Name: 효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 항체 단편에 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 삽입하고 SPAAC 반응을 이용하여 화학적 프로브를 효율적으로 도입하는 방법을. 이 기술은 단순한 혼합만으로 정밀한 단백질 표지가 가능하여 화학생물학 및 단백질 공학 연구에 활용됩니다.

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1. 플라스미드 건설 <ol><li> 그의 6 -tag와 대상 항체 유전자 (pBAD-HerFab-WT)을 표현하는 것 발현 플라스미드 (pBAD-HerFab - L177TAG)를 구축하고, 앰버 코돈과 류신-177의 코돈을 대체 (TAG) 27 사용 종래의 부위 특이 적 변이 법. 재료의 표를 참조하십시오. </li><li> 진화의 tRNA 티르와 아미노 아실 tRNA의 합성 (Aars의) 한 쌍의 유전자를 포함하는 또 다른 발현 플라스미드 (pEVOL-AFRS)를 구축합니다. UAAs의 효율적인 통합을 위해 특별히 디자인 된 플라스미드 벡터, pEVOL을 사용합니다. 상세한 정보 및 플라스미드 복제 프로토콜은 이전 보고서에 기재되어있다. (28) </li><li> 시중에서 판매하는 플라스미드 준비 키트를 사용하여 높은 품질의 플라스미드 DNA를 얻습니다. ~ 1.8의 280 분의 260 비율은 정제 된 DNA에 최적입니다. 필요한 경우, DNA의 순도를 확인하는 1 % 아가 로스 겔 전기 영동을 수행한다. </li></ol><ol><li> 전기 <ol><li> 20 μL 대장균 DH10β 균주에 pEVOL-AFRS 28 pBAD-HerFab - L177TAG 각각 1 μL의 DNA를 추가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 플라스미드를 함께 또는 독립적 인 반응으로 변형 될 수있다. </li><li> 0.1 cm 큐벳를 들어, 25 μF 2.5 kV의에 전기 설정을 설정합니다. </li><li> 충격적인 챔버의 슬라이드에 큐벳을 삽입합니다. 큐벳 챔버 전극에 닿을 때까지 챔버로 슬라이드를 밀어 넣습니다. </li><li> 일렉트로 기계 경고음까지 펄스 버튼을 눌러 한 번 펄스. </li><li> catabolite 억압 (SOC) 배지, 효모 추출물, 10 mM의 염화나트륨, 2.5 mM의 KCl을 (/ V W) 트립 톤, 0.5 % (/ V W), 10 밀리미터의 MgCl 2, 2 %를 함유하는 1 ㎖의 슈퍼 최적 국물, 20 mM의 글루코스를 추가 신속 큐벳 및 테스트 튜브에 혼합물을 옮긴다. 진탕하면서 37 ℃에서 1 시간 동안 세포를 인큐베이션.</li><li> (pEVOL-AFRS 각각 pBAD-HerFab - L177TAG을 선택하기위한 35 μg의 / ML의 클로람페니콜과 100 μg의 / ML의 암피실린) 적절한 항생제를 포함하는 판 한천 원성 국물 (LB)의 확산 형질 전환 된 대장균 세포. 12 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> 문화의 준비 <ol><li> 5 ㎖ LB 배지 포함하는 항생제의 단일 변환 식민지의 예방. 진탕 37 ° C에서 12 시간 동안 품어. </li></ol></li></ol> 3. 발현 및 HerFab-L177AF의 정제 <ol><li> HerFab - L177AF의 발현 <ol><li> 200 mL의 LB 배지에 암피실린을 함유하는 일차 배양 (5 ml)에 전송 (100 μg의 / mL) 및 AF (1 mM)을 진탕하면서 37 ℃에서 배양 하였다. 주 : 100 mM의 AF 스톡 용액 (10 ㎖)을 100 mM의 염산 (10 ㎖, 최종 부피)을 206 mg의 AF를 용해시켜 제조 하였다. </li><li> (16 1.6 M 아라비 노스의 2 mL를 넣고문화 로그 상 (OD 550 = 0.8, OD = 광학 밀도)에 도달 mM의 최종 농도). 진탕 30 ° C에서 12 시간 동안 품어. </li><li> 5 분 동안 11,000 XG에 원심 분리하여 수확 세포. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 펠렛을 동결. </li></ol></li><li> 세포 용해 <ol><li> 30 mM 트리스 (PH 8.0), 1 mM의 EDTA, 20 % 수 크로스, 0.2 ㎎ / ㎖의 리소자임을 함유하는 20 ㎖ 세포질 용해 완충액에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 37 ° C에서 1 시간 동안 혼합물을 배양한다. </li><li> 15 분 동안 4 ℃에서 18,000 × g으로의 세포 용 해물을 원심 분리기. 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다. </li></ol></li><li> 니켈 NTA 친 화성 크로마토 그래피 <ol><li> 각각의 원심 분리기 튜브 (200 mL의 문화 400 μL 수지)에 니켈 NTA 수지 서스펜션을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 부드럽게 섞는다. </li><li> 폴리 프로필렌 열로 현탁액을 붓고 5 mL로 세척 버퍼와 수지 세 번 씻어ffer의 50 mM의 NaH 2 PO 4 (PH 8.0), 20 mM의 이미 다졸, 및 300 mM의 NaCl을 함유하는. </li><li> 50 밀리미터에 NaH 2 PO 4 (PH 8.0), 250 mM의 이미 다졸, 및 300 mM의 NaCl을 함유하는 300 μL 용출 완충액 표적 항체를 용출시켰다. </li><li> 브래드 포드 단백질 분석 (29)에 의해 또는 280 nm에서 흡광도를 측정하여 돌연변이 단백질의 농도를 결정합니다. 흡광 계수 (2471 M -1 cm-1)에 대한 AF를 사용하여 단백질 흡광 계수 산출하여 280 nm에서 HerFab-L177AF 대한 흡광 계수 (75,866 M -1 cm-1)를 계산한다. 주 : HerFab의 아미노산 서열은 NCBI 웹 사이트에서 발견 (GI : 783282791 및 GI : 783282792)을 할 수있다. </li></ol></li></ol> 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로을 사용하여 알킨 프로브를 정화 HerFab-L177AF 4. 활용 (SPAAC) <ol><li> (H 2 O에 200 Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) 20 μL를 추가81, 10 mM의 나트륨 2 HPO 4 (pH 7.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 인산염 완충액 HerFab-L177AF 10 μL (10 μM 최종 농도)의 용액에 M, 최종 농도). 참고 : 대안, 다이 플루오르 cyclooctyne (DIFO) 및 시클로 [6.1.0] nonyne (BCN) 파생 상품은 같은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. </li><li> 스트레인 승진 고리 화 반응은 37 ℃에서 6 시간 동안 진행 할 수 있습니다. 감광성 프로브 (예, Cy5.5)를 사용하는 경우, 알루미늄 박과의 반응 용기 커버. </li><li> 5 단계에 따라 표시 HerFab을 정화. </li></ol> 레이블이 HerFab 5. 정제 <ol><li> 원심 필터 스핀 컬럼에 시료 500 μL를 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 4 ° C에서 14,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 폐기 관류 및 전송에 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 스핀 컬럼으로부터 샘플을 정제 하였다. </li><li> 대안 5.1 5.3 단계로서, 정수기를 수행동일한 완충액에 대해 투석하여 기. </li><li> 4 ° C에서 정제 된 라벨 HerFab를 저장합니다. </li></ol> 레이블이 HerFab 6. SDS-PAGE 분석 <ol><li> 106 mM 트리스 · 염산, 141 mM 트리스베이스 (PH 8.5), 2 % LDS, 10 % 글리세롤, 0.51 mM의 EDTA, 0.22 밀리미터의 Serva 블루 G250, 그리고 13 μL에 빨간색 0.175 mM의 페놀을 포함하는 5 μL LDS 단백질 샘플 버퍼를 추가 존재 (+) 또는 부재 HerFab (7.8 μM 또는 0.38 ㎎ / ㎖)을 표지 된 정제 된 (-) 2 μL 디티 오 트레이 톨 (DTT, 100 mM의 최종 농도). 10 분 동안 95 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 전기 영동 셀에 4-12% 비스 - 트리스 SDS-PAGE 겔 카세트를 부착하고 버퍼를 실행에 추가합니다. 공액 단백질 샘플 및 사전 스테인드 분자량 마커를로드합니다. 200 V. 35 분간 전기 영동을 수행 참고 : 형광의 사진 표백을 최소화하기 위해 전체 기간 동안 어둠 속에서 전기 영동 셀을 유지합니다. </li><li> 전기 영동 후, 전송형광 젤 스캐너에 젤, 그리고 적절한 파장에서 형광 방출을 검색. Cy5.5 들어 스캐너 소프트웨어에서 Cy5의 모드를 사용한다. </li><li> 상업 단백질 얼룩 젤을 얼룩. </li></ol>

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단백질에 비 천연 아미노산의 유전 결합 단백질 변성에 사용되는 다른 방법에 비해 여러 가지 장점을 갖는다. 중요한 장점 중 1-3 하나는 단백질의 종류는 일반적으로 적용됩니다. 원칙적으로, 표적 단백질 및 단백질의 표적 부위를 선택에는 제한이 없다. 그러나 UAA와 구조적 또는 기능적으로 중요한 잔기의 치환은 목적 단백질의 구조와 기능을 변화 될 수있다. 일반적으로, 용매에 노출되는 등 잔류와 상호 작용하지 않는 잔류 물은 UAAs의 통합을 위해 선택된다. 따라서, 고해상도의 결정 구조에서 구조적 정보 UAA 혼입 최적의 위치를 ​​선택하기 위해 사용된다. 30 UAAs의 혼입이 기술적으로 용이하고 간단한 돌연변이가 필요하기 때문에, 여러 사이트가 용이하게 목표 단백질의 원하는 기능을위한 최적의 잔기를 선택 스크리닝 할 수있다. &lt;/ P&gt; 이 프로토콜에서, AF는 유전자 항체 단편에 도입되어, 돌연변이 단편 SPAAC를 사용하여 부위...

대장균에서 P는 -methoxyphenylalanine의 유전 적 결합이보고 된 이후, 한 100 개 이상의 비 천연 아미노산 (UAAs가) 성공적으로 다양한 단백질에 통합되었습니다. 이들 중에서도 UAAs 1-3 bioorthogonal 관능기를 함유하는 아미노산은 광범위하게 연구하고, 최대 비율을 표현하고있다. UAAs에 사용되는 bioorthogonal 기능 그룹은 케톤, 4 지드, 5 알킨, 6 cyclooctyne, 7 테트라, 8 α, β 불포화 아미드, 9 노보 넨, 10 transcyclooctene, 11, 시클로 [6.1.0] -nonyne을 포함한다. 각 작용기는 장점과 단점이 있지만 (11), 아 지드 - 함유 아미노산이 가장 광범위 단백질 접합에 사용되어왔다. P -Azidophenylalanine (AF), 아지도 - 함유 아미노산 중 하나가 용이 가능하며, 그 혼입 efficiency이 우수합니다. 이 아미노산을 함유하는 변이체 단백질은 구리 촉매 고리 화하거나 SPAAC 의해 cyclooctynes ​​알킨과 반응 할 수있다. 12-20 최근 바이오 제약 산업에서 큰 관심을 받고있다. 항체 약물 접합체 (ADC)는 의한 인간 암 (21) 및 치료 대상 치료 능력에 유리한 치료 항체의 클래스 기타 질병. 50 개 이상의 ADC는 임상 시험에서 현재 및 수는 급속히 증가하고있다. ADC 제품 개발에 많은 요인 효과를 최대화하고 부작용을 최소화하기 위해 고려되어야한다. 이러한 요인 중 효율적이고 부위 특이 적 결합 반응은 항체와 공유 결합을 형성하고, 약물은 매우 중요하다. 공액 반응에 원하는 효율 및 특이성은 bioorthogonal에서 작용기와 결합함으로써 달성 될 수있다특이 항체로 혼입되는 비 천연 아미노산. 여기에 22 ~ 26, 우리에 대한 프로토콜을보고 사이트를-구체적으로 통합 항체 단편으로 AF 및 생화학 프로브 변이체 항체 단편 공역.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1입니다. Plasmid Construction</td></tr><tr><td>plasmid pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>원하는 위치에 amber stop codon (TAG)을 선택적으로 포함시킵니다. Ko, W. et al. 균주 촉진 아지드-알킨 순환첨가에 의한 효율적이고 부위 특이적인 항체 라벨링. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A. 및 Schultz, P. G. E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>알파 Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4">2. 배양 준비</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Electroporation</td></tr><tr><td>Micro pulser</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Micro pulser cuvette</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm 전극 갭, 50</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25g</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25g</td></tr><tr><td>한천</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500g</td></tr><tr><td>SOC 매체</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. HerFab-L177AF의 발현 및 정제</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Herfab-L177AF의 발현</strong</td></tr><tr><td>>p-azido-L-phenylalanine (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>염산, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.2 Cell Lysis</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염 이수화물, 99.5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>시그마</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피</td></tr><tr><td>Ni-NTA 수지</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25mL</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 컬럼</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/팩, 1mL 용량</td></tr><tr><td>Imidazole, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1kg</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1kg</td></tr><tr><td>염화나트륨, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1kg</td></tr><tr><td colspan="4"><강한>4. Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC)cy5.5-ADIBO&nbsp를 사용한 정제된 HerFab-L177AF와 Alkyne 프로브의 결합</td></tr><tr><td>;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5. 라벨링된 HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 원심 필터</td>의 정제 <td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pack, 500 &#956; L 용량</td></tr><tr><td colspan="4">6. 라벨링된 HerFab 및 형광 겔 스캐닝의 SDS-PAGE 분석</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%</td><td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 샘플 버퍼, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10mL</td></tr><tr><td>MES 러닝 버퍼</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE 젤</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12-well</td></tr><tr><td>Coomassie 브릴리언트 블루 R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 가변 모드 이미저</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

그들의 구조와 기능을 연구하는 단백질로 화학 프로브를 소개 할 수 현재 많은 화학 도구가 있습니다. 유용한 방법은 유 전적으로 bioorthogonal 관능기를 함유하는 천연 아미노산을 도입하여 단백질 결합이다. 이 보고서는 사이트 별 항체 결합에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 아 지드 - 함유 아미노산의 유전자 도입하고, 변형 촉진 지드 - 사이클로 알킨 (SPAAC)에 의한 접합 반응의 실험 세부 사항을 포함한다. 이 변형 촉진 반응은 생리적 pH와 온도에서 반응 분자의 단순한 혼합으로 진행하고, 구리 (I) 이온 및 구리 킬레이트 배위자와 같은 추가의 시약을 필요로하지 않는다. 따라서,이 방법은 일반적으로 단백질 결합 항체 약물 접합체 (ADC)는 개발에 유용 할 것입니다.

이 연구에서, 항체 단편은 부위 - 특이 적 단편에 아 지드 - 함유 아미노산을 도입하고, 변형 cyclooctyne로 돌연변이 된 항체 단편을 반응시켜 형광 물질과 결합 (도 1)이었다. HerFab은 AF가 지드 - 함유 아미노산으로 통합되었다하는 대상 항체 단편으로서 선택 하였다. AF로 교체 HerFab 잔사를 선택하려면 HerFab의 X 선 결정 구조 분석 하였다. 잔류 물을 30 중요한 요구 사항은 효율적인 결합 반응에 대한 그것의 결합 친화 감소 및 용매 접근성을 최소화하기 위해 항체 결합 부위에서 충분한 거리를 포함한다. 잔류 물이 잘 항체의 외부로 노출 및 항체 결합 부위에서 멀리 떨어져있는 두 개의 면역 글로불린 도메인의 인터페이스 근처에 위치하기 때문에 위치 177에서 류신은 괜찮은 후보이었다. 콘텐츠 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "&gt; 처음에, 그의 <sub...

여기에서는 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 통합한 후 균주 촉진 아지드-알킨 고리첨가(SPAAC)에 의해 아지드를 화학 프로브와 결합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 프로토콜을 제시합니다.

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

이 절차의 전반적인 목표는 아지드화물 함유 아미노산을 유전적으로 통합하여 항체 단편에 화학 프로브를 부위 특이적으로 도입하는 것입니다. 이 방법은 단백질 변형, 엔지니어링 및 접합과 같은 화학 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 프로브 또는 배지를 간단한 혼합을 통해 단백질 또는 항체에 부위 특이적으로 도입할 수 있다는 것입니다.플라스미드를 구축한 후, 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 마이크로리터당 8개의 세포에 2배의 10 농도로 E.Coli 균주 DH10-beta 20 마이크로리터에 각각 1 마이크로 리터를 첨가합니다. 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 섞습니다. 그런 다음 혼합 용액 20마이크로리터를 깨끗한 큐벳에 넣습니다.electroporation 기계를 25마이크로패럿 및 2.5킬로볼트로 설정합니다. 그런 다음 충격적인 챔버의 슬라이드에 큐벳을 삽입합니다. 큐벳이 챔버 전극과 단단히 접촉할 때까지 슬라이드를 챔버에 밀어 넣습니다.전기천공법에서 신호음이 울릴 때까지 펄스 버튼을 한 번 누릅니다. 그런 다음 큐벳에 1mL SOC 배지를 빠르게 추가합니다. 그런 다음 혼합물을 시험관에 옮깁니다.섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 배양합니다. 배양이 완료된 후, 형질전환된 대장균 세포를 적절한 항생제가 함유된 용원 배지 한천 플레이트에 펴 놓습니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 12시간 동안 배양합니다.플레이트 배양이 완료된 후, 항생제가 함유된 5ml의 LB 배지에 단일 형질전환된 콜로니를 접종합니다. 섭씨 37도에서 12시간 동안 흔들면서 배양합니다. 그런 다음 1차 배양물을 100마이크로그램/밀리리터 암피실린과 1밀리몰 AF가 있는 200밀리리터의 LB 배지로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 최소 3시간 동안 흔들면서 배양합니다.배양물이 550나노미터에서 0.8의 광학 밀도에 도달하면 1.6몰 아라비노스 2밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 12시간 동안 흔들면서 배양합니다. 외피가 완료될 때, 11, 5 분 동안 000 시간 g에 분리기분리에 의하여 세포를 가을걷이하십시오.상등액을 버리고 펠릿을 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. 세포를 용해할 준비가 되면 새 원심분리기 튜브에 20ml의 파라플라스믹 용해 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.다음으로, 세포 용해물을 18, 000 번 g에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다. 그런 다음 400 마이크로 리터의 Ni-NTA 수지 현탁액을 첨가하십시오.로테이터를 사용하여 섭씨 4도에서 1시간 동안 튜브를 부드럽게 저어줍니다. 혼합이 완료된 후 현탁액을 폴리프로필렌 컬럼에 붓습니다. 5ml의 세척 버퍼로 수지를 세 번 세척합니다.300마이크로리터의 용리 완충액으로 표적 항체를 용리합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 돌연변이 단백질의 농도를 결정합니다. 먼저 10밀리몰의 인산나트륨 이염기성 및 100밀리몰의 염화나트륨이 포함된 인산염 완충액에 HerFab-L177AF의 10마이크로몰 용액 10마이크로리터를 새 원심분리기 튜브에 추가합니다.그런 다음 물에 Cy 5.5 azadibenzocyclooctyne의 200 마이크로 몰 용액 20 마이크로 리터를 첨가하십시오. 그런 다음 반응 용기를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 염색 촉진 사이클로에디션 반응이 섭씨 37도에서 6시간 동안 진행되도록 합니다.반응이 완료되면 30마이크로리터의 샘플과 450마이크로리터의 인산염 완충액을 추가하여 원심 필터 스핀 컬럼에서 free Cy 5.5 염료를 세척합니다. 스핀 컬럼을 14, 000 회 g에서 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리하십시오. 플로우 스루(flow-through)를 폐기한 다음 정제된 샘플을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.정제된 라벨이 붙은 HerFab은 분석할 준비가 되지 않은 상태로 섭씨 4도에서 보관하십시오. 먼저 13마이크로리터의 7.8마이크로몰 정제 HerFab을 새 튜브에 추가합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 LDS 단백질 샘플 버퍼를 추가합니다.혼합물을 섭씨 95도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 4-12%Bis-Tris SDS-PAGE 겔 카세트를 전기영동 셀에 부착합니다. 실행 중인 버퍼를 추가합니다.다음으로, 접합 단백질 샘플을 사전 염색된 분자량 메이커에 로드합니다. 200볼트에서 35분 동안 겔 전기영동을 수행합니다. 전기영동이 완료된 후 겔을 겔 문서화 및 분석 시스템으로 옮깁니다.Cy 5.5를 스캔한 다음 시판되는 단백질 염색으로 젤을 염색합니다. 이 연구에서 항체 단편 Her-Fab은 부위 특이적으로 접합됩니다.이는 아지드 함유 아미노산을 단편에 통합한 다음 돌연변이 항체 단편을 변형된 사이클록틴과 반응시킴으로써 이루어집니다. SDS-PAGE 분석은 아지드 함유 아미노산을 포함하거나 포함하지 않고 발현된 돌연변이 단백질에 대해 수행됩니다.보시다시피, 전장 항체 단편은 아미노산의 존재 하에서만 얻어졌다. 아미노산을 함유한 항체는 Cy 5.5 연결 아자디벤조사이클록틴 유도체 Cy 5.5와의 반응을 통해 접합을 평가하고 SDS-PAGE로 분석합니다. 형광 이미지는 돌연변이 항체 단편과 Cy 5.5의 접합을 보여주지만 대조군에서는 접합이 관찰되지 않았습니다.적절하게 발현되고 아세틸페닐알라닌으로 단백질을 정제하면 단백질을 균주가 있는 프로브로 효율적으로 라벨링할 수 있습니다.라벨링 반응에는 추가 시약이 필요하지 않기 때문에 프로브를 단백질과 혼합하기만 하면 프로브를 타겟 단백질에 도입할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 아지드를 함유한 아미노산을 유전적으로 통합하여 항체 조각에 화학적 프로브를 현장 특이적으로 도입하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

아데노 바이러스 입자는 변칙적인 아미노산 아나로그의 azidohomoalanine 또는 azido 설탕 중 하나를 포함할 수 있도록...

Bioorthogonal 클릭 화학을 통해 바이러스성 표면 Chemoselective 변경

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

광안정 시아닌 염료는 올리고뉴클레오티드에 부착되어 에너지 전달에 의한 혼성화를 모니터링합니다.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

I 125 - 표지 지드의 합성 및 무도 클릭 반응을 이용 dibenzocyclooctyne (DBCO) - 기 - 컨쥬 게이트 13 나노 크기의 금 나노 입자의 방사성 표지에 대한 세부 절차를 설명한다.

를 사용하여 금 나노 입자의 효율적인 방사성 표지를위한 최적화 된 프로토콜<sup&gt; (125)</sup&gt; I-표시 아 지드 보철 그룹

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

항 체에 신의 cyclopropene 파생 통합 tetrazine 베어링 분자 생성 항 체 약물 어원이 같은 말의 사이트별, 신속 하 고 효율적인 결합 수 있습니다.

빠른 Bioorthogonal 반응을 통해 변화 항 체 의약품의 세대에 대 한 정식이 아닌 아미노산의 유전자 인코딩

이 프로토콜에서 포드는 phenyoxadiazolyl 메 틸 sulfone 기반 시 약 쓰이므로, 특히 항 체의 thiols 화물의 사이트 선택 첨부 파일에 대 한 종합을 설명 합니다. 또한, 합성 및 포드 베어링 bifunctional chelator 및 모델 항 체에의 활용의 설명 합니다.

합성 및 Bioconjugation의 Thiol 반응 시 약 사이트에 선택적으로의 창조에 대 한 수정 Immunoconjugates

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

배우세요 항체 단편에 아지드 함유 아미노산을 유전적으로 삽입하고 SPAAC 반응을 이용하여 화학적 프로브를 효율적으로 도입하는 방법을. 이 기술은 단순한 혼합만으로 정밀한 단백질 표지가 가능하여 화학생물학 및 단백질 공학 연구에 활용됩니다.

효율적이고 사이트 별 스트레인 승진 아 지드 - 알킨 사이클로에 의해 항체 라벨링

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