최적화 된 프로토콜은 림프구에 해당 작용과 미토콘드리아 호흡을 분석하는

본 실험 절차의 전체적인 목표는 세포외 플럭스 분석법(extracellular flux assay)을 사용하여 림프구의 당분해 및 미토콘드리아 호흡을 정확하게 측정하는 것입니다. 이 방법은 활성화, 분화 또는 질병 과정에서 면역 세포에 어떤 대사 변화가 일어나는지와 같은 면역 대사 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 한 번에 90개 이상의 시료에 대한 대사 프로파일을 효율적으로 실시간 분석할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 림프구 대사에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 기능적 손상을 최소화하면서 플레이트에 추가하는 것이 필요한 비부착 세포를 포함한 다른 세포에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 림프구가 취약하며 기능과 생존력을 유지하기 위해 세심한 취급이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 실험 전날, extracellular flux analyzer의 센서 카트리지를 들어 올리고 유틸리티 플레이트의 각 웰에 200 µL의 보정액(calibrant solution)을 채우십시오.

다음으로 카트리지를 플레이트 위로 내려 센서를 보정액에 담근 후, 이산화탄소나 질소가 없는 37 °C 인큐베이터에서 카트리지를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침 96 웰 분석 플레이트의 각 웰에 25 µL의 접착 용액을 코팅하고 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양이 끝나면 접착 용액을 흡입하여 제거하고 각 웰을 200 µL의 멸균수로 두 번 세척합니다.

플레이트가 공기 중에서 건조되는 동안 50 mL 원뿔형 튜브 위에 70 micron 셀 스트레이너를 놓고, 수확한 장기를 스트레이너 위로 옮깁니다. 멸균된 3 mL 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 스트레이너 너머로 으깨며, 마쇄 과정 전반에 걸쳐 필요에 따라 MS 버퍼를 추가하여 필터와 장기가 촉촉한 상태를 유지하도록 합니다. 다음으로, 5~10 mL의 MS 버퍼로 스트레이너를 헹군 후, 생성된 세포 현탁액을 원심 분리합니다.

펠릿을 5 mL의 ACK 적혈구 용해 버퍼에 다시 현탁합니다. 얼음 위에서 5분간 둔 후, 10~20 mL의 MS 버퍼를 넣어 희석하고 세포를 다시 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 15 mL 원뿔형 튜브 위에 30 µm 세포 스트레이너를 올리고, 1 mL의 MS 버퍼로 스트레이너를 프라이밍합니다.

5 mL의 신선한 MS buffer로 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액을 스트레이너로 걸러 용해된 적혈구 응집물을 제거합니다. 신선한 MS buffer 4 mL를 추가하여 빈 용해 튜브를 헹구고, 세척액을 스트레이너에 통과시킵니다. 세포 수를 측정하고 extracellular flux assay에 적절한 수의 비장세포를 분주합니다.

그 다음 두 세포 집단을 모두 원심분리하여 펠릿화하고, 세포외 플럭스 분석(extracellular flux assay)용 비장세포 샘플은 얼음 위에서 5 mL의 RF 10 배지에 재현탁합니다. 비드 분리용 세포는 2~8 °C에서 지정된 배양 시간 동안 적절한 부피의 biotin 항체 칵테일, anti biotin 마이크로비드 및 MS 버퍼에 재현탁합니다. 두 번째 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고, 1 × 10⁸ cells당 500 µL의 신선한 MS 버퍼로 펠릿을 재현탁합니다.

다음으로 적절한 컬럼을 분리용 마그넷에 장착하고, 3 mL의 MS 버퍼로 컬럼을 프라이밍한 후 통과액은 버립니다. 멸균된 15 mL 원심 튜브를 컬럼 아래에 배치하고, 전체 세포 시료 부피를 컬럼에 로딩합니다. 그 후, 세포 배양 튜브를 3 mL의 신선한 MS 버퍼로 헹구어 세척액을 원심 튜브에 수집합니다.

마지막 용출액을 수집한 후, 튜브에 MS buffer를 추가하여 최종 부피를 15 milliliters로 맞추고 음성 선택 분리된 세포를 원심 분리합니다. 그런 다음 얼음 위에서 5 milliliters의 신선한 RF 10 medium에 펠릿을 재현탁합니다. 분리 후 3시간 이내에 모든 세포 샘플을 원심 분리하고, 펠릿을 해당 분석용 배지 5 milliliters에 재현탁하여 다시 한번 원심 분리합니다.

두 번째 원심분리가 끝나면, 웰당 세포의 최종 부피가 180 microliters가 되도록 신선한 분석 배지에서 적절한 실험 농도로 펠릿을 재현탁하고, 플레이트의 각 웰에 세포 180 microliters를 분주합니다. 세포를 37 degrees Celsius에서 25분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 원심분리하여 세포를 웰 바닥에 단단히 부착시킨 후, 플레이트를 다시 배양기로 옮깁니다.

30분 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 37 °C로 갓 준비한 관심 화합물을 extracellular flux analyzer 센서 카트리지의 적절한 인젝터 포트에 주입하고, 대조군 배경 및 비실험 포트에는 배지만 주입합니다. 주입이 완료된 카트리지를 인큐베이터로 되돌리고 extracellular flux 분석 프로그램을 설정합니다. 그다음 카트리지를 로드하고 프로그램을 시작하며, 안내에 따라 캘리브레이션이 끝난 후 캘리브런트 플레이트를 분석 플레이트로 교체합니다.

세포 외 플럭스 분석(extracellular flux assay)을 마친 후 단백질 함량 측정을 진행합니다. 모든 세포 집단의 90% 이상이 생존해 있으며, 림프구의 경우 98~99%의 순도가 관찰되었습니다. 각 세포 유형의 합류도(confluence)는 초기 도말 밀도와 상관관계가 있습니다.

용해물 단백질 농도는 세포 도말 밀도와 선형적으로 상관관계가 있으며, 이는 단백질 농도가 세포 외 플럭스 데이터를 정확하게 정규화하는 데 사용될 수 있음을 확인시켜 줍니다. 세포 수가 많을수록 측정된 산소 소비율이 더 높게 나타나며, 미토콘드리아 억제제에 대해 더 극적인 반응을 보입니다. T 세포와 비장세포에서는 도말 밀도가 높을수록 정규화된 산소 소비율 측정값이 유사하게 나타나는 반면, B 세포에서는 웰당 5 × 10⁵ 및 1.25 × 10⁵ 개의 세포에서 유사한 정규화된 산소 소비율 측정값이 나타납니다.

미토콘드리아 호흡 파라미터 또한 세포 도말 밀도와 선형적으로 상관관계가 있습니다. 또한, 낮은 양성자 누출은 기저 호흡의 대부분이 ATP 합성에 사용됨을 나타냅니다. 세포 도말 밀도가 높을수록 세포 외 산성화율이 높아지며 미토콘드리아 억제제에 대해 더 큰 반응을 보입니다.

당분해 매개변수는 세포 도말 밀도와 선형적으로 상관관계가 있으며, 고밀도 도말이 성공적인 당분해 스트레스 분석을 위해 가장 최적인 것으로 확인되었습니다. 포도당은 미토콘드리아 호흡을 약간 자극하며 이는 oligomycin에 의해 억제되는 반면, 2-DG는 산소 소비에 유의미한 영향을 미치지 않습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6~8시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 세포 외 플럭스 분석 전에 세포를 얼음에 보관하고 세포 수를 정확하게 측정하여 플레이팅하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에 미토콘드리아 전위 및 포도당 흡수 측정과 같은 다른 방법을 수행하여 세포의 대사 상태에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 림프구를 분리하고 세포 외 플럭스 분석을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.