ACT-PRESTO : 생물 조직 지우기 및 볼륨 이미징을위한 Immunolabeling 방법

이 절차의 전반적인 목표는 투명하고 손상되지 않은 조직을 얻고 면역 표지 방법을 사용하여 3차원 분자 정보를 시각화하는 것입니다. 이 방법은 신경 세포 연결, 분자 분류 및 발달 중 구조적 변화와 같은 신경 과학 및 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 조직을 절단하지 않고 큰 표본의 세포 내 수준 분석을 명확하게 수행할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 A4P0 하이드로겔 단량체 용액에 고정된 장기를 섭씨 4도에서 12-24시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 그런 다음 10ml의 둥근 바닥 튜브에 5ml의 하이드로겔 단량체 용액을 추가합니다. 그런 다음 마우스 뇌 샘플을 옮기고 튜브 상단을 파라필름으로 감쌉니다.

다음으로, 하이드로겔이 주입된 뇌 샘플로 액체를 통해 질소를 1분 동안 거품을 냅니다. 튜브가 들어 있는 샘플을 빠르고 단단히 닫습니다. 튜브를 수조에 2시간 동안 옮깁니다.

그 후, 하이드로겔의 점도를 확인한 후 중합된 시료를 0.1 X PBS로 짧게 세척하여 과도한 하이드로겔을 제거합니다. 이 단계에서는 중합된 샘플을 조직 용기로 옮깁니다. 그리고 티슈 용기를 ETC 챔버에 넣습니다.

다음으로, 연동 펌프를 사용하여 ETC 챔버를 ETC 버퍼로 채웁니다. ETC 조건을 설정하고 켭니다. 1-2mm 두께의 뇌 절편은 2시간 이내에 제거됩니다.

그리고 전체 뇌는 5-6시간 내에 충분히 맑아집니다. 그런 다음 샘플을 45 밀리리터의 0.1 X PBS가 있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. SDS가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 튜브를 잠시 흔들었을 때 기포가 보이지 않을 때까지 0.1 X PBS로 샘플을 여러 번 세척합니다.

c-PRESTO를 수행하려면 작은 샘플을 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 콜라겐 4형 항체에 대해 희석 계수가 1에서 500인 항체 희석 용액 500마이크로리터를 넣고 튜브를 600배 g으로 2시간 동안 원심분리합니다. 그 후, 염색된 시료를 0.1 X PBS로 600회 g의 600배로 30분간 원심분리하여 세척합니다.

그런 다음 Cy3 conjugated Anti Rabbit 2차 항체에 대해 희석 계수가 1에서 500인 항체 희석 용액 500마이크로리터를 첨가하고 2시간 동안 600배 g을 원심분리합니다. 그 후, 염색된 시료를 0.1 X PBS로 600회 g에서 30분 동안 원심분리하여 세척합니다. 더 큰 조직에 대해 s-PRESTO를 수행하려면 닫힌 밸브 위치에서 주사기에 연결된 3방향 밸브로 샘플을 옮깁니다.

콜라겐 4형 항체에 대해 1에서 500의 희석 계수를 가진 5-7ml의 항체 희석 용액을 추가합니다. 그런 다음 밸브를 열어 항체 용액을 샘플에 추가합니다. 다음으로, 열린 밸브 위치에서 주사기 피스톤을 17ml 위치로 설정하여 주입 인출 운동을 위한 충분한 공간을 제공합니다.

그런 다음 주사기 설정이 완료된 후 3방향 밸브를 닫습니다. 샘플이 들어있는 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다. 주사기 펌프 조건을 분당 10ml의 주입 인출량과 연속 주기 모드에서 4분의 일시 중지 시간으로 설정합니다.

그 후, 실온에서 3-24시간 동안 주사기 펌프를 작동시킵니다. 그런 다음 3방향 밸브를 열고 용액을 0.1 X PBS로 교체합니다. 주사기 펌프를 사용하여 매번 1시간 동안 0.1 X PBS로 염색된 샘플을 두 번 세척합니다.

그런 다음 PBS를 Cy3 conjugated Anti Rabbit 2차 항체가 함유된 항체 희석 용액으로 대체하고 주사기 펌프를 3-24시간 동안 가동합니다. 그런 다음 3방향 밸브를 열고 용액을 0.1 X PBS로 교체하십시오. 이미징하기 전에 착색된 샘플을 적당량의 입방체 마운트 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.

한 시간 후, 용액을 새로운 큐빅 마운트 용액으로 교체하고 추가로 한 시간 동안 배양합니다. 항체는 확산에 의해 조밀한 조직으로 침투할 수 없기 때문에 PRESTO 면역 표지 방법은 거대분자를 적극적으로 주입하고 시약을 조밀한 조직에 전달하도록 설계되었습니다. 표준 탁상용 원심분리기를 사용하여 원심력을 가하면 항체 전달이 현저하게 촉진되었습니다.

주사기 펌프로 대류 흐름을 적용하면 항체 침투력도 향상되었습니다. s-PRESTO의 경우 항체를 전달하기 위해 주사기 펌프를 사용했습니다. 신장 및 간과 같은 마우스 장기는 콜라겐 유형 4로 표시되었습니다.

기존 방법과 비교하여 3시간 동안 c 또는 s-PRESTO를 사용하면 라벨링 깊이가 현저히 향상됩니다. 신장과 간에서 z축의 깊이는 PRESTO 샘플에서 300-350마이크로미터 또는 그 깊이에 도달하는 반면, 대조군 샘플은 40-50마이크로미터 깊이로 라벨링됩니다. 일단 숙달되면 이러한 기술은 적절하게 수행되면 조직을 위해 하루 만에 명확하게 수행할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 조직 고정 하이드로겔 단량체 에멀젼 및 전기 영동 조직의 시간을 명확하게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 역학 분석 및 여러 장기에 걸친 신경 소켓 식별과 같은 추가 질문에 답하기 위해 면역 표지와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 의학 분야의 연구자들이 질병 진단을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 하이드로겔 임베딩 및 조직 중합을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 하이드로겔 단량체 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 주의를 기울여야 한다는 것을 잊지 마십시오.