Name: ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 ACT-PRESTO 조직 투명화 및 면역표지 기법을 통해 생쥐 장기의 3차원 분자 정보를 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 발달생물학 연구에서 세포 수준 분석을 가능하게 합니다.

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본 연구는 미래창조과학부 국립연구재단(NRF)의 뇌연구사업(NRF-2015M3C7A1028790)의 지원을 받았습니다.

동물 실험은 모든 관련 정부 및 기관의 규정을 준수해야합니다. 시약 1. 준비 <ol><li> 하이드로 겔 모노머 용액 (A4P0)의 경우 : 0.1X 인산 완충 식염수 450 ㎖ (PBS)에 아크릴 아미드의 20g을 추가하고 0.1X PBS로 500 ㎖로 볼륨을 조절합니다. 주의 : 아크릴 아미드 단량체는 독성이. 얼굴 방패, 실험실 코트, 장갑, 및 폐쇄 발가락 신발을 포함, 개인 보호 장비와 흄 후드에서 모든 절차를 수행합니다. <ol><li> 사용 흄 후드 하에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 2,2&#39;- 아조 비스 [2- (2- 이미 다 졸린 -2- 일) 프로판] 하이드로 겔의 모노머 용액 40 ㎖ (A4P0)에 염산염 100mg을 추가 직전 . </li></ol></li><li> 영동 조직 지우기 (ETC) 버퍼 : 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 및 탈 H 2 O (DH 2 O)을 800 mL의 붕산의 12.37 g, 40 g을 추가한다. NaOH로 8.5로 pH를 조정하고로 볼륨을 조절추가 DH 2 O 1 L 주의 : SDS은 유해 화학 물질이고; 따라서,주의해서 처리합니다. </li><li> 입방 마운트 솔루션 : 크로즈 250g, 우레아 125 g을 N, N, N의 125g DH 2 O의 150 ㎖의 &#39;, N&#39;- 테트라 (2- 히드 록시 프로필) 에틸렌 디아민을 추가 부피를 가지고 DH 2 O와 500 ㎖에 </li></ol> 2. 샘플 준비 및 고정 <ol><li> 마우스의 안락사. <ol><li> 같은 주사기에서 alfaxalone (1 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (0.5 ㎎ / ㎏)을 준비합니다. </li><li> 복강 alfaxalone과 자일 라진의 혼합물을 주입하고 마우스 3 분 의식이 될 수 있습니다. </li><li> 마취 마우스가 더 이상 진행하기 전에, 같은 꼬리 핀치로 통증 자극에 응답 할 때까지 기다립니다 없습니다. 주의 : 동물을 처리하기위한 적절한 제도적 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 로 transcardially 100 mL의 0.9 %의 염화나트륨 (PH 7.4-7.5) 솔루션 마우스를 관류1X PBS 중의 4 % 파라 포름 알데하이드 100 ㎖ (PFA) (PH 7.4) (14) 다음에 (100 U / ㎖)에게서 피를 뽑다 헤파린을 함유. 주의 : PFA 용액 독성이다. PFA 솔루션 및 모든 후속 처리의 제조는 흄 후드 및 개인 보호 장비를 실시해야합니다. </li><li> 마우스 머리를 잘라 피부를 열고, 작은 가위를 사용하여 눈 사이 두개골을 깰. </li><li> 작은, 곡선 집게를 사용하여 두개골 조각을 제거합니다. </li><li> 뇌 또는 원하는 장기를 꺼내. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 후 수정 4 % PFA 솔루션의 뇌와 장기를 품어. 참고 : 특정 지역 조직 지우기를 들어, 특정 지역을 해부 또는 조직 고정 후 조직을 잘라. 주의 : PFA 용액 독성이다. transcardial 관류 이후의 모든 마우스 처리는 흄 후드 및 개인 보호 장비를 실시해야합니다. </li></ol> 3. 하이드로 겔 모노머 주입 및 폴ymerization <ol><li> 부드러운 흔들림 12-24 시간 동안 39 ° C에서 A4P0 하이드로 단량체 용액 중의 고정 장기 인큐베이션. </li><li> 하이드로 조직 중합 단량체 풍의. <ol><li> 하이드로 단량체 용액 5 ㎖와 10 ㎖ 둥근 바닥 튜브에 시료를 옮긴다. 파라 필름으로 둥근 바닥 튜브의 상단을 감싸. </li><li> 1 분 동안 액체를 통해 질소를 버블 링하여 하이드로 겔 주입 전체 마우스 뇌 샘플이 들어있는 둥근 바닥 튜브에서 산소를 제거합니다. 신속하고 긴밀하게 샘플 함유 튜브를 닫습니다. </li></ol></li><li> 2 시간 동안 수조 (37 ° C)로 튜브를 옮긴다. </li><li> 초과 하이드로 젤을 제거하기 위해 0.1X PBS와 함께 간략하게 중합 샘플을 씻으십시오. 주의 : 히드로 겔 단량체는 독성이. , 하이드로 겔 단량체와 피부 접촉을 피하기 흄 후드와 얼굴 가리개, 실험실 코트, 장갑을 포함한 개인 보호 장비, 모든 절차를 수행합니다. 참고 : 중합 조직4 ℃에서 2 주 이상 0.1X PBS 포함 된 나트륨 아 지드에 저장 될 수있다. 주의 : 나트륨 아 지드와 높은 급성 독성이다. 얼굴 방패, 실험실 코트, 장갑을 포함, 흄 후드 및 개인 보호 장비로 모든 절차를 수행합니다. </li></ol> 4. 전기 영동 조직 지우기 (ETC) <ol><li> 조직 컨테이너에 중합 샘플을 전송하고 ETC 실에서 조직 컨테이너를 배치합니다. </li><li> peristatic 펌프를 사용하여 ETC 버퍼와 ETC 챔버를 입력합니다. </li><li> 전문 의약품 조건을 설정하고 등 실행 다음 설정을 사용합니다. <ol><li> 시간 (6.0 시간), 펌프 속도 (30 회전)를 실행, (1.5 A), 온도 (37 ° C) : 전체 기관에 대한 ETC 설정를 들어, 다음 설정을 사용합니다. </li><li> 시간 (2.0 시간), 펌프 속도 (30 회전)를 실행, 전류 (1.5 A), 온도 (37 ° C) : 1 - 2 mm 두께 마우스 뇌 조각에 대한 ETC 설정를 들어, 다음 설정을 사용합니다. </li></ol></li><li> 전송 t그는 0.1X PBS의 45 mL의 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 삭제. 튜브가 잠시 흔들릴 때 기포가 본 적이 때까지 0.1X PBS로 클리어 샘플을 여러 번 세척 (SDS의 완전한 제거를 확인합니다). </li></ol> ACT-처리 조직 5. Immunolabeling <ol><li> 마우스 뇌 전체 경우 : 1X PBS 6 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 항체 용액 3 mL의 부피에서 샘플을 인큐베이션 0.1 % 트리톤 X-100, 0.01 %의 아 지드 화 나트륨 (항체 희석 용액)을 희석 가벼운 흔들림 37 ° C에서 4 일 동안 티로신 수산화 (TH) 항체 1/500의 요인. 일이 끝의 항체 용액을 대체. <ol><li> (3) 45 mL를 0.1X의 PBS로 50 ML 원뿔 튜브에 샘플을 씻으 - 5 시간 버퍼마다 시간을 변경합니다. </li><li> 약한 진탕과 함께 37 ℃에서 4 일 동안 당나귀 항 - 토끼 이차 항체 488의 1/500 희석 인자 항체 희석 용액 3 mL의 부피에서 샘플을 인큐베이션. REPL2 일에 희석 된 항체 솔루션을 에이스. </li></ol></li><li> 2 mm 두께의 슬라이스 뇌 조직에 1- 들어 : 밤새 또는 최대 1 일 동안 37 ℃ 콜라겐 IV 형 항체 1/500 희석 팩터 항체 희석 용액의 0.5 내지 1 ㎖의 부피에서 샘플을 부화 가벼운 흔들림과 C를 °. <ol><li> 1 ~ 2 시간 동안 0.1X PBS의 12 ML의 볼륨과 15 ML 원뿔 튜브에 샘플을 씻으십시오. 버퍼마다 시간을 변경합니다. </li><li> 항 - 토끼 이차 항체 하룻밤 또는 가벼운 흔들림 37 ° C에서 최대 1 하루를 Cy3 공역에 대한 1/500의 희석 배수와 항체 희석 용액의 0.5 1 mL의 부피에 샘플을 품어. </li></ol></li><li> 3 0.1X에 PBS를 샘플을 씻으 - 5 시간; 버퍼마다 시간을 변경합니다. </li><li> 촬상 전에, 부드러운 진탕 실온에서 1 시간 동안 CUBIC 실장 용액 적절한 양의 시료를 배양한다. 신선한 CUBIC 마운트 솔루션으로 교체하고 추가로 1 시간 동안 배양. 노트: </b&gt; 항체의 76 형 (31) 단일 클론 항체 (14)를 포함하여, 마우스 ACT-처리 조직에서 잘 작동했다. 미리 라벨링 된 조직은 가공 조직 ACT 두 이상의 형광 색소의 immunolabeling와 결합 될 수있다. </li></ol> 조밀 한 조직의 6 Immunolabeling (PRESTO) <ol><li> C-PRESTO 참고 : C-PRESTO는 전체 고환, 전체 신장, 또는 더 큰 장기의 작은 부분 작은 크기의 샘플에 적합합니다. <ol><li> 1.5 ㎖의 튜브에 샘플을 이동 콜라겐 IV 형 항체 1/500 희석 팩터 항체 희석 용액 500 μL를 추가하고, 2 시간 동안 600 × g에서 튜브를 원심 분리. </li><li> 30 분 동안 600 × g에서 원심 분리하여 0.1X PBS와 스테인드 샘플을 씻으십시오. </li><li> 2 시간 동안 600 × g에서 Cy3에 접합 된 항 - 토끼 이차 항체와 원심 분리기에 대한 1/500의 희석 배수와 항체 희석 용액 500 μL를 추가합니다. </li><li> 0 스테인드 샘플을 씻으십시오.30 분 동안 600 × g에서 원심 분리하여 1X PBS. </li></ol></li><li> S-PRESTO 참고 : S-PRESTO 큰 조직에 적합합니다. <ol><li> 주사기 (30 mL의 부피)를 준비하고, 3 방향 밸브 (도 1a)에 연결한다. 고압 조건 (도 1b)에 대한 접착제 총 밸브를 붙인다. </li><li> 폐쇄 밸브 위치에 3 방 밸브에 연결된 주사기에 샘플을 이동. </li><li> 콜라겐 IV 형에 대한 항체의 1/500 희석 인자 항체 희석 용액 7 mL를 5 - 추가. 밸브를 개방하여 샘플에 항체 솔루션을 놓습니다. </li><li> 주입 / 출금 이동에 충분한 공간을 제공하기 위해 17 ㎖의 위치 주사기 피스톤을 설정한다. 이것은 개방 밸브 위치에서 수행 할 수 있습니다. 주사기 설정이 완료된 후, 3 방향 밸브를 닫는다. </li><li> 주사기 펌프에 샘플이 들어있는 주사기를 넣습니다. 10 ㎖ / 분 주입 / 인출 량과 4-에 주사기 펌프 상태 설정분 연속 사이클 모드 (그림 1C)에 시간을 일시 중지합니다. 주 : 상기 타겟 볼륨 (10 ㎖)하고 짧은 휴지 (4 분) 후 흐름의 방향이 변경 될 때까지 펌프 주입한다. </li><li> 실온 (그림 1 층)에서 24 시간 - 3 주사기 펌프를 실행합니다. </li><li> 3 방향 밸브를 열고 0.1X PBS와 솔루션을 교체합니다. </li><li> 주사기 펌프를 이용하여 1 시간 동안 0.1X PBS로 두 번마다 염색 된 샘플을 세척한다. </li><li> Cy3가 접합 된 항 - 토끼 이차 항체 (1/500 희석 인자)을 함유하는 항체의 희석 용액으로 바꾸고 3 주사기 펌프를 실행 - 24 시간. </li><li> 3 방향 밸브를 열고 0.1X PBS와 솔루션을 교체합니다. </li></ol></li><li> 촬상 전에, 부드러운 진탕 실온에서 1 시간 동안 CUBIC 실장 용액 적절한 양의 시료를 염색 배양한다. 신선한 CUBIC 마운트 솔루션으로 교체하고 추가로 1 시간 동안 배양. </li></ol> 7.maging <ol><li> 공 초점 접시에 레이블 조직을 배치하고 조직이 덮여 때까지 CUBIC 마운트 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 조직에 커버 슬립을 놓습니다. 10 배 목표 아래 이미지에 조직 (14)를 공 초점 현미경을 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

조직에 좋지 고정 또는 하이드로 겔 침수는 단백질의 손실과 조직의 청산 과정에서 조직의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 부드러운 흔들림 18 H - 전체 성인 마우스 뇌 12 겔 단량체 용액을 20 ㎖의 최소 부피에 침지 한 후, 하룻밤 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 배양한다. 뇌 슬라이스와 척수 등의 인체 조직을 포함하여 대규모 조직의 경우, 요구되는 하이드로 겔 단량체 용액에서 시간을 몸을 담글 확장했다. 조직 고정 및 폴리머 주입 단계가 분리되어 있기 때문에 ACT 프로토콜은 고정 된 조직의 청산에 쉽게 적용 할 수있다. 조직 클리어 한 후, 인체 조직은 여러 항체로 잘 염색 하였다. 법 개간 기술은 에탄올과 메탄올 등 알코올 고정 제와 호환되지 않습니다. 조직 - 겔 중합 단계도 클리어 가공 후의 양질 조직을 제조하는 것이 중요하다. 때문에산소 아크릴 아미드의 중합 반응을 억제이를 질소 가스 주입 시스템 하에서 조직 - 함유 용액을 탈기에 의해 제거되어야한다. 다르게는, 탈 산소 23 시간 동안 가열 블록 진공 챔버를 사용하여 실행될 수있다. 지우기 속도는 대부분의 성인 마우스 조직 하룻밤 ETC에 의해 삭제 될 수 등 기관의 크기, 지질 또는 ECM 섬유 단백질의 내용, 고정의 상태 등 다양한 요인에 따라 달라집니다. 그러나의 위험이 불필요한 과잉 소거 및 조직 부종; 따라서, 청소 시간의 차이가 중요한 고려 사항으로합니다. 조직 청산 조건은 경험적으로 결정되어야한다. 중요하게는, ECM의 내용이 클리어 조직의 외관에 영향을 미칠 수있다. ACT는 고밀도 단백질 섬유를 취소하지 않기 때문에 조직의 색상, 심지어 ETC 버퍼의 ACT 후, 흰색 또는 불투명 남아있다. 그러나, 이러한 기관은 RI 정합 용액에 침지하여 상기y를 투명하게되었다. 조직의 팽창 속도는 밀도 기관보다 더 큰 팽창 비율을 전시, 전자 재료 조직의 내용 및 뇌 소프트 기관에 의존 할 것으로 보인다. 증가 된 조직은 조직 청산 절차를 도움이 될 것입니다 붓기 때문에, ACT는 정기적으로 대부분의 경우 수성 버퍼를 증류하여 사용한다. 조직 부종 또는 과도 변형은 배아 같이 바람직되지 않는 경우에, 버퍼 함유 0.1X PBS는 고해상도 영상에 대해 적용 할 수있다. 또한 버퍼의 높은 염 농도는 조직의 수축을 일으킬 수 있다는 것을 주목해야한다. 행위 방법은 마우스 (14)의 전체 기관, 심지어 몸 전체를 명확히 할 수 있습니다. 그러나, 투명 조직의 깊은 조직 이미징은 특수 현미경과 목표를 필요로한다. 따라서, 두꺼운 뇌 조직 1 - 2 mm는 종래의 공 초점 현미경 이미징을위한 가장 효과적입니다. 라벨의 우리의 손에, 제거ACT-처리 조직에서 에드 항체는 항체 의존적이며, 다른 항체 라벨의 라운드는 권장되지 않습니다. 이러한 TH 및 GFAP 등 여러 항체는, 전체 뇌 14 immunolabeling 특히 잘했다. 한편, 이러한 Tuj1 Map2에 또는 일부 항체는 종종 조직의 표면을 표지. 이것은 스위치 (15)와 같은 다른 방법에 의해 개선 될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 있기 때문에, 조직이 조직 지우는 단계 동안 팽창 및 수축의 ACT 처리 된 조직에서 미세 단백질 구조를 유지하기 어려울 수도 있다는 것이다. 프레스토 기술은 조직 라벨링 다양한 기술에 적용 가능하다. 예를 들어, SeeDB 4 iDISCO 7로 미리 라벨링 조직을 사용하여 조직 투명한 방법으로, 조밀 한 조직의 immunolabeling는 주에 몇 일 이상 배양 기간이 필요합니다. 그러나 PRESTO 몇 시간 배양 시간을 단축 할 수 있고, 예를1-mm 두께의 치밀한 조직을 갖는 일 이내에 전체 프로세스의 완료를 nabling. PRESTO 두꺼운 깊은 라벨, 조밀 한 조직, 또는 해제 해제 두꺼운 조직의 효율성을 향상시킬 수 있습니다. PRESTO 테이블 탑 원심 분리기 나 주사기 펌프를 사용하며 특별한 장비를 필요로하지 않기 때문에, 일상적인 실험 방법과이 방법을 구현하기 위해 상대적으로 용이하다.

신경에서의 과제 중 하나는 신경 회로 배선 그대로 뇌 조직 내의 개별 세포의 가시화된다. 최근까지, 이러한 방법으로 뉴런 간의 연결을 보여주는 조직은 1) 직렬 절편 요구; 이러한 축삭 또는 단백질과 같은 특정 대상, 2) 분자 표지; 전산 등록 또는 2D 직렬 이미지 1의 정렬을 통해 전체 뇌의 3 차원 복원에 의한 3) 시각화. 이 단계에서는, 번잡 많은 시간이 필요하며, 신경 네트워크 매핑 대단히 어렵게 절편 라벨링 동안에 정보가 손실되기 쉽다. 그러나, 단면 처리없이 그대로 조직의 시각화 할 수있는 여러 방법이 개발되어왔다. 생물 조직은 조직 청산 기술 2-10에 의해 광학적으로 투명하게 할 수있다. 주요 방법 중 하나가 손상 조직 차례로 침지 액의 굴절률 차이를 감소시키는따라서 투명한 조직을 렌더링 깊은 구조의 관찰을 가능하게 본래 조직에 광 산란을 감소시킨다. 침지 용액의 일부 유형의 탈수 과정에서 빠른 형광 소광 될 소수성을 갖는다. 따라서, 이러한 방법은 시간이 11, 12의 긴 기간 동안 형광 이미징와 호환되지 않습니다. 대신 소수성 시약, 다른 방법은 생체 조직의 4,6,8의 구조적 정보와 형광을 유지하는 등 SeeDB 4 무서 리터 전자 (6)와 같은 조직 청산을위한 친수성 시약을 사용합니다. 그러나, 거대 분자는 항체를 포함 형 확산에 의해 손상 조직의 중심에 도달 할 수 없다. 따라서, 밀집된 조직의 깊은 영역에서 표적 분자의 미리 라벨링 기술적 도전이다. 최근 개발 조직 소거 방법에있어서, CLARITY 3 하이드로 겔 포함 생체 조직의 전아크릴 아마이드 형성 S 및 지질 도데 실 황산나트륨 (SDS) 함유 용액 하에서 전기 영동에 의해 제거된다. 샘플은 다음 3 광 산란을 감소시키는 정합 굴절률과 용액에 침지된다. 지질 제거 시스템은 나중에 고급 CLARITY (13)와 PACT (수동 명확하게 기술) (10)에 수정되었습니다. 중합 종료 후, 아크릴 사슬은 하이드로 겔을 형성하는 조직, 단백질 가교. 아크릴 아미드와 가교 할 수 없습니다 지질 구성 요소; 따라서, 지질은 SDS 함유 완충액에 따라 전기 영동에 의해 제거 될 수있다. 지질의 활성 제거를 통해 뇌 조직 현저 투명성 9 증가시킨다. 그러나 이러한 방법은 자유 확산에 의해 깊은 라벨의 불가능을 해결하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 두꺼운 조직의 가장 깊은 부분에 시약의 활성 전송에 대한 기술이 필요하다. CLARITY 조직의 청산과 깊은 조직을 수 있지만시각화, 그것은 쉽게 또는 빠르게 절차 아니다. 그것은 전체 마우스 뇌 7, 14을 취소 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 조직의 신속한 소거 생명 과학 연구 나 볼륨 진단용 기본적인 임상 실험실 설정 이러한 방법의 적용을 위해 필수적이다. 현재의 프로토콜은 압력을 이용한 배달 면역 염색에 의해 생체 조직 통관 이후의 단백질 검출을위한 간단한 방법을 제공한다. 이 촬상 방법과 조합에 의해 출원 된 많은 3 차원 데이터 처리 시스템의 고해상도 볼륨 촬상에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Lugen SCI&nbsp;</td><td>LGB-1175-4B</td><td>샘플 고정&nbsp;</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>Affymetrix</td><td>75820</td><td>하이드로겔 단량체 용액&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) 프로판] 디하이드로클로라이드</td><td>Wako Pure Chemical Industries&nbsp; &nbsp;</td><td>VA-044</td><td>하이드로겔 단량체 용액&nbsp;</td></tr><tr><td>붕산</td><td>Affymetrix</td><td>76324</td><td>ETC 완충액</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 황산염 (SDS)</td> <td>Affymetrix</td><td>18220</td><td>ETC 완충액</td></tr><tr><td>수산화 나트륨 펠릿</td><td>Junsei 화학 물질</td><td>1310-73-2</td><td>ETC 완충액</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>sc-2323A</td><td>면역 라벨링</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T8787</td><td>면역표지</td></tr><tr><td>: 아지드 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2002</td><td>면역 표지</td></tr>, <tr><td>티로신 하이드록실라제 (TH)</td> <td>밀리 포어</td><td>AB152</td><td>항체 / 면역 표지</td></tr><tr><td>: Alexa Fluor Cy3 당나귀 항 토끼 IgG (H + L)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>2 차 항체 / 면역 표지</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 항 토끼 IgG (H + L)</td> <td>생명 기술 - 분자 프로브</td><td>A21206</td><td>2차 항체/ 면역 라벨링</td></tr><tr><td>컨포칼 디쉬</td><td>SPL lifesciences</td><td>101350</td><td>이미징</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>이미징</td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>준세이 화학</td><td>31365-0301</td><td>CUBIC-마운트 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Affymetrix</td><td>23036</td><td>CUBIC 마운트 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>N,N,N',N' -tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122262</td><td>CUBIC 마운트 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>ECT 챔버</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10101</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>ECT 챔버 컨트롤러</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10201</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>온도 프로브</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12101</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>Peristatic 펌프</td><td>보정 더 긴 정밀 펌프 Co., Ltd</td><td>YZ1515X</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>버퍼 저장소</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C10401</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>티슈 용기&nbsp;</td><td>로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems, Inc.)</td><td>C12001</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>티슈 용기 1개용 용기 홀더</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12002</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>마우스 브레인 슬라이스 홀더</td><td>로고 바이오 시스템즈</td><td>C12004</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>전체 쥐 뇌 홀더</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12007</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>연동 펌프 튜빙</td><td>Logos Biosystems, Inc.</td><td>C12104</td><td>ETC 시스템</td></tr><tr><td>탁상용 원심 분리기</td><td>한일과학산업(주</td>) <td>MICRO 12</td><td>c-PRESTO</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>보정 장형 정밀 펌프 (주</td><td>) LSP02-1B</td><td>s-PRESTO</td></tr><tr><td>주사기(30mL)</td><td>한국백신(주)</td><td>KV-S30</td><td>S-PRESTO</td></tr><tr><td>3방향 마개</td><td>협성메디칼(주)</td><td>HS-T-01N</td><td>S-프레스토</td></tr></tbody></table>

act-presto : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 immunolabeling 방법

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

식별 및 장기 또는 세포 수준에서 몸 전체의 세부 조직의 탐구는 생물학의 근본적인 문제입니다. 천이 방법은 프로세스의 각 단계에서 정보의 손실이 발생 상당한 시간 및 3 차원 영상을 얻기위한 노력의 양, 본래 조직 절편 immunolabeling 포함 이미징 직렬 단면 조직을 필요로한다. 손상 조직 내에 고해상도 영상에 대한 최근 개발 된 방법에서, 분자의 특성은 단백질의 표지로 제한되었다. 그러나 장기 청산 현재 사용 가능한 프로토콜은 어려운 실험실에서 조직 정화 기술을 구현하고, 상당히 긴 처리 시간을 필요로한다. 우리는 최근에 신속하고 높은 재현성 프로토콜은 ACT-PRESTO로 명명 설립 (A 뽑은 C larity의 t echnique- P는 ressure의 r은 전자 fficient와의 테이블 t의를 ransfer을 의기 양양몇 시간 내에 조직 통관을 허용 오 rgans)에 고분자의. 또한, ACT-PRESTO은 기존의 방법과 빠른 immunolabeling을 가능하게하고 압력 또는 대류 흐름을 적용하여 조밀하게 형성, 두께 시편의 깊은 층으로 항체 침투를 가속화합니다. 우리는 전기를 사용하여 지방 제거에 의해 삭제하는 방법 조직을 준비하는 방법에 대해 설명하고, 방법을 압력 보조 전달하여 면역 염색. 프로토콜의 신속성과 일관성 차원 조직 학적 연구 볼륨 기반 진단 성능을 촉진한다.

ACT-조직 지우기 조직 지우기 영향을 미치는 하나의 중요한 요소는 조직 정착된다. PFA 고정 및 아크릴 아미드 주입이 프로토콜에 별도의 단계입니다. 조직 주입 하이드로 겔은 가교 고분자로 내인성 있지만 조직 - 겔 중합 단계 후 프리 A4P0 용액을 중합되지 않는다. 그러므로, 겔 조직 (그림 2A)의 외부를 형성 없습니다. 단백질과 아크릴 사이의 작은 가교의 ACT 절차의 결과는 CLARITY 프로토콜에 비해. 따라서, 하이드로 겔 조직 샘플보다 다공질이다. 이 기능은 지질의 빠른 추출 및 거대 분자의 확산을 가능하게한다. 2 시간 (그림 2B), 5 - - 마우스의 뇌 1- 충분히 1에서 삭제 된 두꺼운 mm 2의 섹션 ETC의 6 시간이 다하기에 충분했다전체 마우스 뇌 (그림 2C)의 learance. 하이드로 겔 매개 조직 청산은 ETC 단계 이후 조직의 확장을 유도하지만, 조직 반사 인덱스 매칭 솔루션의 원래 크기로 돌아왔다. 행위 과정에서 형성된 겔 조직 샘플은 다공성이며, 따라서, 작은 고분자 화합물을 효율적으로 침투 할 수있는 쉽고 (도 3)으로 확산. 티로신 수산화 (TH) 및 콜라겐 유형 IV 항체와 1 mm의 뇌 조각의 2 시간 배양 후 2 차 항체를 가진 이후 2 시간 배양는 500 μm의 깊이에서 도파민 신경 세포를 라벨에 충분했다 (그림 3) . PRESTO-조직 Immunolabeling 밀도 기관은 일반적으로 조직에 대한 항체의 영향을 침투 ECM 섬유의 높은 농도를 갖는다. 따라서, 항체는 penet배양 12 시간 후, 만 20 ~ 30 μm의 같은 신장 조직으로 조밀 한 조직에서의 깊이로 평가. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 깊은 조직에 시약의 전달, 즉 PRESTO (장기에 거대 분자의 효율적이고 안정적인 전송을 관련 압력) (그림 4)를 활성화 활성 고분자 침투 방법을 설계했습니다. 항체 솔루션, 테이블 탑 원심 분리기와 원심력 (600 XG)의 응용 프로그램 (원심 PRESTO, C-PRESTO) 크게 깊은 조직에 항체 전달을 개선한다 (그림 5)와 ACT-처리 신장 조직의 정적 배양에 비해. 우리가 조밀 한 조직에 C-PRESTO 절차를 적용 할 때, 배양 3 시간은 300 μm의 깊은 구조에 250 레이블을하기에 충분했다. 심각한 조직 손상없이 조직의 왜곡을 개선하기 위해, 또한, 주사기 펌프 (주사기 PRESTO S-PRESTO)와 대류를 제공하는 시스템을 설계 하였다. 이 프로세스는 유사 항체 PE 향상netration 수동 확산 (그림 5)에 비해. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig1.jpg"> 의 S-PRESTO 장치의 그림 1. 준비. A. 주사기 (30 mL) 및 삼방 콕. B. 3 방향 스톱 콕에 연결된 주사기에 붙어. C. 시료와 항체 용액을 함유 주사기 및 주사기 펌프에 배치 된 주사기. D. 주사기 펌프 및 작업 조건 설정. E.는 펌프 시험편으로 라벨링 시약을 함유하는 용액을 주입한다. 상기 지정된 볼륨은 펌핑 방향의 변화 도달 시간의 지정된 기간 이후에 용액을 인출하는 경우. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 마우스 뇌 그림 2. ACT 조직을 취소합니다. 중합 후 A., 무료 A4P0 솔루션은 중합되지 않습니다 조직 주입 하이드로 겔은 내생 고분자와 가교에 의해 겔화되어있다. 2 mm 두께의 뇌 조각에 B. 1은 1 삭제했다 - 2 시간, 반사 지수의 확장과 크기 복구의 범위는 (RI) -matching 솔루션을 기록 하였다. 완전히 분명 뇌에 충분한 ETC의 6 시간 한 - C. 전체 마우스 뇌의 두께는 약 0.8 cm, 5입니다. ETC 3 시간 후, 비 - 소거 조직 상당량이 있었다. ETC의 6 시간으로, 그러나, 전체 뇌의 청소가 발생했다. 전문 의약품 버퍼 ACT 후 조직의 색깔은 흰색 또는 불투명하다. RI 조정으로 조직을 투명하게. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig2large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig3.jpg"> ACT-해제 마우스 뇌 조직 그림 3. Immunolabeling. 콜라겐 유형 IV 및 항체로 염색 중뇌의 일부에 대한 항체로 염색 마우스 뇌 피질을 보여주는 ACT-처리 1-mm 마우스 뇌 조각의 이미지는 수산화 (TH)를 티로신합니다. 스케일 바, 100 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig4.jpg"> 그림 4. PRESTO의 immunolabeling 방법. 항체는 확산에 의해 치밀한 조직으로 침투 할 수 없습니다. PRESTO의 immunolabeling 방법은 적극적으로 거대 분자를 주입하고에 시약을 제공하도록 설계되었다조밀 한 조직. 표준 탁상용 원심 분리기 (원심 PRESTO, C-PRESTO)를 사용하여 원심력의 적용은 현저 항체의 전달을 용이. 항체 침투 향상 주사기 펌프 (주사기 PRESTO S-PRESTO)와 대류를 Appling. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54904/54904fig5.jpg"> ACT-삭제 조밀 한 조직의 5 PRESTO의 immunolabeling 그림. C-PRESTO 들어, 조직은 일차 및 이차 항체의 침투를 촉진하기 위하여 표준 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 3 시간 동안 600 × g으로 원심 분리 하였다. S-PRESTO 들어, 시린지 펌프는 항체를 제공하는데 사용되었다. 예컨대, 신장, 간 등의 마우스 기관, 콜라겐 IV 형으로 표시 하였다. 종래의 방법 중, 3 시간에 비해C- 또는 S-PRESTO는 현저하게 라벨의 깊이를 향상시킵니다. 50㎛의 (좌측) - 대조 시료 만 (40)의 깊이로 표시되어 있지만, 프레스토 샘플 (오른쪽)에서 350 μm의 또는 깊이 - 신장 및 간에서, Z 축 깊이 (300)에 도달한다. 의 3D 재구성 된 영상은 공 초점 현미경에 의해 수득되었다. 스케일 바, 100 μm의. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54904/54904fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

ACT-PRESTO (장기에 거대 분자의 활성 명확하게 기술 압력과 관련된 효율적이고 안정적인 전송) 수동 확산 또는 압력 보조 배달에 의해 삭제 조직으로, 신속하게 효율적으로하지만, 저렴한 조직 청소 및 신속한 항체 침투 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 조직의 넓은 범위는 다중 항체 클리어하여 immunolabeled 및 볼륨 - 이미징 될 수있다.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

이 절차의 전반적인 목표는 투명하고 손상되지 않은 조직을 얻고 면역 표지 방법을 사용하여 3차원 분자 정보를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 신경 세포 연결, 분자 분류 및 발달 중 구조적 변화와 같은 신경 과학 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 절단하지 않고 큰 표본의 세포 내 수준 분석을 명확하게 수행할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 A4P0 하이드로겔 단량체 용액에 고정된 장기를 섭씨 4도에서 12-24시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그런 다음 10ml의 둥근 바닥 튜브에 5ml의 하이드로겔 단량체 용액을 추가합니다. 그런 다음 마우스 뇌 샘플을 옮기고 튜브 상단을 파라필름으로 감쌉니다.다음으로, 하이드로겔이 주입된 뇌 샘플로 액체를 통해 질소를 1분 동안 거품을 냅니다. 튜브가 들어 있는 샘플을 빠르고 단단히 닫습니다. 튜브를 수조에 2시간 동안 옮깁니다.그 후, 하이드로겔의 점도를 확인한 후 중합된 시료를 0.1 X PBS로 짧게 세척하여 과도한 하이드로겔을 제거합니다. 이 단계에서는 중합된 샘플을 조직 용기로 옮깁니다. 그리고 티슈 용기를 ETC 챔버에 넣습니다.다음으로, 연동 펌프를 사용하여 ETC 챔버를 ETC 버퍼로 채웁니다. ETC 조건을 설정하고 켭니다. 1-2mm 두께의 뇌 절편은 2시간 이내에 제거됩니다.그리고 전체 뇌는 5-6시간 내에 충분히 맑아집니다. 그런 다음 샘플을 45 밀리리터의 0.1 X PBS가 있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. SDS가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 튜브를 잠시 흔들었을 때 기포가 보이지 않을 때까지 0.1 X PBS로 샘플을 여러 번 세척합니다.c-PRESTO를 수행하려면 작은 샘플을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 콜라겐 4형 항체에 대해 희석 계수가 1에서 500인 항체 희석 용액 500마이크로리터를 넣고 튜브를 600배 g으로 2시간 동안 원심분리합니다. 그 후, 염색된 시료를 0.1 X PBS로 600회 g의 600배로 30분간 원심분리하여 세척합니다.그런 다음 Cy3 conjugated Anti Rabbit 2차 항체에 대해 희석 계수가 1에서 500인 항체 희석 용액 500마이크로리터를 첨가하고 2시간 동안 600배 g을 원심분리합니다. 그 후, 염색된 시료를 0.1 X PBS로 600회 g에서 30분 동안 원심분리하여 세척합니다. 더 큰 조직에 대해 s-PRESTO를 수행하려면 닫힌 밸브 위치에서 주사기에 연결된 3방향 밸브로 샘플을 옮깁니다.콜라겐 4형 항체에 대해 1에서 500의 희석 계수를 가진 5-7ml의 항체 희석 용액을 추가합니다. 그런 다음 밸브를 열어 항체 용액을 샘플에 추가합니다. 다음으로, 열린 밸브 위치에서 주사기 피스톤을 17ml 위치로 설정하여 주입 인출 운동을 위한 충분한 공간을 제공합니다.그런 다음 주사기 설정이 완료된 후 3방향 밸브를 닫습니다. 샘플이 들어있는 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다. 주사기 펌프 조건을 분당 10ml의 주입 인출량과 연속 주기 모드에서 4분의 일시 중지 시간으로 설정합니다.그 후, 실온에서 3-24시간 동안 주사기 펌프를 작동시킵니다. 그런 다음 3방향 밸브를 열고 용액을 0.1 X PBS로 교체합니다. 주사기 펌프를 사용하여 매번 1시간 동안 0.1 X PBS로 염색된 샘플을 두 번 세척합니다.그런 다음 PBS를 Cy3 conjugated Anti Rabbit 2차 항체가 함유된 항체 희석 용액으로 대체하고 주사기 펌프를 3-24시간 동안 가동합니다. 그런 다음 3방향 밸브를 열고 용액을 0.1 X PBS로 교체하십시오. 이미징하기 전에 착색된 샘플을 적당량의 입방체 마운트 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.한 시간 후, 용액을 새로운 큐빅 마운트 용액으로 교체하고 추가로 한 시간 동안 배양합니다. 항체는 확산에 의해 조밀한 조직으로 침투할 수 없기 때문에 PRESTO 면역 표지 방법은 거대분자를 적극적으로 주입하고 시약을 조밀한 조직에 전달하도록 설계되었습니다. 표준 탁상용 원심분리기를 사용하여 원심력을 가하면 항체 전달이 현저하게 촉진되었습니다.주사기 펌프로 대류 흐름을 적용하면 항체 침투력도 향상되었습니다. s-PRESTO의 경우 항체를 전달하기 위해 주사기 펌프를 사용했습니다. 신장 및 간과 같은 마우스 장기는 콜라겐 유형 4로 표시되었습니다.기존 방법과 비교하여 3시간 동안 c 또는 s-PRESTO를 사용하면 라벨링 깊이가 현저히 향상됩니다. 신장과 간에서 z축의 깊이는 PRESTO 샘플에서 300-350마이크로미터 또는 그 깊이에 도달하는 반면, 대조군 샘플은 40-50마이크로미터 깊이로 라벨링됩니다. 일단 숙달되면 이러한 기술은 적절하게 수행되면 조직을 위해 하루 만에 명확하게 수행할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 조직 고정 하이드로겔 단량체 에멀젼 및 전기 영동 조직의 시간을 명확하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 역학 분석 및 여러 장기에 걸친 신경 소켓 식별과 같은 추가 질문에 답하기 위해 면역 표지와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의학 분야의 연구자들이 질병 진단을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 하이드로겔 임베딩 및 조직 중합을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 하이드로겔 단량체 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 주의를 기울여야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 세미 두께 뇌 조각의 이미지 찬란 표시된 셀에 신속하고 간단한 방법을 설명합니다. , 고정 깔끔히 및 광학 뇌 조직을 취소하여 우리는 표준 epifluorescent 또는 공촛점 이미지가 손상 신경 조직 내의 개별 세포의 연결 네트워크를 시각화하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

생체 전체 기관 이미징 내에서 조직 또는 치료 군간 형광 표지 된 화합물의 상대적 농도를 결정하기위한 빠른 방법이다. 더욱 노동 집약적 인 반면 반대로 정량적 형광 조직학, 표지 분자의 절대 조직 레벨의 정량을 허용한다.

사용 전의 VIVO 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

본 프로토콜은 (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT 조직 형질 전환 기법과 광시트 형광 현미경 이미징을 일상적으로 높은 처리량 프로토콜로 결합하여 수십 개의 사후 인간 뇌 절편의 신속하고 동시적인 광학 투명화, 다중 라운드 라벨링 및 3D 체적 재구성을 위한 단계별 절차를 제공합니다.

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging(대규모 인간 뇌 영상에서 광시트 형광 현미경을 위한 광학 투명화 및 라벨링)

이 프로토콜은 광시트 형광 현미경을 사용하여 정량적 전체 마운트 3차원 혈관 이미징을 위한 신속한 방법을 소개합니다. 이 방법의 효능은 전산 유체 역학을 통해 정량화된 혈역학적 힘과 함께 병아리 배아 모델의 인두 궁 동맥 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

정량적 연구를 위한 소동물 혈관 구조의 신속한 전체 마운트 고해상도 이미징

배우세요 ACT-PRESTO 조직 투명화 및 면역표지 기법을 통해 생쥐 장기의 3차원 분자 정보를 시각화하는 방법입니다. 이 기술은 신경과학 및 발달생물학 연구에서 세포 수준 분석을 가능하게 합니다.

ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

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