포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

이 절차의 전반적인 목표는 LINC 복합 단백질인 nesprin-2G용으로 설계된 바이오센서를 통해 살아있는 세포에서 FRET 현미경을 통해 핵골격 세포골격 또는 LINC 복합체의 링커에 가해지는 힘을 측정하는 것입니다. 이 방법은 살아있는 세포의 핵에 있는 단백질에 가해지는 힘과 이러한 힘이 변형 조건에서 어떻게 변하는지와 같은 메카노트랜스듀션(mechanotransduction) 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단백질과 살아있는 세포에 가해지는 매우 작은 수준의 힘을 측정할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 이미지를 캡처하는 데 어려움을 겪을 것입니다. 모든 실험 그룹 간에 양호한 신호를 수신하기 위해 현미경 레이저 출력과 게인을 최적화하는 것은 어렵습니다. 먼저 온도 및 CO2 조절이 가능한 표준 세포 배양 인큐베이터의 6웰 세포 배양 접시에서 NIH 3T3 파이버 블라스트 셀을 70%에서 90% 사이의 합류점으로 성장시킵니다.

세포 배양 후드에서 배지를 제거하고 약 1ml의 환원된 혈청 세포 배지로 각 웰을 헹굽니다. 각 웰에 800마이크로리터의 환원된 혈청 세포 배지를 추가하고 6웰 챔버를 인큐베이터에 넣습니다. 그런 다음 700마이크로리터의 환원된 혈청 세포 배지를 35마이크로리터의 지질 운반체 용액과 함께 L로 표시된 1.5ml 튜브에 피펫팅하여 리포 혼합물을 형성합니다.

피펫팅으로 현탁액을 혼합합니다. 다음으로, 100 마이크로리터의 환원된 혈청 세포 배지를 1에서 6까지 표시된 6개의 1.5 밀리리터 튜브 각각에 피펫팅합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 nesprin tension sensor, nesprin headless zero force control, mTFP1 및 venus에 대한 혈장 DNA를 튜브 1에서 6까지 피펫팅합니다.

다른 유형의 DNA를 피펫팅할 때 피펫 팁을 재사용하지 마십시오. 그런 다음 L 튜브에서 라벨이 지정된 각 튜브로 리포 혼합물 100마이크로리터를 피펫으로 혼합하고 각 튜브에 대해 깨끗한 피펫을 사용하여 반복적인 피펫팅으로 혼합합니다. 현탁액을 10-20분 동안 배양합니다.

다음으로, 라벨링된 각 튜브의 200마이크로리터를 세포가 포함된 준비된 6웰 챔버의 웰에 추가합니다. 각 웰의 상단에 해당 DNA가 추가된 라벨을 붙입니다. 그런 다음 6웰 챔버를 4-6시간 동안 인큐베이터에 넣습니다.

배양 후 배지를 흡인하고 1-2ml의 환원된 혈청 세포 배지를 첨가하여 헹굽니다. 환원된 혈청 세포 배지를 흡인하고 각 웰에 2ml의 트립신을 첨가한 후 6웰 접시를 5-15분 동안 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 인큐베이터에서 분리되는 동안 인산염 완충 식염수에 용해된 밀리리터당 20마이크로그램의 농도로 피브로넥틴 층으로 6개의 유리 바닥 관찰 접시를 코팅합니다.

접시가 세포 배양 후드의 표면을 코팅하도록 합니다. 세포가 분리되면 2ml의 DMEM을 첨가하여 트립신을 중화합니다. 그런 다음 각 웰의 내용물을 라벨이 붙은 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 스윙 로터 원심분리기에서 5분 동안 90배 g으로 회전합니다.

상등액을 흡입하고 피펫을 사용하여 1, 000 마이크로리터의 DMEM에 각 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 유리 접시와 피펫 1, 000 마이크로 리터의 각 세포 현탁액에서 피브로넥틴 혼합물을 접시에 흡입합니다. 세포가 유리 접시의 바닥에 가라앉은 후 각 웰에 1ml의 배지를 더 추가합니다.

세포가 세포 배양기에 센서를 부착하고 발현할 수 있도록 최소 18시간에서 24시간 동안 기다립니다. transfection 효율을 확인하려면 mTFP1의 경우 462나노미터, 금성의 경우 525나노미터에 가까운 여기 주파수를 가진 형광 현미경을 사용하십시오. mTFP1의 경우 492나노미터, 금성의 경우 525나노미터 근처에 위치한 방출 필터를 사용합니다.

transfection을 완료한 후 약 18-24시간 후에 도립 형광 현미경을 사용하여 형광 세포의 수와 보이는 총 세포 수를 비교하여 transfection의 효율성을 조사합니다. transfection 후 48시간 이내에 살아있는 세포를 이미지화할 수 없는 경우 4%파라포름알데히드에 세포를 5분 동안 고정합니다. 세포가 고정하기 전에 24-48시간 동안 센서를 발현하도록 합니다.

PBS에 셀을 저장하고 48시간 후에 볼 수 있습니다. 세포 배양 후드에서 세포 배지를 10%의 소 태아 혈청이 보충된 이미징 배지로 교체합니다. 놓다 viewing 온도 조절 컨포칼 현미경 스테이지에 접시.

mTFP1 transfection된 세포가 있는 유리 view접시를 1.4의 개구수로 60X 배율로 오일 대물렌즈 위에 놓습니다. 광시야 형광 모드에서 mTFP1 발현 세포를 찾습니다. 시야에 형광 세포가 있는 상태에서 스펙트럼 검출 모드를 선택하고 스펙트럼 이미지를 캡처합니다.

10나노미터 단위를 사용하여 458나노미터를 초과하는 모든 주파수를 포함합니다. 세포에서 밝은 형광 영역을 선택합니다. Save Spectra to Database를 클릭하여 정규화된 농도로 형광 ROI 평균을 스펙트럼 데이터베이스에 추가합니다.

레이저 출력과 게인을 최적화하여 우수한 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다. 설정은 장비마다 다릅니다. 금성 발현 세포에 대해 이 과정을 반복하고 스펙트럼 모드를 유지합니다.

458나노미터 대신 488나노미터의 여기 주파수를 사용합니다. 필요에 따라 전원 설정을 조정하되 방출 주파수는 변경하지 마십시오. 반경 약 20픽셀의 밝은 형광 ROI를 선택합니다.

Save Spectra to Database를 클릭하여 형광 ROI 평균을 정규화된 농도로 스펙트럼 데이터베이스에 추가합니다. 혼합되지 않은 이미지를 캡처하려면 먼저 캡처 모드를 스펙트럼 혼합으로 전환하십시오. 금성과 mTFP1의 스펙트럼 지문을 불혼합 채널에 추가합니다.

여기 레이저를 458나노미터 아르곤 소스로 다시 설정합니다. nesprin 장력 센서 놓기 view60X 오일 대물렌즈 위에 접시를 놓습니다. 충분히 밝은 발현을 가진 형광 세포에 초점을 맞춘 후 게인과 레이저 출력을 조정하여 신호 대 잡음비를 최적화합니다.

상대적으로 유사한 밝기로 nesprin 장력 센서 셀의 이미지를 최소 15-20개 캡처하고 과도한 픽셀 포화를 방지합니다. 동일한 이미징 파라미터를 사용하여 nesprin 헤드리스 세포로 이미지 캡처 프로세스를 반복합니다. 지질 매개 캐리어를 사용하여 nesprin 장력 센서로 transfection된 3T3 섬유아세포의 대표적인 10X 확대 이미지가 여기에 나와 있습니다.

일반적으로 주어진 시야에서 세포의 일부만 형질 주입됩니다. 여기에 표시된 것은 스펙트럼이 혼합되지 않은 비너스 및 mTFP 채널에서 nesprin-TS를 발현하는 두 개의 3T3 핵의 대표적인 쌍입니다. 두 채널의 병합된 컬러 이미지가 맨 오른쪽 패널에 표시됩니다.

다음은 패턴화된 기질과 패턴화되지 않은 기질에서 안정적으로 발현되는 MDCK 세포에서 nesprin-TS masked nuclei의 대표적인 샘플링입니다. 비율 이미지는 금성 채널의 비율을 mTFP 채널로 나눈 값으로 정의되며 상대적인 정량적 힘 비교를 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 8시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 transfection 중에 DNA 튜브에 신중하게 라벨을 부착하고 스펙트럼 결과 이미지를 캡처하는 동안 이미징 매개변수를 일정하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 nesprin 장력 센서로 세포를 transfection하고 장력 센서의 힘과 상관 관계가 있는 컴퓨터 FRET 인덱스에 대한 스펙트럼 분해 이미지를 캡처하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 경우 FRET 센서가 nesprin에 사용되지만 측정력이 필요한 세포의 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다.