분적으로 이러한 제한에 hiPSC 파생 신경 네트워크의 기능적 특성은 아직도 잘 특징이다. 여기, 우리는 전사 인자 neurogenin-2 (12)의 강제 식으로 hiPSCs에서 인간의 신경 세포의 생성을 설명하는 최근 발표 된 프로토콜을 적용. 이 프로토콜은 빠른 transduc 거의 100 %의 변환 효율, 효율적인 (성인용으로 3 주 내에 뉴런 산출)된다혼성 세포 (&gt; DAPI 양성 세포의 95 %가 양성 MAP2). 또한, 프로토콜은 신경 질환을 세포 형 특정 기부의 조사를 허용 흥분성 뉴런의 균질 한 집단을 산출한다. 우리는 우리의 뉴런의 수를 통해 명시 적으로 제어를 제공 안정적 형질 hiPSC 세포를 생성하여 원래의 프로토콜을 변형. 이러한 세포는 마이크로 전극 어레이에 hiPSC 유래 신경 네트워크를 생성하기 위해 사용된다. 이러한 방식으로, hiPSC 유래 신경 네트워크의 자발적 전기 생리 활성을 측정 할 수 있고, 셀 밀도면에서 interexperimental 일관성을 유지하면서, 방법. 제시된 프로토콜은 특히 인간의 신경 네트워크의 기계적 및 약리 연구에 광범위하게 적용 할 수있다.

여기에서 우리는 성공적으로 hiPSCs이 전사 인자 neurogenin-2 (12)을 통해 발현에 의해 대뇌 피질의 신경 세포로 직접 분화되는 프로토콜을 수정 한 우리는 다자간의 사용을 위해 적응했다. 이러한 접근은 빠르고 우리의 분화 유도 후 셋째 주 동안 이미 기능적 신경 네트워크 활동을 얻을 수 있도록 효율적이다. 분화 프로토콜의 과정 동안, 세포는 신경 세포 형태 학적으로 유사하기 시작했다 : 소 공정을 형성하고, 신경 세포는 서로 (도 1a)에 접속을 시작했다. 우리는 개발 과정에서 자신의 신경 세포의 형태와 시냅스 특성을 측정하여, 건강한 제어 hiPSC 라인에서 파생 된 신경 세포의 신경 생리 학적 프로파일을 설립했다. hiPSC 파생 뉴런은 시작 후 다른 일에 MAP2 및 synapsin-1 / 2 염색분화 (그림 2A)의. 유도 된 신경 세포 3 주 분화 유도 한 후 이미 성숙한 신경 세포의 형태를 보여줍니다. synapsin-/ 2 puncta의 (시냅스의 수에 대한 값)의 개수는 synapsin-/ 2 면역 세포 화학 염색에 기반으로 정량화 하였다. synapsin-/ 2 puncta의 수는 신경 연결의 레벨은 또한 (도 2B)을 증가시키는 것을 제안하고, 시간이 지남에 증가했다. 이십삼일 분화 유도 후 synapsin-/ 2 puncta의 수는 두 개의 독립적 인 IPS 라인 (도 2c)에서 유사 하였다. 23 가장 DIV synapsin1 / 2 puncta의에서 기능 시냅스 (그림 2D)에 대한 나타내는 PSD-95 puncta의에 나란히했다. 장 등의 알에 의해 기술 된 결과와 일치. 우리는 범 신경과 서브 타입 별 피질 m에 의해 확인 흥분성 상위 계층 대뇌 피질의 뉴런의 인구를 생성 이러한 BRN2 및 SATB2로 arkers (레이어 II / III). 우리는 깊은 층의 뉴런 CTIP2 (레이어 V) 또는 FOXP2 (레이어 VI) (그림 2E와 F)에 대한 긍정적이었다 신경 세포를 관찰하지 않았다 hiPSC 유래 신경 세포의 전기 생리 활동을 특성화하기 위해, 우리는 개발 과정에서 측정 하였다 이러한 신경 세포에 전체 셀 전류 및 전압 클램프 녹음, 즉 고유 특성과 흥분성 입력을 사용했다. 신경 세포는 분화와 세포를 급상승의 비율의 시간 (그림 2G 및 H)를 통해 증가 된 후 이미 주 활동 전위를 생성 할 수 있었다. 또한, 신경 세포 분화 유도 후 일주일 이미 흥분성 시냅스 입력을 수신 : 흥분성 시냅스 입력 모두 주파수와 진폭은 개발 과정 (그림 2I - K)를 증가했다. NT를 "fo를 = 유지-together.within 페이지를"1 "&gt; 더 나은 단일 세포 활성 네트워크 수준의 기능을 형성하는 결합 방법을 이해하려면, 신경이 콘서트에서 작동하는 방법을 연구하는 것이 필수적입니다 다자간에 체외 신경 네트워크 배양 하였다. 신경 역학을 연구하기위한 귀중한 실험 모델을 구성한다. 우리는 6 자 다자간 (그림 2M)에 배양 건강한 제어 hiPSC 라인에서 파생 된 신경 세포의 전기 생리 네트워크 활동의 20 분을 기록했다. 몇 주를 분화 유도 한 후, 신경 세포 . 건강한 제어 hiPSCs에서 파생 된 자연 이벤트 (0.62 ± 0.05 스파이크 / s의도 2N) 표시, 기능적으로 활성 신경 네트워크를 형성 (즉, 16 D 분화의 시작 후) 개발이 단계에서 모든 채널을 포함하는 어떤 동기 이벤트가 없습니다 . 신체의 체중 측정 (그림 2O) 검출의 네트워크 활동의 수준은 개발 과정에서 증가 : t 후 넷째 주에 (도 2N 2.5 ± 0.1 스파이크 / s) 상기 장치의 모든 웰에 그 분화 유도는 신경 네트워크는 자발 활동의 높은 수준을 나타내었다. 긴 시간과의 네트워크도 전시 동기식 네트워크 버스트 (4.1 ± 0.1 버스트 / 분, 그림 2O) (2,100 ± 500 밀리 초). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> 그림 1 : 뉴런에 hiPSC 차별화. 커버 슬립에 신경 세포에 hiPSCs 분화 A. 세 시점. 다자간에 hiPSCs의 B. 도금. C. 성상은 T75 플라스크에 100 % 컨 플루 언시 (세포가 모자이크 단층을 형성 있습니다). 스케일 바 : 150 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1 "&gt; :"유지 - together.within 페이지 = FO "e_content <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> 그림 2. 신경 세포 특성을 hiPSC는 유래. A. hiPSC 유래 뉴런 분화 개시 후 MAP2 (녹색) 및 synapsin-1 / 2 (적) 다른 날에 대해 염색 하였다. 스케일 바 : 10 μm의. 두 개의 독립적 인 실험에서 synapsin의 puncta의의 B. 정량. 각 실험에서, 적어도 10 세포를 분석 하였다. 두 개의 독립적 인 IPS 라인에서 파생 된 신경 세포의 DIV23에서 synapsin puncta에의 C. 정량화. D. hiPSC 유래 신경 PSD-95 (녹색)에 대한 염색 및 synapsin-1 / 2 (적) 이십삼일를 분화 개시 후 하였다. Synapsin puncta의는 PSD-95 puncta에 병렬 배치된다. E. hiPSC 파생 뉴런은 MAP2 (녹색) 및 BRN2 (빨간색) 또는 SATB2 (빨간색)의 분화 시작 후 23 일 동안 염색 하였다. MAP2 양성 세포의 F. 비율이표시된 마커에 대한 긍정적이었다. 이 활동 전위를 나타내는 G. 대표 전류 클램프 녹음은 초기 분화 시작 후 7 일 이내로서 생성 할 수 있습니다. 하나 이상의 활동 전위를 표시 분화의 유도 후 다른 일에 세포의 H. 비율. I. 분화 후 다른 일에 hiPSC 유래 신경 세포에 의해 수신 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSCs)의 대표 흔적. 개발하는 동안 흥분성 시냅스 후 전류의 J. 주파수. 개발하는 동안 흥분성 시냅스 후 전류의 K. 진폭. L. 대표 (제어)없이 CNQX (CNQX)와 EPSC 녹음의 추적합니다. 하나 hiPSC 라인에서 파생 M. 뉴런은 6 웰 MEA에 배양 및 네트워크 활동은 hiPSC 파생 신경 네트워크 (16)과 분화의 유도 후 23 일 동안 표시됩니다. 에서 기록 된 활동각 웰 (10 kHz에서의 샘플링 속도)를 다른 색으로 표시됩니다 (기록의 20 분의 5 분이 표시됩니다). N. 발사 속도 (16)과 분화의 유도 후 23 라. O. 붕괴 속도 (16)과 분화의 유도 후 23 라. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 결과를 감안할 때, 생성 hiPSC 유래 신경의 품질은 세포의 신경 생리 학적 프로파일을함으로써 평가 될 수있다. 즉, 3 ~ 4 주 평가할 수 분화, 형태, synapsin-1 / 2의 발현 및 신경 세포의 전기 생리 개시 후이다. 그 시점에서, hiPSC 유래 뉴런 MAP2, synapsin / PSD-95 양성 면역 세포 화학을 수행되도록하는 뉴런과 같은 형태를 표시하고 exhibi 예상t 자발적인 전기 생리 활성 (모두 단일 셀 및 네트워크 수준에서).

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

이 신경 분화 프로토콜의 전반적인 목표는 미세 전극 어레이에서 성장하는 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 빠르고 통제된 방식으로 신경 네트워크를 생성하는 것입니다. 이 방법은 신경 과학 분야의 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 신경 장애의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있지만 보다 근본적인 신경생물학적 질문을 해결하는 데에도 사용할 수 있습니다.이 기술의 가장 큰 장점은 유도 만능 줄기 세포를 통제된 방식으로 뉴런으로 빠르게 분화할 수 있다는 것입니다. 첫날에는 DMEM/F12, CDS 및 E8 배지를 1%페니실린 스트렙토마이신이 함유된 상태로 실온으로 가열합니다. 다음으로, E8 배지에 독시사이클린을 첨가하여 밀리리터당 4마이크로그램의 최종 농도를 만든 다음 혼합물에 암석 억제제를 첨가합니다.RTTANGN2 양성 hiPSC의 사용된 배지를 흡인하고 세포에 1ml의 CDS를 추가합니다. 그 후, 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 3-5분 동안 세포를 배양합니다. 현미경으로 세포가 서로 분리되고 있는지 확인하십시오.그런 다음 웰에 2밀리리터 DMEM/F12를 추가합니다. 1, 000 마이크로 리터 피펫으로 세포를 부드럽게 매달아 15 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 7ml의 DMEM/F12를 세포 현탁액에 첨가하고 5분 동안 200 x g에서 세포를 회전시킵니다.5분 후 상층액을 흡입하고 준비된 E8 배지 2ml를 추가합니다. 1,000 마이크로리터 피펫의 끝을 15 밀리리터 튜브의 측면에 대고 세포를 부드럽게 재현탁하여 hiPSC를 해리합니다. 현미경으로 세포가 해리되었는지 확인하십시오.그런 다음 혈구계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 결정합니다. 6개의 웰 MEA의 경우, 셀을 희석하여 7.5 곱하기 10의 세포 현탁액을 1밀리리터당 5번째 세포에 얻습니다. 커버 슬립의 경우, 세포를 희석하여 밀리리터당 4번째 세포에서 4배 10의 세포 현탁액을 얻습니다.커버 슬립에서 희석된 라미닌과 6개의 웰 MEA를 흡인합니다. 6개의 웰 MEA의 경우, 각 웰의 활성 전극 영역에 100마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하여 셀을 플레이트화합니다. 그런 다음 24웰 플레이트의 각 웰에 500마이크로리터의 세포 현탁액을 추가하여 셀을 플레이트합니다.다음으로, 6웰 MEA 또는 24웰 플레이트를 가습된 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 2시간 후 준비된 E8 배지 500마이크로리터를 6웰 MEA의 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 6개의 웰 MEA를 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에 밤새 놓습니다.3일째에는 0.05%트립신-EDTA를 실온으로 데웁니다. 1% 페니실린 스트렙토마이신으로 DPBS 및 DMEM/F12를 섭씨 37도까지 가열합니다. 그런 다음 쥐 성상세포 배양의 사용된 배지를 흡인합니다.5ml의 DPBS를 첨가하여 배양물을 씻고 부드럽게 헹굽니다. 그 후, DPBS를 흡인하고 0.05%트립신-EDTA 5ml를 첨가합니다. 트립신-EDTA를 부드럽게 휘젓습니다.그런 다음 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 현미경 아래를 확인하여 세포가 분리되었는지 검사합니다. 플라스크를 몇 번 눌러 마지막 셀을 분리합니다.그런 다음 플라스크에 DMEM/F12 5ml를 추가합니다. 10ml 피펫으로 플라스크 내부의 세포를 부드럽게 평가해 보십시오. 그런 다음 15ml 튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.200 x g에서 튜브를 8분 동안 돌립니다. 그 후, supernatent를 흡인하고 DMEM/F12 1밀리리터에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 밀리리터당 세포 수를 결정합니다.다음으로, 6개의 웰 MEA의 각 웰에 있는 네 번째 성상세포에 7.5 곱하기 10을 추가합니다. 그리고 24 웰 플레이트의 각 웰에 네 번째 성상세포에 10을 두 번 추가합니다. 세포를 섭씨 37도의 가습된 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.1, 200배 증폭에서 데이터를 수집하고 MCS 데이터 수집 카드를 사용하여 10킬로헤르츠에서 신호를 샘플링합니다. MEA에서 배양된 hiPSC 유래 뉴런의 전기생리학적 활성을 20분 동안 기록합니다. 기록하는 동안 온도를 섭씨 37도로 유지하고, 가습 가스의 흐름을 지속적으로 MEA에 천천히 전달하여 매체 증발 및 pH 변화를 방지합니다.그런 다음 사용자 지정 소프트웨어 패킷을 사용하여 데이터를 분석합니다. 이 그림은 분화 과정 동안 시냅신에서 신경 세포 마커 MAP2의 발현 변화를 보여주며, 이는 신경 세포 성숙을 나타냅니다. 이 그래프는 분화 과정에서 증가된 개별 세포에 대해 시냅신 발현이 측정되었음을 보여줍니다.PSD-95와 함께 국소화된 3주간의 분화 후 세포에서 발현되는 시냅신은 기능적 시냅스의 존재를 나타냅니다. 여기서, 세포의 전기생리학적 활성을 측정하기 위해 분화 과정 중 다른 시점에서 전체 세포 패치 클램프를 수행했습니다. 세포는 서로 다른 시점에서 활동 전위를 생성할 수 있었습니다.그리고 시간이 지남에 따라 증가한 스파이크 세포의 비율은 대부분의 세포가 분화 초기 단계에서도 활동 전위를 생성할 수 있음을 보여줍니다. 패치 클램프는 또한 세포가 받는 흥분성 시냅스후 전류를 측정하는 데 사용되었습니다. 세포가 분화 과정에서 받는 입력의 수가 증가했습니다.흥분성 시냅스후 전류의 주파수와 진폭은 모두 분화 과정에서 증가했습니다. 미세전극 어레이에서 분화된 세포의 전기생리학적 활성은 분화 과정에서 측정되었습니다. 여기서, 분화 과정에서 뉴런 네트워크 활성이 증가했고, 23일 후에 동시 이벤트를 보여주었습니다.일단 숙달되면, 이 기술은 3-4주 이내에 유도 만능 줄기 세포를 기능적 신경 네트워크로 분화시키는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 무균 상태로 작업하고 세포를 부드럽게 다루는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 약리학적 검사와 같은 다른 방법을 사용하여 환자의 세포주에서 관찰된 표현형을 구출할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 신경 장애의 네트워크 활동 결함을 공식적으로 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 만능 줄기 세포를 빠르고 통제된 방식으로 분화하고 뉴런으로 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

rapid-neuronal-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-for

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 흥분성 피질 뉴런을 생성하는 방법을 보여줍니다. 독시사이클린 유도 시, hiPSC는 신경 특이적 전사 인자인 뉴로게닌-2를 과발현합니다. 특정 배지를 사용하고 성상세포와 공동 배양함으로써, 이 과정은 hiPSC가 시냅스 연결을 가진 뉴런으로 분화하는 것을 용이하게 합니다.

Differentiating human-induced pluripotent stem cells into neurons on micro-electrode arrays (인간 유도 만능 줄기세포를 마이크로 전극 어레이의 뉴런으로 분화)

이 비디오는 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 뉴런의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법을 보여줍니다. 뉴런-성상세포 공동 배양을 포함하는 멀티웰 MEA의 전기생리학적 활성을 기록하여 네트워크 내 여러 뉴런의 활동 전위를 감지하여 hiPSC가 뉴런으로 성공적으로 분화되는 것을 확인합니다.

마이크로 전극 어레이를 사용한 뉴런 네트워크의 전기생리학적 활성 측정

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

설계, 치료, 세포 도금 및 기능적으로 간 연결 회로의 구성, 모듈 형 신경 네트워크의 배양 표면

인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 약물 및 화학 스크리닝 및 신경 독성을 포함한 독성 시험을위한 새로운 시험 관내 모델 개발을위한 강력한 도구로 간주됩니다. 여기, hiPSCs의 뉴런과 glia 로의 차별화에 대한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

인간 독성 Pluripotent 줄기 세포의 신경 독성 테스트를위한 뉴런과 Glia의 혼합 문화로의 분화를위한 프로토콜

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

이 프로토콜은 인간 줄기 세포로부터 분화된 배양 뉴런에 순환 올레핀 공중합체로 성형된 구획화된 미세 유체 칩의 사용을 입증한다. 이 칩은 기존의 구획 형 폴리 (디메틸 실록산) 장치보다 사전 조립되고 사용하기 쉽습니다. 바이러스성 표지, 유동성 격리, 축사 절제술 및 면역 염색을 포함하여 다중 일반적인 실험 패러다임은 여기에서 기술됩니다.

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

본 문서는 멀티웰 MEA 플레이트상에서 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포(hiPSC-CM) 네트워크의 개발을 위한 프로토콜 세트를 함유하고 있으며, 작용 전위 측정을 위해 세포막을 가역적으로 전기화한다. 높은 처리량 기록은 며칠 동안 반복적으로 동일한 셀 사이트에서 얻어진다.

재발 동작 전위 기록을 위한 멀티웰 마이크로 전극 어레이의 인간 iPSC 유래 심근구 네트워크

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

학습하세요 hiPSC를 신경 세포로 빠르게 분화시키고 마이크로 전극 배열에서 네트워크 활동을 측정하는 방법을. 이 기술은 신경 생물학 메커니즘 및 신경계 질환 연구에 활용됩니다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

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