선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스

우리 그룹은 세포와 세포 외 기질 간의 상호 작용에 대해 연구합니다. 세포는 세포외 기질 요소를 생산할 수 있지만 저하시킬 수도 있습니다. 기질의 분해는 생리학적으로 발생할 수 있지만 신경 퇴행성 및 세포 종양의 침입과 같은 병리학적 과정에서도 발생할 수 있습니다.

세포 수준에서 우리는 매트릭스의 분해에 관여하는 액틴 기반 구조의 존재를 알 수 있습니다. 그리고 이러한 구조를 invadosomes라고 합니다. 인바도솜(Invadosome)은 정상 세포의 포도솜(podosome)과 암세포의 침습동물(invadopodia)을 포함하는 일반적인 용어입니다.

이 invadosome의 분해는 다양한 모양, 점, 응집체 및 장미로 자체 조직화 될 수 있습니다. 그리고 이 invadosome의 활성은 MMP2 및 MT1-MMP와 같은 금속단백분해효소에 의해 주도됩니다. 이것은 MMP2, MT1-MMP 커플이 1형 콜라겐 섬유에 의해 활성화되는 것은 그리 오래되지 않았습니다.

invadosomes의 활성을 연구하기 위해 고전적인 zymography in-situ assay가 사용되었습니다. 그러나 인바도솜에서 제1형 콜라겐 원섬유의 역할과 영향을 연구하기 위해 새로운 분석을 만들기로 결정했습니다. 이를 위해 우리는 젤라틴과 1형 콜라겐 섬유로 구성된 혼합 매트릭스를 만들었습니다.

이 영화의 첫 번째 부분에서 엘로이데 헨리엇은 이러한 종류의 매트릭스를 생성하는 방법을 보여줄 것입니다. 두 번째 부분에서는 Zakaria Ezzoukhry가 인바도솜의 형태, 형성 및 활성화에 대한 1형 콜라겐 원섬유의 영향을 측정할 수 있는 방법을 보여줍니다. 마지막 부분에서는 Julie Di Marino가 3D 콜라겐 침습 분석을 적용하는 방법을 보여줄 것입니다.

젤라틴과 1형 콜라겐 원섬유로 구성된 혼합 매트릭스를 준비하는 방법을 보여 드리겠습니다. 두 가지 유형의 혼합 매트릭스를 수행하겠습니다. 하나는 플루오레세인 젤라틴과 비플루오레세인 1형 콜라겐을 사용한 zymography in-situ 분석을 수행하는 것입니다.

그리고 또 다른 하나는 비플루오레세인 젤라틴과 표지된 콜라겐 피브릴을 사용하여 콜라겐 피브릴을 시각화할 수 있습니다. 젤라틴 매트릭스를 준비하려면 파라필름 조각에 20마이크로리터의 젤라틴 방울을 분취합니다. 각 물방울을 오토클레이브 유리 커버슬립으로 덮습니다.

실온에서 20분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 젤라틴 고정을 위해 PBS에서 0.5%글루타르알데히드의 40마이크로리터 방울을 분취합니다. 겸자를 사용하여 젤라틴으로 코팅된 커버슬립을 각 글루타르알데히드 방울에 옮깁니다.

실온에서 40분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 멀티웰 세포 배양 플레이트를 사용하여 각 웰에 500마이크로리터의 멸균 1X PBS를 채웁니다. 배양 기간이 끝나면 젤라틴 면이 위로 향하게 하여 각 커버슬립을 각 웰에 넣습니다.

커버슬립을 1X PBS로 각각 5분씩 두 번 세탁합니다. 이 단계에서 커버슬립은 실험용으로 사용하거나 나중에 사용하기 위해 보관할 수 있습니다. 피펫 : ml당 0.4 mgs, 콜라겐 하나, 튜브.

ml당 10마이크로그램의 최종 농도를 위해 형광 염료를 추가합니다. 튜브에 용액을 섞고 빛으로부터 보호된 실온에서 5분 동안 배양합니다. 1x DPBS로 최종 부피까지 희석하고 멀티웰 플레이트의 젤라틴 코팅된 커버슬립 위에 용액 500마이크로리터를 추가합니다.

콜라겐 중합을 위해 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 배양 후 과도한 콜라겐을 제거하십시오. 최종 부피 500마이크로리터에 대한 세포를 추가하고 고정하기 전에 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.

이러한 유형의 매트릭스는 피브로넥틴(fibronectin), 비트로넥틴(vitronectin) 또는 IV형 콜라겐과 같은 다른 매트릭스 요소로 변형될 수 있습니다. 저는 인바도솜의 마커인 Tks5를 사용하여 면역형광을 수행하는 방법과 콜라겐 유형 1 코팅 커버슬립에서 선형 인바도솜을 정량화하는 방법을 보여 드리겠습니다. 선형 침입체에 존재하는 세포의 수로 결과를 제시할 수 있지만 각 세포의 구조 수도 제시할 수 있습니다.

PBS에 500% 파라포름알데히드 500마이크로리터에 커버슬립을 10분 동안 고정합니다. 1x PBS로 2회 세척하고 1x PBS에 0.2%Triton X-100으로 세포를 10분 동안 투과시킵니다. 파라필름 조각에 1x PBS의 4%BSA에 있는 1차 항체 용액의 50마이크로리터 방울을 분취합니다.

각 커버슬립을 물방울에 놓습니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 40분 동안 배양합니다. 1x PBS로 커버슬립을 두 번 세척하고 2차 항체, 콜로이딘 및 Hoechst 염료로 커버슬립을 30분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.

배양 후 1x PBS로 두 번 세척한 다음 증류수를 사용하여 염분을 제거합니다. 중합 장착 매체가 있는 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 이미징하기 전에 슬라이드를 실온에서 밤새 건조시키십시오.

이미지 분석을 위해 컨포칼 현미경을 사용하여 actin과 Tks5의 이미지를 순차적으로 획득합니다. 세포당 선형 인바도솜의 크기와 수를 정량화하려면 ImageJ 소프트웨어와 제공된 매크로를 사용하십시오. 먼저 ImageJ에서 매크로를 실행하고 액틴 이미지를 엽니다.

그런 다음 Tks5 이미지를 엽니다. 임계값을 설정하고 매크로를 적용합니다. 분석된 결과는 두 개의 테이블에 나타납니다.

셀당 선형 인바도솜의 수와 셀에서 선형 인바도솜이 사용하는 백분율 면적과 같은 기타 정보는 요약 테이블에 있습니다. 각 선형 invadosome의 크기는 결과 테이블에 있습니다. 이미지를 정량화한 후 셀당 구조 수를 표시하여 결과를 제시할 수 있습니다.

그래서 제 부분에서는 3D에서 선형 침입체의 존재를 입증하는 방법을 채택합니다. 우리는 겔이 콜라겐 1 피브릴로만 구성되어 있다는 것을 깨달았으며, 이 분석은 콜라겐 1 컨텍스트에서 세포 침입을 평가하는 데 사용됩니다. ml당 2 mgs의 최종 농도로 얼음에 유형 1 콜라겐 용액을 준비합니다.

밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 형광 염료를 첨가합니다. 용액을 섞어 빛으로부터 보호하여 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 10x PBS를 추가합니다.

그런 다음 6.25 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 몰 수산화 나트륨을 추가합니다. 올바른 농도를 얻기 위해 멸균수를 추가하고 용액을 혼합합니다. Boyden 챔버 인서트를 멀티웰 세포 배양 접시에 넣습니다.

콜라겐 100마이크로리터를 각 삽입물에 한 용액씩 첨가합니다. 콜라겐 겔을 중합시키려면 섭씨 37도에서 1시간 동안 접시를 배양합니다. 각 웰에 혈청이 풍부한 세포 배양 배지를 추가하고 배지에 삽입물을 배치합니다.

씨 30, 콜라겐 젤 위에 혈청이 없는 미디어에 000개의 세포. 세포를 고정하려면 빈 우물에 4%파라포름알데히드 용액을 첨가하십시오. 콜라겐 젤을 건드리지 않고 삽입물에서 세포 배지를 제거합니다.

4%파라포름알데히드 용액이 있는 웰에 삽입물을 놓고 콜라겐 젤 위에 4%파라포름알데히드 용액을 추가로 추가합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다. 정착 후에, 4%paraformaldehyde 해결책을 제거하고 1x PBS로 세척하십시오.

세척 후에는 콜라겐 젤이 투명해져야 합니다. 이제 인서트는 면역 형광을 사용할 준비가 되었습니다. 먼저 인서트를 배출합니다.

그런 다음 인서트를 멀티웰 플레이트의 새 웰에 놓습니다. 세포를 투과화하려면 콜라겐 젤 위에 1X PBS에 0.2%Triton X-100 용액을 30분 동안 첨가합니다. 인서트를 배출합니다.

1X PBS로 세척하고 콜라겐 젤 위에 1차 항체 용액을 첨가하여 1시간 동안 빛으로부터 보호합니다. 1차 항체 용액을 제거하고 1X PBS로 세척한 다음 빛으로부터 보호된 1.5시간 동안 2차 항체 용액으로 콜라겐 겔을 배양합니다. 2차 항체 용액을 1X PBS로 세척합니다.

콜라겐 젤을 장착하기 위해 준비하려면 메스로 삽입 멤브레인을 자릅니다. 멤브레인에 부착된 콜라겐 젤을 유리 바닥 접시에 놓습니다. 젤의 상단이 접시의 바닥과 접촉하는 것이 중요합니다.

현미경 관찰을 위해 장착 매체와 상단에 커버슬립을 추가합니다. 이 분석을 통해 우리는 콜라겐 원 겔의 세포 침입에서 DDR1 수용체의 핵심 역할을 입증했습니다. 이 분석법은 세포 침입에 대한 약물의 효과를 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다.

우리의 다른 연구에서, 우리는 생리학적 확인에서 세포 외 기질의 새로운 요소, 즉 1형 콜라겐 섬유를 추가하는 것만으로도 인바도솜의 형태, 분자 구성 및 활성을 수정할 수 있음을 입증했습니다. 그래서 이 영화에 묘사된 다양한 분석을 사용하여 우리는 새로운 구조, 즉 선형 인바도솜(linear invadosome)이라고 명명한 새로운 인바도솜 조직의 존재를 입증했습니다. 복잡하고 더 많은 생리학적 매트릭스를 생성하여 세포 추가, 이동 및 침입과 관련된 새로운 경로를 식별할 수 있습니다.