Name: 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 FRET 기반 바이오센서를 활용하여 살아있는 세포에서 핵 LINC 복합체에 작용하는 근수축력을 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 세포 역학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 (DEC에) R35GM119617을 부여 토마스 F.와 케이트 밀러 제프리스 Memoria (DEC에) 신뢰와 NIH에 의해 지원되었다. 공 초점 현미경 영상은 VCU 나노 물질 특성 코어 (NCC) 시설에서 수행되었다.

1. Nesprin-2G 센서 DNA 및 다른 플라스미드 DNA를 구합니다 <ol><li> 상업적인 소스로부터 Nesprin 2G-TS (인장 센서) Nesprin HL-2G (헤드리스) 제어 mTFP1 금성 및 TSmod를 구합니다. 모든 DNA 플라스미드를 전파 이전 12,13 바와 같이, 이러한 DH5-α 표준 E. 콜라이 균주를 사용하여 정제. </li></ol> Nesprin-2G 및 기타 플라스미드 DNA 2. 형질 세포 <ol><li> 온도 (37 ° C) 및 CO 2 5 %로 규제 표준 세포 배양 인큐베이터에서 6- 웰 세포 배양 접시에 70-90 %의 합류점에 NIH 3T3 섬유 아세포의 세포 성장. 세포 성장 매체의 경우, 10 % 소 태아 혈청 둘 베코의 변형 이글 중간 (DMEM)을 사용합니다. </li><li> 세포 배양 후드에서, 배지를 제거하고 감소 된 혈청 배지 세포의 약 1 mL로 각 웰을 씻어. 각 웰에 감소 혈청 세포 매체의 800 μL를 추가상기 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 배치했다. </li><li> 지질 담체 용액 35 μL와 함께 1.5 ㎖의 튜브에 감소 된 혈청 세포 배지 700 μL 피펫은 &quot;lipomix&quot;를 형성한다. 피펫으로 섞는다. 에 &quot;L.&quot;로 튜브 라벨 </li><li> 여섯 개 1.5 ㎖의 튜브를 수집하고, 각 관으로 감소 된 혈청 세포 배지 6 μL 피펫 (100)을 통해 1 라벨. <ol><li> mVenus 항 피펫 1 μg의 튜브에 튜브 (3) 및 제 피펫 1 mTFP의 μg의로 튜브 1 및 2 피펫 2 Nesprin-HL의 μg의 한 단계 1 피펫 2 Nesprin 2G-TS의 μg의으로부터 플라스미드 DNA의 농도를 사용하여 튜브 (6)에 다시 사용하지 마십시오 피펫 팁을 DNA의 다른 유형을 피펫 팅 할 때. </li></ol></li><li> 각 분류 관 (1-6)에 &quot;L&quot;튜브로부터 lipomix 100 μL 피펫 및 피펫 팅을 반복하여 혼합한다. 각 튜브에 대한 깨끗한 피펫을 사용합니다. 10 ~ 20 분 동안 품어. </li><li> 70-90 % 합류로 6 웰 챔버의 웰에 각각 분류 관에서 200 μL를 추가세포. 해당 DNA와 각 웰의 상부에 라벨했다. 4-6 시간 동안 인큐베이터에서 6- 웰 챔버를 놓는다. </li><li> 배지를 흡인하고 린스 감소 된 혈청 배지 셀 1-2 mL를 첨가. 상기 감소 된 - 혈청 배지를 세포 기음 각 웰에 트립신 2 mL를 첨가하고, 인큐베이터 (5-15 분)로 6 웰 접시를 배치했다. </li><li> 세포 배양기에서 분리되지만, 피막 (6) 유리 바닥은 인산 완충 용액 (PBS)에 용해 된 20 ㎍ / ml의 농도에서 피브로넥틴의 층으로 요리를보고. 코팅하는 요리를 세포 배양 후드 (약 20 분)의 표면을 허용한다. </li><li> 세포가 분리되면 DMEM 2 용액을 첨가함으로써 트립신을 중성화. </li><li> 또한 표지 된 15 mL의 원심 분리 튜브에 각각의 콘텐츠를 전송하고 스윙 로터 원심 분리기에서 5 분 동안 90 XG에서 스핀 다운. 상등액을 흡인 피펫 혼합하여 DMEM 1000 μL의 각 세포 펠렛을 다시 일시. </li><li> 로부터 피브로넥틴 혼합물 기음유리 접시 피펫 유리 접시 상에 각 세포 현탁액을 1000 μL. </li><li> 세포가 유리 접시의 바닥 (~ 15 분)에 정착 한 후, 세포 배양기에서 잘 장소 각각 다른 DMEM 1 ㎖의 + 10 % FBS + 1 % 스트렙토 펜을 추가한다. 세포가 적어도 18 ~ 24 시간 동안 센서를 부착하고 표현 할 수 있습니다. 참고 : 세포 상업 양이온 성 지질 형질 전환 시약 (재료의 표 참조)을 사용하여 형질 전환된다. 대안 적으로, 안정한 세포주는 독소에 대한 내성을 부여하는 유전자를 가진 플라스미드를 사용하여 선택 될 수있다 (Nesprin-TS와 -hl 대한 pcDNA 벡터 플라스미드 네티 신 내성을 발현하는 세포 (물질의 표를 참조)를 제공하는 DNA 저장소 사이트에서 사용할 ). 또한 바이러스 감염 방법 (렌티 바이러스, 레트로 바이러스 또는 아데노 바이러스)를 형질 어렵다 셀 센서를 표현하는데 이용 될 수있다. </li><li> Nesprin-TS 외에도 Nesprin HL 제로위한 부가적인 세포를 형질CE 제어 2.1-2.12 단계에서 설명한 바와 같이, TSmod 또한 제로 - 힘 제어로 사용될 수 Nesprin HL-유사한 FRET을 발휘한다. </li><li> mTFP1 금성로 형질 세포 스펙트럼 지문 (단계 4 참조)를 생성한다. 참고 mTFP1 금성은 일반적 Nesprin-TS보다 높은 수준의 발현과 같은 DNA의 하부 양 유사한 발현 수준을 달성하기 위해 형질 전환 될 필요가있다. </li></ol> 3. 형질 전환 효율을 확인 <ol><li> 대략 18-24 시간 형질을 마친 후,도 셀 (통상 5-30 %)의 총 수에 형광 세포의 수를 비교하여 형질 전환의 효율을 조사하기 반전 형광 현미경을 사용한다. <ol><li> 462 나노 미터 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 및 492 nm의 (mTFP1) 또는 525 나노 미터 (금성) 근처에 중심 발광 필터 근처의 여기 주파수가 장착 된 형광 현미경을 사용한다. 참고 : 또는 GFP 필터 세트 mTFP1의 조합을 캡처했습니다 것NUS 배출량은 형질 전환 효율의 확인을 허용합니다. </li></ol></li><li> 형질 전환 후 48 시간 내에 이미지 살아있는 세포. <ol><li> 대안 적으로, 48 시간 후 8 PBS에서 5 분간, 상점, 볼 (칼슘 및 마그네슘과 PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다. 참고 : 48 시간을 넘어, 신호 품질 및 강도는 붕괴. 세포를 고정하기 (8)로 표현되는 FRET 포함한 상태를 유지; 매체를 장착하여 FRET (14)에 영향을 미칠 수있다 그러나, 셀은, PBS에 이미징되어야한다. 표정의 변화가있을 수에 따라 고정 셀은 다른 셀에 고정 비교 될 수있다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 할 것. </li></ol></li></ol> 스펙트럼 Unmixing에 대한 mTFP1과 금성 형광 발색단 4. 캡처 스펙트럼 지문 <ol><li> 세포 배양 후드에서 촬상 mediu와 세포 배지를 교체10 % 소 태아 혈청 m (HEPES 완충). </li><li> 온도 제어 (37 ° C) 공 초점 레이저 주사 현미경 단계에서 보는 요리를 놓는다. </li><li> 1.4 개구 수 60X 배율 오일 대물 위에 mTFP1 형질 세포 유리 뷰잉 접시 놓는다. 주 : 오일 밀접 유리 기판의 굴절률이 유사 할 60X 대물 렌즈에 레이저 스캐닝 현미경에 사용된다. 오일은 대물 렌즈의 상단에 배치하고 유리 커버 슬립과 직접 접촉한다. </li><li> mTFP1는 458 nm의 여기 원 및 500 nm의 발광 중심 대역 통과 필터로 발현 세포를 찾아. </li><li> 시야에서 형광 셀 (여기에서 사용되는 소프트웨어 &quot;람다 모드&quot;) 스펙트럼 검출 모드를 선택하고, 분광 화상 (도 3-1)을 캡처; 10 개 나노 미터 단위 (도 3-3)을 이용하여 458 nm의 이후의 모든 주파수를 포함한다. 밝은 fluoresc를 선택셀 (20 화소 반경)에 ENT 영역 (ROI). 참고 : mTFP1 발현 투자 수익 (ROI)의 스펙트럼 형태는 셀에 걸쳐 상대적으로 일정하게 유지해야한다. 형상이 현저하게 변화되면, 레이저를 재조정하고, 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 설정을 얻는다. </li><li> 클릭하여 스펙트럼 데이터베이스에, 형광 ROI 의미 정규화 강도를 추가 &quot;데이터베이스에 스펙트럼을 저장합니다.&quot; </li><li> 레이저 파워를 최적화하고 양호한 신호 대 잡음비가 성취되도록 얻는다. 설정은 다른 장비에 따라 다를 것입니다. 배경 기준으로 비 - 형광, 형질 감염되지 않은 세포를 사용하여, 그러나, 검출기 (포화)의 동적 범위를 넘어, 세포가 밝은 때까지 상기 이득과 전력을 증가시킨다. 배경 세포는 평균 후 감지 형광 없어야합니다. </li><li> 다음을 제외 금성 - 형질 전환 된 세포의 과정을 반복합니다 : <ol><li> 여기 주파수가 515 nm에서인지 확인하고, 밴드 패스 필터는 CE라고금성 발현 세포를 찾을 때 530 나노 미터 근처 ntered. </li><li> 의 &quot;스펙트럼 모드&quot;내지 515 대신 458 nm 인 여기 주파수를 사용한다. </li></ol></li></ol> 5. 캡처 혼합하지 않은 이미지 <ol><li> 에 캡처 모드 전환 &quot;스펙트럼 Unmixing을.&quot; </li><li> unmixing 채널로 (도 3, 화살표 2) 금성 mTFP1의 스펙트럼 지문을 추가한다. </li><li> 다시 458 nm의 아르곤 소스 여진 레이저를 설정한다. </li><li> 60X 오일 대물 위 Nesprin-TS 볼 접시 놓는다. </li><li> 충분히 밝은 식 형광 세포에 집중하면, 신호 대 잡음비를 최적화하는 게인 및 레이저 파워를 조정한다. 참고 Nesprin-TS의 FRET 효율은 20 % 가까이 있기 때문에, 혼합되지 않은 금성 화상이 섞이지 mTFP1 이미지보다 실질적으로 더 어둡게 될 것이다. 허용 전력 및 이득 설정이 반복적으로 결정되면, 이들 매개 변수는 모두 이미지 대위에 대한 일정하게 유지해야ured. </li><li> (모든 포화 화소 화상 처리 동안 제거되는) 비교적 유사한 밝기 Nesprin-TS 셀 15-20 이미지 캡처 최소 화소 과도한 포화를 방지. </li><li> 동일한 촬상 파라미터를 사용하여 HL-Nesprin 세포 촬상 처리를 반복한다. </li></ol> 6. 이미지 프로세싱 및 비율 이미지 분석 <ol><li> 사용하여 오픈 소스 ImageJ에 (피지) 소프트웨어 (http://fiji.sc/), BioFormats Reader를 사용하여 열려있는 기본 형식 이미지. </li><li> 전 과정을 이미지와는 이전에 설정된 프로토콜 15을 사용하는 비율 이미지를 계산한다. </li></ol>

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방법 및 Nesprin-2G 핵 LINC 복잡 단백질 걸쳐 기계적 장력 생균 촬상 시연은 위에서 언급되었다. 이전이 연구에, 이러한 마이크로 피펫 흡인 세포 계측법, 자성 비드, 현미경 레이저 절제와 같은 다양한 기술들은, 세포핵에 변형을 적용하고, 벌크 물성 16, 17, 18을 측정하기 위해 사용되었다. 그러나, 최근의 작품까지, 어떤 연구는 직접 인장 힘은 살아있는 세포 2에 LINC 복잡한 단백질에 직접 전달되는 것을 보여 없었다. 이전에, 우리 실험실 미니 Nesprin2G라고도 Nesprin2G, 수정 된 버전 TSmod (도 2c) 2로 알려진 FRET 력 프로...

포스 성 유전자 부호화 FRET 센서 최근 생균 인장 계의 힘을 측정하는 단백질 1, 2, 3, 4에인가되는 방법을 기계적 힘에 대한 통찰력을 제공하기위한 중요한 도구로 떠오르고있다. 이러한 도구를 사용하여, 연구자들은 기존의 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포에서 비 침습적 영상 세포 내 힘 수 있습니다. 이러한 센서는 탄성 펩티드 (3)에 의해 분리 된 FRET 쌍 (도너와 억 셉터 형광 단백질, 자주 청색 공여체 및 수용체 노란색)로 구성된다. C- 또는 N- 말단 태그 대조적으로,이 센서는 분자 스트레인 게이지로서 행동하고,이 단백질에 걸쳐 전송되는 기계적인 힘을 측정 할 수있는 단백질의 내부 부위에 삽입된다. 프렛-P 사이의 증가 된 거리에서 센서 결과 걸쳐 기계적 장력을 증대공기 감소 FRET 3의 결과. 그 결과, FRET 반비례 인장력에 관한 것이다. 이러한 형광 기반 센서는 초점 접착 단백질 (vinculin 3 talin 4), 세포 골격 단백질 (α-티닌 5), 및 세포 - 세포 접합 단백질을 위해 개발 된 (E-cadherin의 6, 7, VE-cadherin의 8 및 PECAM 8). 이러한 바이오 센서에서 가장 자주 사용되는 잘 특징으로하는 탄성 링커 TSmod라고도하고 거미줄 단백질 flagelliform로부터 유도 된 40 개 아미노산 (GPGGA) (8)의 반복되는 시퀀스로 구성된다. TSmod은 인장력 3/5 PN 1 FRET에 응답하여 선형 탄성 나노 스프링처럼 행동하는 것으로 나타났다. flagelliform의 다른 길이는 동적 R을 변경하는 데 사용할 수 있습니다TSmod FRET 힘 감도 (9)의 플랜지. flagelliform 외에도 스펙 트린은 (HP35라고도 함) (5)와 villin 투구 펩티드 4는 유사한 포스 바이오 센서 (4) 사이의 FRET 쌍 탄성 펩티드로서 사용되어왔다를 반복한다. 마지막으로, 최근의 보고서는 TSmod는 압축력 (10)를 감지하는 데 사용할 수 있다는 것을 보여 주었다. 최근 TSmod 내생 비슷하게 동작 미니 Nesprin2G (도 2C)로 알려진 이전에 개발 된 절두 Nesprin2G 단백질 삽입 이용하여 nucleo - 골격 (LINC) 복합 단백질 Nesprin2G의 링커 힘 센서를 개발 Nesprin-2G (11). LINC 복합체는 핵에 얇은 골격을 연결하는 세포질, 핵의 외부에서 내부로 이끌어 다중 단백질을 포함한다. Nesprin-2G는 구조적 단백질에 결합되는 두세포질과 핵 주변 공간에 태양 단백질 액틴 세포 골격. 우리의 바이오 센서를 사용하여, 우리는 Nesprin-2G는 NIH3T3 섬유 아세포 2 액토 마이 오신에 의존 긴장 될 수 있음을 보여줄 수 있었다. 이것은 그 힘이 바로 핵 LINC 단지에 단백질을 통해 측정 한 처음, 그리고 제어 공학의 핵에 힘의 역할을 이해하는 중요한 도구가 될 가능성이 높습니다. 프로토콜은 아래 Nesprin-을 발현하는 세포의 FRET 화상의 포유 동물 세포에서 Nesprin 장력 센서 (Nesprin-TS)의 발현뿐만 아니라, 수집 및 분석을 포함하여 Nesprin-2G 힘 센서를 사용하는 방법의 상세한 방법을 제공한다 TS. 분광 검출기를 구비 한 반전 된 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여, 발광 증감을 측정하는 방법을 설명 unmixing 스펙트럼을 이용하여 비율 적 FRET FRET 및 촬상이 제공된다. 출력 이미지가 상대적 비율 적 ...로서 확인하는데 사용될 수있다ntitative 힘 비교. 이 프로토콜은 섬유 아세포 Nesprin-TS의 발현에 집중되는 반면, 세포주 및 일차 전지 모두 포함한 다른 포유 동물 세포에 쉽게 적응할 수있다. 또한, 이미지 수집 및 FRET 분석에 관련된 프로토콜이 용이 다른 단백질에 대해 개발 된 다른 FRET 기반 포스 바이오 센서에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>https://www.addgene.org/68127/</td></tr> <tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128</td>에서 <td>검색 https://www.addgene.org/68128/</td></tr> <tr><td>mTFP1 DNA</td><td>Addgene</td><td>54613</td><td>에서 검색 https://www.addgene.org/54613/</td></tr> <tr><td>mVenus DNA</td><td>Addgene</td><td>27793</td><td>에서 검색 https://www.addgene.org/27793/</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>https://www.addgene.org/26021/</td></tr> <tr><td>Competent Cells</td>에서 검색 <td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>액체 LB 매체</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 고체 LB 세균 배양 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>석영 큐벳</td><td>Biorad</td><td>1702504</td><td>SmartSpec Plus용 큐벳</td></tr><tr><td>DNA 분리 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>6-웰 세포 배양 접시</td><td>Falcon-Corning</td><td>353046</td><td>Multiwell 6-웰 폴리스렌 배양 접시</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) 세포 배지</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>환원 혈청 세포 배지</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>환원 혈청 배지, "optimem"</td></tr><tr><td>지질 캐리어 솔루션</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>지질 시약, "Lipofectamine 2000"</td></tr><tr><td>1.5 mL 멸균 플라스틱 튜브</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td></tr><tr><td>유리 바닥 현미경 관찰 접시</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm 접시 20 mm 바닥 웰 #1.5 유리</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>피브로넥틴 인간 단백질, 플라즈마</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco의 인산염 완충형 식염수</td></tr><tr><td>15 mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>스윙 로터 원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo electron</td><td>Centra CL2</td><td>스윙 로터 thermo electron 236</td></tr><tr><td>세포 배양 생물 안전성 후드</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>기후 제어 세포 배양 인큐베이터</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>도립 LED 광시야 형광 현미경</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Clear HEPES 버퍼 이미징 매체</td><td>분자 프로브</td><td></td><td></td>A14291DJ</tr><tr><td>Fetal bovine Serum</td><td>Life technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>온도 제어-역 컨포칼 w/458 및 515 nm 레이저 소스&nbsp;</td><td>자이스</td><td>&nbsp; LSM 710-w/스펙트럼 META 검출기</td><td></td></tr><tr><td>Outgrowth Media</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 섬유아세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

포스터 공명 에너지 전달 (fret) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 linc 단지에서 기계의 힘을 측정하는

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

LINC 복합체는 세포골격에서 핵으로 기계적 힘의 전달을 중재하는 중요한 구조라는 가설이 세워져 있습니다. Nesprin-2G는 액틴 세포골격을 핵주위 공간의 막 단백질(SUN 도메인 단백질)에 연결하는 LINC 복합체의 핵심 구성 요소입니다. 이러한 막 단백질은 핵 내부의 라민(lamin)에 연결됩니다. 최근에는 Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 힘 프로브를 mini-Nesprin-2G(Nesprin-TS(장력 센서))에 복제하여 살아있는 NIH3T3 섬유아세포에서 Nesprin-2G의 장력을 측정하는 데 사용했습니다. 이 논문은 Nesprin-TS를 사용하여 NIH3T3 섬유아세포에서 LINC 복합력을 측정하는 과정을 설명합니다. Nesprin-TS에서 FRET 정보를 추출하기 위해 원시 스펙트럼 이미지를 수용체 및 공여 형광 채널로 스펙트럼 혼합하는 방법에 대한 개요도 제시됩니다. 오픈 소스 소프트웨어(ImageJ)를 사용하여 이미지를 사전 처리하여 비율계량 이미지로 변환합니다. 마지막으로 Nesprin-TS의 FRET 데이터와 여러 실험 그룹 간의 데이터를 비교하는 방법에 대한 전략이 제시됩니다.

전술 한 프로토콜에 따라, 플라스미드 DNA는 DNA 저장소로부터 취득하고, 대장균에 형질 전환. 센서 DNA를 발현하는 대장균을 LB / 암피실린 플레이트로부터 선택 LB 액체 배지에서 증폭 하였다. 벡터의 증폭에 이어, 플라스미드 DNA는 표준 시판 DNA 분리 키트를 이용 TRIS-EDTA 버퍼로 정제 하였다. 분광 광도계를 사용하여, 정제 된 DNA는 ㎍ / ㎖ (도 1a, 1-2 일), 표준의 농도로 정량 하였다. NIH3T3 섬유 아세포를 사용하여, 세포를 6- 웰 세포 배양 플라스틱 접시에 70-90 %의 합류로 성장시켰다. NIH3T3 세포로의 플라스미드 DNA를 삽입하기 위해, 지질 - 매개 형질 감염, 플라스미드 수행 하였다. 시판되는 형질 감염 시약 (물질의 표를<...

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

이 절차의 전반적인 목표는 LINC 복합 단백질인 nesprin-2G용으로 설계된 바이오센서를 통해 살아있는 세포에서 FRET 현미경을 통해 핵골격 세포골격 또는 LINC 복합체의 링커에 가해지는 힘을 측정하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 세포의 핵에 있는 단백질에 가해지는 힘과 이러한 힘이 변형 조건에서 어떻게 변하는지와 같은 메카노트랜스듀션(mechanotransduction) 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질과 살아있는 세포에 가해지는 매우 작은 수준의 힘을 측정할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 이미지를 캡처하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 모든 실험 그룹 간에 양호한 신호를 수신하기 위해 현미경 레이저 출력과 게인을 최적화하는 것은 어렵습니다. 먼저 온도 및 CO2 조절이 가능한 표준 세포 배양 인큐베이터의 6웰 세포 배양 접시에서 NIH 3T3 파이버 블라스트 셀을 70%에서 90% 사이의 합류점으로 성장시킵니다.세포 배양 후드에서 배지를 제거하고 약 1ml의 환원된 혈청 세포 배지로 각 웰을 헹굽니다. 각 웰에 800마이크로리터의 환원된 혈청 세포 배지를 추가하고 6웰 챔버를 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 700마이크로리터의 환원된 혈청 세포 배지를 35마이크로리터의 지질 운반체 용액과 함께 L로 표시된 1.5ml 튜브에 피펫팅하여 리포 혼합물을 형성합니다.피펫팅으로 현탁액을 혼합합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 환원된 혈청 세포 배지를 1에서 6까지 표시된 6개의 1.5 밀리리터 튜브 각각에 피펫팅합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 nesprin tension sensor, nesprin headless zero force control, mTFP1 및 venus에 대한 혈장 DNA를 튜브 1에서 6까지 피펫팅합니다.다른 유형의 DNA를 피펫팅할 때 피펫 팁을 재사용하지 마십시오. 그런 다음 L 튜브에서 라벨이 지정된 각 튜브로 리포 혼합물 100마이크로리터를 피펫으로 혼합하고 각 튜브에 대해 깨끗한 피펫을 사용하여 반복적인 피펫팅으로 혼합합니다. 현탁액을 10-20분 동안 배양합니다.다음으로, 라벨링된 각 튜브의 200마이크로리터를 세포가 포함된 준비된 6웰 챔버의 웰에 추가합니다. 각 웰의 상단에 해당 DNA가 추가된 라벨을 붙입니다. 그런 다음 6웰 챔버를 4-6시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.배양 후 배지를 흡인하고 1-2ml의 환원된 혈청 세포 배지를 첨가하여 헹굽니다. 환원된 혈청 세포 배지를 흡인하고 각 웰에 2ml의 트립신을 첨가한 후 6웰 접시를 5-15분 동안 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 인큐베이터에서 분리되는 동안 인산염 완충 식염수에 용해된 밀리리터당 20마이크로그램의 농도로 피브로넥틴 층으로 6개의 유리 바닥 관찰 접시를 코팅합니다.접시가 세포 배양 후드의 표면을 코팅하도록 합니다. 세포가 분리되면 2ml의 DMEM을 첨가하여 트립신을 중화합니다. 그런 다음 각 웰의 내용물을 라벨이 붙은 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 스윙 로터 원심분리기에서 5분 동안 90배 g으로 회전합니다.상등액을 흡입하고 피펫을 사용하여 1, 000 마이크로리터의 DMEM에 각 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 유리 접시와 피펫 1, 000 마이크로 리터의 각 세포 현탁액에서 피브로넥틴 혼합물을 접시에 흡입합니다. 세포가 유리 접시의 바닥에 가라앉은 후 각 웰에 1ml의 배지를 더 추가합니다.세포가 세포 배양기에 센서를 부착하고 발현할 수 있도록 최소 18시간에서 24시간 동안 기다립니다. transfection 효율을 확인하려면 mTFP1의 경우 462나노미터, 금성의 경우 525나노미터에 가까운 여기 주파수를 가진 형광 현미경을 사용하십시오. mTFP1의 경우 492나노미터, 금성의 경우 525나노미터 근처에 위치한 방출 필터를 사용합니다.transfection을 완료한 후 약 18-24시간 후에 도립 형광 현미경을 사용하여 형광 세포의 수와 보이는 총 세포 수를 비교하여 transfection의 효율성을 조사합니다. transfection 후 48시간 이내에 살아있는 세포를 이미지화할 수 없는 경우 4%파라포름알데히드에 세포를 5분 동안 고정합니다. 세포가 고정하기 전에 24-48시간 동안 센서를 발현하도록 합니다.PBS에 셀을 저장하고 48시간 후에 볼 수 있습니다. 세포 배양 후드에서 세포 배지를 10%의 소 태아 혈청이 보충된 이미징 배지로 교체합니다. 놓다 viewing 온도 조절 컨포칼 현미경 스테이지에 접시.mTFP1 transfection된 세포가 있는 유리 view접시를 1.4의 개구수로 60X 배율로 오일 대물렌즈 위에 놓습니다. 광시야 형광 모드에서 mTFP1 발현 세포를 찾습니다. 시야에 형광 세포가 있는 상태에서 스펙트럼 검출 모드를 선택하고 스펙트럼 이미지를 캡처합니다.10나노미터 단위를 사용하여 458나노미터를 초과하는 모든 주파수를 포함합니다. 세포에서 밝은 형광 영역을 선택합니다. Save Spectra to Database를 클릭하여 정규화된 농도로 형광 ROI 평균을 스펙트럼 데이터베이스에 추가합니다.레이저 출력과 게인을 최적화하여 우수한 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다. 설정은 장비마다 다릅니다. 금성 발현 세포에 대해 이 과정을 반복하고 스펙트럼 모드를 유지합니다.458나노미터 대신 488나노미터의 여기 주파수를 사용합니다. 필요에 따라 전원 설정을 조정하되 방출 주파수는 변경하지 마십시오. 반경 약 20픽셀의 밝은 형광 ROI를 선택합니다.Save Spectra to Database를 클릭하여 형광 ROI 평균을 정규화된 농도로 스펙트럼 데이터베이스에 추가합니다. 혼합되지 않은 이미지를 캡처하려면 먼저 캡처 모드를 스펙트럼 혼합으로 전환하십시오. 금성과 mTFP1의 스펙트럼 지문을 불혼합 채널에 추가합니다.여기 레이저를 458나노미터 아르곤 소스로 다시 설정합니다. nesprin 장력 센서 놓기 view60X 오일 대물렌즈 위에 접시를 놓습니다. 충분히 밝은 발현을 가진 형광 세포에 초점을 맞춘 후 게인과 레이저 출력을 조정하여 신호 대 잡음비를 최적화합니다.상대적으로 유사한 밝기로 nesprin 장력 센서 셀의 이미지를 최소 15-20개 캡처하고 과도한 픽셀 포화를 방지합니다. 동일한 이미징 파라미터를 사용하여 nesprin 헤드리스 세포로 이미지 캡처 프로세스를 반복합니다. 지질 매개 캐리어를 사용하여 nesprin 장력 센서로 transfection된 3T3 섬유아세포의 대표적인 10X 확대 이미지가 여기에 나와 있습니다.일반적으로 주어진 시야에서 세포의 일부만 형질 주입됩니다. 여기에 표시된 것은 스펙트럼이 혼합되지 않은 비너스 및 mTFP 채널에서 nesprin-TS를 발현하는 두 개의 3T3 핵의 대표적인 쌍입니다. 두 채널의 병합된 컬러 이미지가 맨 오른쪽 패널에 표시됩니다.다음은 패턴화된 기질과 패턴화되지 않은 기질에서 안정적으로 발현되는 MDCK 세포에서 nesprin-TS masked nuclei의 대표적인 샘플링입니다. 비율 이미지는 금성 채널의 비율을 mTFP 채널로 나눈 값으로 정의되며 상대적인 정량적 힘 비교를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 transfection 중에 DNA 튜브에 신중하게 라벨을 부착하고 스펙트럼 결과 이미지를 캡처하는 동안 이미징 매개변수를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 nesprin 장력 센서로 세포를 transfection하고 장력 센서의 힘과 상관 관계가 있는 컴퓨터 FRET 인덱스에 대한 스펙트럼 분해 이미지를 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 경우 FRET 센서가 nesprin에 사용되지만 측정력이 필요한 세포의 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다.

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

여기, 선물이 포스터 공명의 동시 사용에 대 한 프로토콜 에너지 전송 기반 긴장 센서 측정 단백질 역학 힘 민감한 측정을 사용 하는 photobleaching 후 단백질 부하 및 형광 복구를 측정 하 살아있는 세포 내 단백질 역학입니다.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

앙상블 힘 분광법(EFS)은 생물물리학 및 생물감지 분야에서 생체 분자 구조의 앙상블 세트의 기계적 풀림 및 실시간 감지를 위한 강력한 기술입니다.

전단력에 의한 앙상블 힘 분광법

배우세요 FRET 기반 바이오센서를 활용하여 살아있는 세포에서 핵 LINC 복합체에 작용하는 근수축력을 측정하는 방법을 익히세요. 이 기술은 세포 역학 연구에 필수적인 도구입니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

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