효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

이 절차의 전반적인 목표는 아지드화물 함유 아미노산을 유전적으로 통합하여 항체 단편에 화학 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 것입니다. 이 방법은 단백질 변형, 엔지니어링 및 접합과 같은 화학 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 프로브 또는 배지를 간단한 혼합을 통해 단백질 또는 항체에 부위 특이적으로 도입할 수 있다는 것입니다.

플라스미드를 구축한 후, 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 마이크로리터당 8개의 세포에 2배의 10 농도로 E.Coli 균주 DH10-beta 20 마이크로리터에 각각 1 마이크로 리터를 첨가합니다. 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 혼합 용액 20마이크로리터를 깨끗한 큐벳에 넣습니다.

electroporation 기계를 25마이크로패럿 및 2.5킬로볼트로 설정합니다. 그런 다음 충격적인 챔버의 슬라이드에 큐벳을 삽입합니다. 큐벳이 챔버 전극과 단단히 접촉할 때까지 슬라이드를 챔버에 밀어 넣습니다.

전기천공법에서 신호음이 울릴 때까지 펄스 버튼을 한 번 누릅니다. 그런 다음 큐벳에 1mL SOC 배지를 빠르게 추가합니다. 그런 다음 혼합물을 시험관에 옮깁니다.

섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 배양합니다. 배양이 완료된 후, 형질전환된 대장균 세포를 적절한 항생제가 함유된 용원 배지 한천 플레이트에 펴 놓습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다.

플레이트 배양이 완료된 후, 항생제가 함유된 5ml의 LB 배지에 단일 형질전환된 콜로니를 접종합니다. 섭씨 37도에서 12시간 동안 흔들면서 배양합니다. 그런 다음 1차 배양물을 100마이크로그램/밀리리터 암피실린과 1밀리몰 AF가 있는 200밀리리터의 LB 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 흔들면서 배양합니다.

배양물이 550나노미터에서 0.8의 광학 밀도에 도달하면 1.6몰 아라비노스 2밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 12시간 동안 흔들면서 배양합니다. 외피가 완료될 때, 11, 5 분 동안 000 시간 g에 분리기분리에 의하여 세포를 가을걷이하십시오.

상등액을 버리고 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. 세포를 용해할 준비가 되면 새 원심분리기 튜브에 20ml의 파라플라스믹 용해 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 세포 용해물을 18, 000 번 g에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 그런 다음 400 마이크로 리터의 Ni-NTA 수지 현탁액을 첨가하십시오.

로테이터를 사용하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 튜브를 부드럽게 저어줍니다. 혼합이 완료된 후 현탁액을 폴리프로필렌 컬럼에 붓습니다. 5ml의 세척 버퍼로 수지를 세 번 세척합니다.

300마이크로리터의 용리 완충액으로 표적 항체를 용리합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 돌연변이 단백질의 농도를 결정합니다. 먼저 10밀리몰의 인산나트륨 이염기성 및 100밀리몰의 염화나트륨이 포함된 인산염 완충액에 HerFab-L177AF의 10마이크로몰 용액 10마이크로리터를 새 원심분리기 튜브에 추가합니다.

그런 다음 물에 Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne의 200 마이크로 몰 용액 20 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그런 다음 반응 용기를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 염색 촉진 사이클로에디션 반응이 섭씨 37도에서 6시간 동안 진행되도록 합니다.

반응이 완료되면 30마이크로리터의 샘플과 450마이크로리터의 인산염 완충액을 추가하여 원심 필터 스핀 컬럼에서 free Cy 5.5 염료를 세척합니다. 스핀 컬럼을 14, 000 회 g에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리하십시오. 플로우 스루(flow-through)를 폐기한 다음 정제된 샘플을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

정제된 라벨이 붙은 HerFab은 분석할 준비가 되지 않은 상태로 섭씨 4도에서 보관하십시오. 먼저 13마이크로리터의 7.8마이크로몰 정제 HerFab을 새 튜브에 추가합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 LDS 단백질 샘플 버퍼를 추가합니다.

혼합물을 섭씨 95도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 4-12%Bis-Tris SDS-PAGE 겔 카세트를 전기영동 셀에 부착합니다. 실행 중인 버퍼를 추가합니다.

다음으로, 접합 단백질 샘플을 사전 염색된 분자량 메이커에 로드합니다. 200볼트에서 35분 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 완료된 후 겔을 겔 문서화 및 분석 시스템으로 옮깁니다.

Cy 5.5를 스캔한 다음 시판되는 단백질 염색으로 젤을 염색합니다. 이 연구에서 항체 단편 Her-Fab은 부위 특이적으로 접합됩니다.이는 아지드 함유 아미노산을 단편에 통합한 다음 돌연변이 항체 단편을 변형된 사이클록틴과 반응시킴으로써 이루어집니다. SDS-PAGE 분석은 아지드 함유 아미노산을 포함하거나 포함하지 않고 발현된 돌연변이 단백질에 대해 수행됩니다.

보시다시피, 전장 항체 단편은 아미노산의 존재 하에서만 얻어졌다. 아미노산을 함유한 항체는 Cy 5.5 연결 아자디벤조사이클록틴 유도체 Cy 5.5와의 반응을 통해 접합을 평가하고 SDS-PAGE로 분석합니다. 형광 이미지는 돌연변이 항체 단편과 Cy 5.5의 접합을 보여주지만 대조군에서는 접합이 관찰되지 않았습니다.

적절하게 발현되고 아세틸페닐알라닌으로 단백질을 정제하면 단백질을 균주가 있는 프로브로 효율적으로 라벨링할 수 있습니다.라벨링 반응에는 추가 시약이 필요하지 않기 때문에 프로브를 단백질과 혼합하기만 하면 프로브를 타겟 단백질에 도입할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아지드를 함유한 아미노산을 유전적으로 통합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 현장 특이적으로 도입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.